Summary
Nous avons synthétisé un analogue roman de pancratistatine comparables, avec activité anti-cancéreuse comme pancratistatine natif; intéressant, le traitement combinatoire avec le tamoxifène a abouti à une amélioration drastique dans l'induction de l'apoptose et l'autophagie par mitochondrial avec un effet minimal sur les fibroblastes non cancéreuses. Ainsi, JCTH-4 en combinaison avec le tamoxifène pourrait fournir un coffre-fort thérapie anti-cancéreuse.
Abstract
Le cancer du sein est l'un des cancers les plus fréquents chez les femmes en Amérique du Nord. De nombreux courants traitements anti-cancéreux, y compris les rayonnements ionisants, induire l'apoptose par une lésion de l'ADN. Malheureusement, ces traitements ne sont pas sélectifs pour les cellules cancéreuses et de produire une toxicité similaire dans les cellules normales. Nous avons signalé l'induction sélective de l'apoptose dans les cellules cancéreuses par le pancratistatine composé naturel (PST). Récemment, un roman PST analogique, un dérivé de C-1 de 7-acétoxyméthyl désoxypancratistatine (JCTH-4), a été produit par la synthèse de novo et elle présente une activité sélective comparables induisant l'apoptose dans plusieurs lignées cellulaires cancéreuses. Récemment, l'autophagie a été impliqué dans les tumeurs malignes à la fois comme pro-survie et les mécanismes de la mort pro-en réponse à la chimiothérapie. Le tamoxifène (TAM) a toujours montré l'induction de la pro-survie autophagie dans de nombreux cancers. Dans cette étude, l'efficacité de JCTH-4 seul et en combinaison avec TAM pour induire la mort cellulaire dans Cance maternelr (MCF7) et le neuroblastome (SH-SY5Y) des cellules a été évaluée. TAM seul induit l'autophagie, mais la mort des cellules insignifiant alors JCTH-4 seul causé une induction significative de l'apoptose avec une certaine induction de l'autophagie. Fait intéressant, le traitement combinatoire conduit à une augmentation drastique dans l'induction de l'apoptose et l'autophagie. Nous avons suivi en fonction du temps des changements morphologiques dans les cellules MCF7 subissant TAM-induite autophagie, JCTH-4-apoptose induite et l'autophagie et la mort cellulaire accélérée avec le traitement combinatoire en utilisant la microscopie time-lapse. Nous avons démontré ces composés à induire l'apoptose / autophagie par un ciblage mitochondrial dans ces cellules cancéreuses. Surtout, ces traitements n'ont pas affecté la survie de fibroblastes humains non cancéreuses. Ainsi, ces résultats indiquent que JCTH-4 en combinaison avec TAM pourrait être utilisée comme un coffre-fort et très puissant anti-cancer thérapie contre le cancer du sein et des cellules de neuroblastome.
Protocol
Introduction
L'apoptose, ou de type I la mort cellulaire programmée, est un processus physiologique qui peut fonctionner extrinsèquement, via la liaison d'un ligand à un récepteur de mort la mort, ou intrinsèquement. La voie intrinsèque de l'apoptose est déclenchée par le stress intracellulaire tels que les dommages de l'ADN et la dysfonction mitochondriale, ce qui conduit finalement à la perméabilisation de la mitochondrie, la dissipation du potentiel de membrane mitochondriale (MMP), la libération de facteurs apoptogènes de l'espace intermembranaire mitochondrial, et l'exécution subséquente de l'apoptose 1.
L'autophagie est un processus dans lequel une cellule pauses, se dégrade, et recycle ses propres composants intracellulaires, tout en maintenant l'intégrité des membranes de plasma, il est déclenché par différents types de stress cellulaires, y compris le stress oxydatif, l'hypoxie, les agrégats de protéines, une carence en nutriments, la privation de facteur de croissance, et organites endommagés 2. Dans les étapes initialesde ce processus, le matériel cytosolique est englouti par autophagosomes, double-membranées vésicules, qui fusionnent pour former vers les lysosomes autolysosomes. Message de fusion lysosomiale, matériaux cytosoliques précédemment prises par autophagosomes sont dégradés par les enzymes lysosomales 2. Vaste activation de cette voie donne la dégradation complète de composants intracellulaires qui peuvent entraîner la mort cellulaire autophagique ou de type II la mort cellulaire programmée 3.
Evasion de la mort cellulaire a été considéré comme l'un des caractéristiques du cancer 4. Le cancer est une maladie caractérisée par une croissance cellulaire incontrôlée et la prolifération 5. En particulier, le neuroblastome se pose de développer des cellules nerveuses du système nerveux sympathique de la crête neurale 6. Il est la tumeur solide la plus fréquente survenant chez les jeunes enfants, ce qui représente environ 9% de tous les cancers de l'enfant 7. Bien que beaucoup de progrès ont été réalisés à ce jour, cette maladie reste problématiquepour les deux spécialistes des sciences fondamentales et cliniciens. D'autre part, le cancer du sein est le cancer le plus fréquent parmi les femmes 8. Le tamoxifène (TAM) a été fréquemment utilisé pour la thérapie des cancers du sein hormono-dépendantes comme un récepteur des oestrogènes (ER) antagoniste 9. Néanmoins, d'autres rapports supplémentaires fournir la preuve de mécanismes indépendants de induction de l'apoptose par TAM. En particulier, TAM interagit avec le complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale (CRM) à sa flavine mononucléotide (FMN) du site 10.
PST est un composé naturel isolé de la plante Hymenocallis littoralis. Contrastant de nombreux agents chimiothérapeutiques actuellement en usage, il a été montré pour induire l'apoptose, d'une manière non-génotoxique, de manière sélective dans les différents types de cellules cancéreuses par l'intermédiaire mitochondrial 11-15. Toutefois, les travaux précliniques et cliniques a été entravée par sa disponibilité, il est présent à de très faibles quantités dans sa source naturelle et complicité de nombreuxtions fardeau de sa synthèse chimique. On a synthétisé et tamisé analogues synthétiques de 7-désoxypancratistatine et observée même activité anti-cancéreuse dans un dérivé C-1 acétoxyméthyle, JC-TH-acétate-4 (JCTH-4) 16. Nous avons maintenant en main un analogue synthétique de TVP avec un puissant effet anti-cancer d'activité. Sa synthèse a été normalisé et peut être adapté pour produire des quantités suffisantes pour le travail préclinique et clinique. Depuis PST naturel et TAM à la fois l'objectif de la mitochondrie, il serait intéressant d'étudier l'effet combiné d'un analogue synthétique de la TVP sur le cancer du sein humain et les cellules de neuroblastome en combinaison avec TAM.
Ici, nous rapportons la cytotoxicité sélective de JCTH-4 dans le neuroblastome humain (SH-SY5Y) et l'adénocarcinome du sein (MCF7) des cellules. JCTH-4 était capable d'induire l'apoptose dans les deux lignées de cellules par ciblage mitochondrial; JCTH-4 a causé la dissipation de la MMP et une augmentation des espèces réactives de l'oxygène (ROS) de production dans les régions isolées mitochondria partir de ces cellules cancéreuses. En outre, l'autophagie a été induite par JCTH-4 dans les cellules MCF7. Fait intéressant, l'ajout de TAM à JCTH-4 insulte amélioré les effets mentionnés ci-dessus de JCTH-4 en SH-SY5Y et des cellules MCF7. Les modifications morphologiques induites par JCTH-4 et TAM seul et en combinaison dans les cellules MCF7 ont été suivis par microscopie time-lapse de contraste de phase ou des images sur le terrain vives. Humains normaux fibroblastes foetaux (NFF) présentaient une diminution marquée de la sensibilité à JCTH-4 à la fois seul et en combinaison avec TAM. Par conséquent, ces observations suggèrent JCTH-4, seul et avec TAM, d'être un agent sûr et efficace contre le cancer du sein chimiothérapeutique et le neuroblastome.
Matériels et Méthodes
1. Culture cellulaire
- Croissez et la culture SH-SY5Y cellules de neuroblastome humain (ATCC, Cat. N ° CRL-2266, Manassas, VA, USA) avec Dulbecco Modified Eagles Medium F-12 HAM (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada) supplémenté avec 2 mM L-glutaminee, 10% de sérum de veau fœtal (FBS) et 10 mg / ml de gentamicine (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada). Maintenir les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Cultiver et de la culture des cellules humaines MCF7 (ATCC adénocarcinome du sein, Cat. N ° HTB-22, Manassas, VA, USA) en milieu RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Canada, Mississauga, ON, Canada) supplémenté avec 10% de FBS standard (Thermo scientifique, Waltham, MA) et 10 mg / ml de gentamicine (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada). Maintenir les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Croissez et la culture de l'apparence normale de fibroblastes humains fœtale (NFF) lignée cellulaire (Coriell Institute for Medical Research, No. de cat. AG04431B, Camden, New Jersey, USA) en milieu Dulbecco modifié Eagle, glycémie élevée (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA ) supplémenté avec 15% de FBS et 10 mg / ml de gentamicine (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada). Maintenir les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2.
2. Préparation des drogues
- Peser le tamoxifène (TAM) citrate de sel (Sigma-Aldrich, Cat. N ° T9262, Mississauga, ON, Canada) et le dissoudre dans du DMSO pour préparer une solution stock de 10 mM. Solution stock Conserver à -20 ° C jusqu'à son utilisation. Tous les véhicules de contrôle utilisées dans cette étude contenait du DMSO à moins de 0,5%.
- Répétez l'étape 2.1 à préparer une solution stock 1 mM dissous dans du DMSO de JC-TH-acétate-4 (JCTH-4), produite par synthèse à partir de bromobenzène chimioenzymatique comme décrit précédemment 16. Solution stock Conserver à -20 ° C jusqu'à son utilisation. Tous les véhicules de contrôle utilisées dans cette étude contenait du DMSO à moins de 0,5%.
3. Time-Lapse microscopie
- Plaque d'environ 2,0 x 10 5 cellules MCF7 dans 35 plats en verre de la culture mm de fond (MatTek Corporation, No. de cat. P35G-014-C, Ashland, MA, USA) dans des conditions stériles d'une armoire de classe II de biosécurité et de leur permettre de croître à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Lorsque les cellules atteignent la confluence 60 à 70%, les traiter avec 1 uM JCTH-4 à l'aide de 1 mmsolution stock dissous dans du DMSO et 10 TAM uM en utilisant une solution stock 10 mM dissous dans du DMSO, seul et en combinaison dans une armoire de classe II sur la biosécurité.
- Après traitement des cellules pendant 48 heures, les cellules placer dans une chambre chauffée à 37 ° C avec 5% de CO 2 sur une étape d'un Leica DMI6000 microscope à fluorescence (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne).
- Utilisation de LAS AF6000 logiciel, réglez le microscope à contraste de phase ou de prendre micrographies sur le terrain lumineux avec un grossissement 400x toutes les 5 minutes pendant 18 heures.
4. La coloration nucléaire
- Plaque d'environ 2,0 x 10 5 MCF7 ou SH-SY5Y dans chaque puits d'une plaque de fond 6 de la culture bien à l'écart du tissu dans une armoire de classe II de biosécurité et de leur permettre de croître à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Lorsque les cellules atteignent la confluence 60 à 70%, les traiter avec 1 uM JCTH-4 en utilisant une solution stock 1 mM dissous dans du DMSO et 10 TAM uM en utilisant une solution stock de 10 mM dissous dans du DMSO, à la foisseul et en combinaison dans une armoire de classe II sur la biosécurité.
- Incuber les cellules avec les traitements mentionnés ci-dessus à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 48 heures (SH-SY5Y) ou 72 heures (cellules MCF7).
- Après le traitement et l'incubation des cellules avec des médicaments, d'ajouter directement un colorant Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) pour les médias des cellules traitées à une concentration finale de 10 pM pour colorer les noyaux.
- Incuber les cellules avec le colorant Hoechst pendant 5 à 10 minutes à l'abri de la lumière.
- Placer la plaque sur la scène d'un Leica DM IRB microscope à fluorescence inversé (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne).
- Prenez micrographies fluorescentes et de la phase à un grossissement de 400x.
5. Annexine V Essai de liaison
- Plaque d'environ 5,0 x 10 5 cellules MCF7, SH-SY5Y, ou des cellules NFF dans 10 mL plaques de culture de tissus dans une armoire de classe II de biosécurité et de leur permettre de croître à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Wcellules atteignent la confluence de poule 60 à 70%, les traiter avec 1 uM JCTH-4 en utilisant une solution stock 1 mM dissous dans du DMSO et 10 TAM uM en utilisant une solution 10 mM de stock dissous dans du DMSO, à la fois seul et en combinaison dans une biosécurité de classe II armoire.
- Incuber les cellules avec les traitements mentionnés ci-dessus à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 48 heures (SH-SY5Y) ou 72 heures (MCF7 et les cellules NFF).
- Préparer l'annexine V tampon de liaison dans le trou DDH 2 O avec 10 mM HEPES, 10 mM NaOH, NaCl 140 mM, et 1 mM CaCl 2 à pH 7,6 et conserver à 4 ° C jusqu'à son utilisation.
- Après le traitement et l'incubation des cellules avec des médicaments, retirez le support des plaques contenant des cellules en suspension et le placer dans un séparé de 15 ml tube conique pour chaque groupe de traitement différent étiqueté avec le traitement approprié.
- Détacher les cellules adhérentes des plaques à l'aide de trypsine.
- Après que les cellules soulevé de la plaque à la suite de la trypsine, aspirer le support placés dans la conique 15 mltube de al à l'étape 5.4 et de le replacer dans leurs planches originales avec les cellules en suspension trypsine.
- Avec la charge pipette électronique et pipettes sérologiques, mélanger les médias avec la solution de cellules de la trypsine et placer ce mélange dans les 15 correspondants mL tubes coniques.
- Centrifuger les cellules à 600 xg pendant 5 minutes à 4 ° C, éliminer le surnageant de chaque tube, et remettre les cellules en PBS.
- Centrifuger les cellules à 600 xg pendant 5 minutes, retirer le surnageant de chaque tube, et remettre les cellules en microtubes marqués avec environ 50 à 70 pi de l'annexine V tampon de liaison.
- Ajouter annexine V AlexaFluor-488 (1:50) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada) et le colorant Hoechst à une concentration finale de 10 pM et incuber pendant 15 minutes à l'abri de la lumière.
- Après l'incubation, l'un des vortex des microtubes, ajouter 7 à 10 uL du mélange de cellules sur une lame de microscope, placer une lamelle overtop du mélange de cellules sur le Microscopediapositives e et prendre micrographies fluorescentes, à la fois l'annexine V et Hoechst images pour chaque point de vue, à un grossissement de 400x sur un Leica DM IRB inversé microscope à fluorescence (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne). Répétez l'opération pour chaque échantillon expérimental dans chacune des microtubes restants.
6. Sel de tétrazolium Soluble dans l'eau (WST-1) Dosage de la viabilité cellulaire
- Trypsiniser un confluent flacon T75 ou 10 cm boîte de culture tissulaire de MCF7, SH-SY5Y, ou des cellules NFF dans une armoire de classe II sur la biosécurité.
- Après que les cellules ont été levées, ajouter 5 à 10 ml de support à la trypsine et de placer la suspension cellulaire des médias dans un tube conique de 15 mL.
- Centrifuger les cellules à 600 xg pendant 5 minutes, placer le tube de retour dans le cabinet de biosécurité, éliminer le surnageant de chaque tube, et remettre les cellules en environ 1 à 3 mL de milieu en fonction de la taille culot cellulaire.
- Placer 10 ul de la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse, ajouter 10 ul de colorant bleu trypan (SIGMA-Aldrich, Mississauga, ON, Canada), et mélanger avec une micropipette.
- Chargez 10 pi de cellules en suspension bleu trypan sur un hémocytomètre (Hausser Scientific, USA), compter les cellules, et calculer la concentration de cellules de la suspension cellulaire dans les 15 premiers ml tube conique.
- Utilisation cette concentration pour déterminer le volume de la suspension cellulaire d'origine nécessaire pour créer des suspensions cellulaires dilué avec des concentrations de 1,5 x 10 5 cellules par millilitre pour MCF7 et SH-SY5Y et 5,0 x 10 4 cellules de NFF nécessaires pour le placage.
- Utilisez les suspensions cellulaires dilué à la plaque 15 x 10 3 MCF7 ou SH-SY5Y / bien ou 5,0 x 10 3 cellules NFF / puits en ajoutant 100 uL des suspensions cellulaires dilué dans chaque puits d'une plaque de 96 puits en bas de la culture des tissus clairs. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant une nuit.
- Traiter les cellules avec 1 uM JCTH-4 et 10 TAM uM à la fois seuls et en combinaison dans une armoire de classe II de biosécurité pour 72 heuress pour les cellules MCF7 et NFF, et pendant 48 heures pour SH-SY5Y.
- Après le traitement et l'incubation de la drogue, ajouter 10 ul de réactif WST-1 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) à chaque puits et incuber la plaque pendant 4 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Prenez les lectures d'absorbance à 450 nm sur un Wallac Victor 3 Counter 1420 Multilabel (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Canada) et de les exprimer en pourcentages des groupes de contrôle de solvants.
7. Tétraméthylrhodamine ester méthylique (TMRM) Coloration
- Placez une lamelle dans chaque puits d'une plaque de fond 6 de la culture bien à l'écart des tissus et la plaque de cellules MCF7 dans chaque puits d'une plaque de 6 puits de culture tissulaire dans une armoire de classe II sur la biosécurité. Leur permettre de croître à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Lorsque les cellules atteignent la confluence 60 à 70%, les traiter avec 1 uM JCTH-4 en utilisant une solution stock 1 mM dissous dans du DMSO et 10 TAM uM en utilisant une solution stock de 10 mM dissous dans du DMSO,à la fois seul et en combinaison dans une armoire de classe II sur la biosécurité.
- Incuber les cellules avec les traitements mentionnés ci-dessus à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 72 heures.
- Après le traitement et l'incubation des cellules avec des médicaments, d'ajouter directement un colorant Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) pour les médias des cellules traitées à une concentration finale de 10 pM pour colorer les noyaux ainsi que tétraméthylrhodamine ester méthylique (TMRM ) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada) à une concentration finale de 200 nM.
- Incuber les cellules avec les colorants à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 45 minutes abri de la lumière.
- Introduire à la pipette 8 ul de PBS médias ou sur une lame de microscope et de prendre une lamelle de la plaque de 6 puits et placez-le sur le dessus du support ou du PBS sur la lame de microscope avec les cellules tournés vers le bas avec des pincettes.
- Prenez micrographies fluorescentes, à la fois de Hoechst et de micrographies TMRM pour chaque point de vue, avec un Leica DM IRB microscope à fluorescence inversé (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne) à un grossissement de 400x.
8. Isolement des mitochondries
- Préparer environ 10 mL de tampon hypotonique (1 mM EDTA, 5 mM de Tris-HCl, 210 mM mannitol, 70 mM de saccharose, 10 uM Leu-pep, 10 uM Pep-A, et 100 uM PMSF) et le tampon de réaction et de garder les deux solutions sur la glace.
- Avec environ 8 à 10 confluentes T75 flacons de culture tissulaire de cellules SH-SY5Y, trypsiniser les cellules, ajouter du contenu multimédia pour neutraliser la trypsine, la collecte des suspensions cellulaires dans 50 ml tubes coniques, et centrifuger les tubes à 600 xg pendant 5 minutes à 4 ° C.
- Retirer les boulettes de cellules surnageant et remettre en suspension dans environ 10 à 20 ml de PBS froid, centrifuger les tubes à 600 xg pendant 5 minutes à 4 ° C, et répéter ce processus de lavage une fois.
- Eliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un tampon hypotonique froide. Homogénéiser les cellules manuellement avec un broyeur de tissus de verre et centrifuger le lysat cellulaire à 600 xg pendant 5 minutes à 4 ° C.
9. Amplex Rouge Assay
- Après avoir isolé les mitochondries des cellules, d'estimer la concentration de la protéine de l'échantillon de mitochondries isolées à l'aide d'une courbe standard de concentrations connues de BSA 1mg/mL (sérum albumine bovine) avec le dosage de la protéine BioRad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) .
- Utilisation de la concentration estimée de protéines de la solution des mitochondries isolées, calculer le volume de cette solution pour donner 20 mg de protéine. Introduire à la pipette ce volume dans chaque puits d'une opaque plaque de 96 puits pour charger 20 ug de protéines / puits.
- Remplir chaque puits de la plaque pour un volume total de 100 pi avec un tampon de réaction, traitement de la toxicomanie (avec une concentration finale de 1 uM JCTH-4, et / ou 10 uM TAM, ou 250 uM PQ (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON , Cperoxydase anada) utilisé comme contrôle positif), réactif Amplex Rouge à une concentration finale de 50 uM, et le raifort (HRP) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada) dans le rapport de 6 U/200 ul.
- Après une incubation de 2 heures, prendre des lectures de fluorescence lors de l'Ex. 560 nm et EM. 590 nm sur un spectrofluorimètre (SpectraMax XPS Gemini, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
10. Cellulaire préparation de lysat
- Cultiver des cellules MCF7 au confluent de 60 à 70% en plaques de 10 cm de culture de tissus.
- Traiter les cellules avec 1 uM JCTH-4 et 10 TAM uM seuls ou en combinaison pendant 72 heures avec environ 10 à 15 plaques par groupe de traitement.
- Préparer un tampon de lyse cellulaire (10 mM Tris HCl à pH 7,2, 5 mM de KCl, MgCl 2 1 mM, EGTA 1 mM, 1% de Triton-X-100, 10 uM Leu-pep, 10 uM Pep-A, et 100 uM PMSF ) et conserver à 4 ° C jusqu'à son utilisation.
- Mécaniquement déloger les cellules à partir des surfaces de la plaque avec un grattoir à cellules et de recueillir des cellules dans 50 marquéemL tubes coniques.
- Centrifuger les tubes à 600 xg pendant 5 minutes à 4 ° C, retirez les culots cellulaires surnageant et remettre en suspension dans environ 10 à 20 ml de PBS froid, centrifuger les tubes à 600 xg pendant 5 minutes à 4 ° C, et répéter ce processus de lavage une fois.
- Eliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un tampon de lyse cellulaire froid. Homogénéiser les cellules manuellement avec un broyeur de tissus de verre et centrifuger le lysat cellulaire à 600 xg pendant 5 minutes à 4 ° C.
- Rejeter les pastilles et stocker les lysats de cellules à -20 ° C jusqu'à utilisation.
11. Analyses Western Blot
- Déterminer la concentration en protéines de lysats cellulaires en utilisant le dosage de la protéine BioRad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Soumettre les échantillons de protéines pour SDS-PAGE et la protéine de transfert sur une membrane de nitrocellulose.
- Après le transfert, les membranes de blocs avec un w 5% / lait v TBST (Tris-Buffered Saline Tween-20) solution pendant 1 heure.
- Membranes de la sonde avec une fourmii-LC3 anticorps dirigé chez le lapin (1:500) (Novus Biologicals, No. de cat. NB100-2220, Littleton, CO, USA), ou un anticorps anti-β-actine a soulevé chez la souris (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc, No. de cat. sc-81178, Paso Robles, Californie, Etats-Unis) pendant une nuit à 4 ° C.
- Membranes Sujet à l'un de 15 minutes et deux 5 lavages minute dans TBST et incuber avec un anticorps de souris anti-(1:2000) ou un lapin anti-(1:2000) la peroxydase de raifort conjugué anticorps secondaire (Abcam, No. de cat. Ab6728 & ab6802, Cambridge, MA, USA) pendant 1 heure à 4 ° C.
- Membranes Sujet à trois mois consécutifs de lavages de 5 minutes en TBST et visualiser les bandes de protéines avec le réactif de chimiluminescence améliorée (Sigma-Aldrich, CPS160, Mississauga, ON, Canada).
- Effectué des analyses de densitométrie en utilisant le logiciel ImageJ.
12. Monodansylcadavérine (MDC) de coloration
- Placez une lamelle dans chaque puits d'une plaque de fond 6 de la culture bien à l'écart des tissus et la plaque de cellules MCF7 dans chaque puits d'un 6ainsi la plaque de fond clair culture tissulaire dans une armoire de classe II sur la biosécurité. Leur permettre de croître à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Lorsque les cellules atteignent la confluence 60 à 70%, les traiter avec 1 uM JCTH-4 en utilisant une solution stock 1 mM dissous dans du DMSO et 10 TAM uM en utilisant une solution 10 mM de stock dissous dans du DMSO, à la fois seul et en combinaison dans une biosécurité de classe II armoire.
- Incuber les cellules avec les traitements mentionnés ci-dessus à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 72 heures.
- Après le traitement et l'incubation des cellules avec des médicaments, ajouter directement monodansylcadavérine (MDC) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada) à une concentration finale de 0,1 mM dans chaque puits pendant 15 min.
- Incuber les cellules avec le colorant à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 15 minutes abri de la lumière.
- Introduire à la pipette 30 uL des médias ou du PBS sur une lame de microscope et de prendre une lamelle de la plaque de 6 puits et placez-le sur le dessus du support ou du PBS sur la lame de microscope avec l'installa cellulesvers le bas ng avec des pincettes.
- Prenez fluorescente MDC et micrographies de phase, pour chaque point de vue, avec un Leica DM IRB inversé microscope à fluorescence (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne) à un grossissement de 400x.
13. Les résultats représentatifs
Induction de l'apoptose sélective dans l'adénocarcinome du sein humain et les cellules de neuroblastome par JCTH-4: Amélioration de l'activité par TAM
L'induction de l'apoptose sélective a été montré dans diverses cellules cancéreuses par des catastrophes naturelles PST (Fig. 1a) 11-13. En raison de la faible disponibilité de la TVP, nous avons synthétisé des analogues de 7-désoxypancratistatine (JCTH-4, Fig. 1b) et les sélectionnés pour les même activité anti-cancéreuse dans l'adénocarcinome du sein humain (MCF7) et des cellules de neuroblastome (SH-SY5Y). Dans la première phase d'expérimentations, nous avons voulu pour surveiller les changements morphologiques au cours du temps après le traitement avec JCTH-4 et TAM seul et en combinaison dans la cellule MCF7s. Cellules MCF7 ont été suivis pendant 18 heures, comme on le voit dans la vidéo 1 produit par microscopie time-lapse avec des images à contraste de phase, avec un traitement au solvant (témoin) pendant 48 heures; ces cellules présentent pas de changements majeurs dans la morphologie. En revanche, après 48 heures de 1 uM JCTH-4 de traitement, ces cellules présentent des changements morphologiques associées à l'apoptose tels que le rétrécissement, blebbing, la formation de corps apoptotiques comme on le voit dans la vidéo 2. D'autre part, le traitement TAM seul dans les cellules MCF7 produit une morphologie très distincte, y compris des inclusions ponctuées indicatifs de autophagosomes associés à l'autophagie (vidéo 3). Très peu morphologie apoptotique a été observée et les cellules ont généralement montré la morphologie saine comparable à la commande solvant traité des cellules MCF7. Fait intéressant, dans la présence de TAM, l'induction d'apoptose par JCTH-4 a été considérablement améliorée, comme indiqué par la morphologie apoptotique accrue dans les cellules MCF7 après 48 heures que illustranted dans la vidéo 4.
Dans la deuxième phase d'expérimentations nous avons utilisé des colorants fluorescents pour évaluer l'induction de l'apoptose. Après 72 heures et 48 heures de 1 uM JCTH-4 dans le traitement MCF7 et SH-SY5Y respectivement, colorant Hoechst a été utilisé et pour surveiller la morphologie nucléaire. Les résultats ont indiqué condensée, noyaux brillamment colorés accompagnés par les corps apoptotiques dans MCF7 et SH-SY5Y, les indicatifs de l'induction d'apoptose (Fig. 2a, b). Traitement TAM seul a abouti à un minimum la morphologie apoptotique nucléaire dans MCF7 et SH-SY5Y; noyaux étaient grands, ronds, et faiblement colorés avec comparables au groupe témoin solvant (fig. 2a, b) Hoechst. En accord avec la vidéo 4, des noyaux de cellules MCF7 et SH-SY5Y affiché une augmentation marquée dans la morphologie apoptotique avec le traitement combiné après 72 heures (Fig. 2a, b).
Pour vérifier l'induction d'apoptose, les cellules ont été évalués pour pexternalisation hosphatidylserine, un marqueur de l'apoptose, par l'intermédiaire d'un test de liaison annexine V 17. Cellules MCF7 et SH-SY5Y traitées pendant 72 heures et 48 heures respectivement avec 1 uM JCTH-4 seul et en combinaison avec 10 uM TAM étaient positifs pour l'annexine V contraignant, indiqué par la fluorescence verte, confirmant l'induction de l'apoptose (figure 3a, b ). Pas évident de l'externalisation de phosphatidylsérine a été observée dans MCF7 et SH-SY5Y traitées avec TAM seul, ainsi que dans les cellules NFF traités avec tous les groupes mentionnés ci-dessus traitements après 72 heures (Fig. 3c). Par conséquent, JCTH-4 seul et en combinaison avec TAM induit sélectivement l'apoptose dans les cellules MCF7 et SH-SY5Y.
Pour quantifier l'effet de JCTH-4 seul et en combinaison avec TAM, un WST-1 test basé sur la colorimétrie pour la viabilité cellulaire, un indicateur du métabolisme cellulaire actif, a été réalisée sur des cellules MCF7 et NFF traité pendant 72 heures et SH-SY5Y traitées pendant 48 heures.Par rapport aux groupes témoins solvant, 1 uM JCTH-4 diminution du métabolisme cellulaire actif de plus de 50%, tandis que 10 uM TAM seul ne présentait aucune différence significative dans les deux MCF7 et SH-SY5Y (Fig. 4a, b). Il est intéressant dans MCF7 et SH-SY5Y, l'ajout de TAM à JCTH-4 insulte a entraîné une diminution synergique dans le métabolisme cellulaire. Cellules NFF étaient considérablement moins sensible à la fois JCTH-4 seul et JCTH-4 avec TAM (Fig. 4c). Par conséquent, JCTH-4 montre une activité sélective en synergie avec TAM dans MCF7 et SH-SY5Y.
Mitochondrial de JCTH-4
Pour voir si JCTH-4 est le ciblage des mitochondries pour induire l'apoptose potentiel de membrane mitochondriale dans les cellules entières et la génération de ROS dans les mitochondries isolées a été surveillée. Cellules MCF7 ont été traités pendant 72 heures et colorées avec TMRM. 1 uM JCTH-4 a diminué MMP, indiqué par la perte de fluorescence rouge (Fig. 5a). Cependant, avec eOutre e de 10 uM TAM, une plus grande dissipation de la MMP a été observée, tandis que 10 uM TAM seul n'avait aucun effet évident sur la MMP.
Comme augmente la production des ROS ont été associés à perméabilisation des membranes mitochondriales et induction de l'apoptose, la production de ROS a été évaluée avec Amplex colorant rouge dans les mitochondries isolées à partir de cellules SH-SY5Y traitées avec 1 uM JCTH-4 et 10 uM TAM, seul et en combinaison 18 -20. Lectures de fluorescence ont été exprimés en unités relatives de fluorescence (RFU). L'augmentation des ROS génération ont été observés avec JCTH-4 et TAM seul (Fig. 5b). Fait intéressant, le traitement combiné a abouti à une plus grande augmentation de la production de ROS. Un inducteur bien connu de la production de ROS dans les mitochondries, PQ, a été utilisé comme contrôle positif.
Induction de l'autophagie par JCTH-4 et TAM
Induction autophagique a été associé à l'insulte chimiothérapeutique par de nombreux composés différents
Au cours autophagie, associée aux microtubules chaîne légère de protéine 1 3 (LC3) normalement situé dans le cytosol (LC3-I), est lipidée avec phosphatidyléthanolamine et ensuite localisée aux membranes autophagosomal (LC3-II) 2. Pour vérifier l'induction de l'autophagie, les niveaux de LC3-II ont été évalués dans les cellules MCF7 traitées pendant 72 heures via des analyses western blot. 1 uM JCTH-4 induite légèrement la conversion de LC3-I LC3-II, tandis que 10 TAM uM une meilleure réponse autophagique (Fig.6b). Fait intéressant, le traitement combiné a entraîné dans la plus grande induction de l'autophagie, ce qui donne un LC3-II de LC3-I supérieur à 3. Par conséquent, ces résultats démontrent l'induction autophagique dans les cellules MCF7 par JCTH-4 et TAM seul et en combinaison, avec la plus grande réponse dans les cellules avec le traitement combiné.
Vidéo supplémentaire 1. La morphologie cellulaire de cellules MCF7 traitées avec témoin de solvant. Cellules MCF7 ont été suivis entre 48 et 66 heures après le traitement témoin solvant (DMSO) à l'aide de microscopie time-lapse avec des images à contraste de phase. Les cellules ont été maintenues à 37 ° C et 5% de CO 2. Les images ont été capturées à un grossissement de 400x. Cliquez ici pour visionner la vidéo .
Vidéo supplémentaire 2. L'induction de la morphologie cellulaire apoptotique dans les cellules MCF7 traitées avec JCTH-4. Cellules MCF7 ont été suivis entre 48 et 66 heures après le traitement d'esprith 1 uM JCTH-4 en utilisant la microscopie time-lapse avec des images à contraste de phase. Les cellules ont été maintenues à 37 ° C et 5% de CO 2. Les images ont été capturées à un grossissement de 400x. Cliquez ici pour visionner la vidéo .
Vidéo supplémentaire 3. L'induction de la morphologie cellulaire autophagique dans les cellules MCF7 traitées avec TAM. Cellules MCF7 ont été suivis entre 48 et 66 post-traitement heures avec 10 uM TAM utilisant la microscopie time-lapse avec des images à contraste de phase. Les cellules ont été maintenues à 37 ° C et 5% de CO 2. Les images ont été capturées à un grossissement de 400x. Cliquez ici pour visionner la vidéo .
Vidéo supplémentaire 4. Amélioration de la morphologie apoptotique par JCTH-4 avec TAM dans les cellules MCF7. Cellules MCF7 ont été suivis entre 48 et 66 heures après le traitement à la fois avec une uM JCTH-4 et 10 TAM uM en utilisant la microscopie time-lapse avec la phase contphotos Rast. Les cellules ont été maintenues à 37 ° C et 5% de CO 2. Les images ont été capturées à un grossissement de 400x. Cliquez ici pour visionner la vidéo .
Figure 1. Comparaison structurale de la TVP à une synthèse 7-désoxy analogique. La structure chimique (a) de pancratistatine (PST). La structure chimique (b) de JC-TH-acétate-4 (JCTH-4).
Figure 2. JCTH-4 induit la morphologie nucléaire apoptotique avec une activité accrue avec TAM. La morphologie nucléaire de (a) MCF7 et (b) SH-SY5Y traitées pendant 72 et 48 heures respectivement avec les concentrations indiquées de TAM et JCTH-4 tachés avec le colorant Hoechst. Les groupes témoins ont été traités avec un solvant (DMSO). Les images ont été prises à un grossissement de 400x sur un microscope à fluorescence. Échelle = 15 um.
Figure 3. JCTH-4 causes phosphatidylsérine externalisation, seuls ou en combinaison avec TAM sélectivement dans les cellules cancéreuses. Annexin liaison à la phosphatidylsérine externalisée V a été évalué afin de vérifier l'induction de l'induction de l'apoptose dans les (a) MCF7 (72 heures), (b) SH-SY5Y (48 heures), et (c) NFF (72 heures) les cellules traitées avec JCTH-4 et TAM aux concentrations indiquées. Les groupes témoins ont été traités avec un solvant (DMSO). Les images ont été prises à un grossissement de 400x sur un microscope à fluorescence. Échelle = 15 um.
TAM Figure 4. Améliore la viabilité diminution par JCTH-4 de manière sélective dans les cellules cancéreuses. Plaques à 96 puits ont été ensemencées wie (a) MCF7, (b) SH-SY5Y et (c) cellules NFF et traité avec JCTH-4 et TAM aux concentrations indiquées. MCF7 et les cellules NFF ont été traités pendant 72 heures et SH-SY5Y ont été traités pendant 48 heures. Poster un traitement médicamenteux et d'incubation, WST-1 réactif a été ajouté à chaque puits, et les lectures d'absorbance ont été prises à 450 nm et exprimée en pourcentage de la commande (DMSO). Les statistiques ont été effectuées en utilisant la version GraphPad Prism 5.0. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± écart-type à partir de quadruplicates 3 expériences indépendantes. MCF7: * p <0,001, ** p <0,0001 par rapport au contrôle; # p <0,05 par rapport à 1 uM JCTH-4; † p <0,0001 par rapport à 10 uM TAM. SH-SY5Y: * p <0,0005 par rapport au contrôle; # p <0,005 versus 1 uM JCTH-4; † p <0,005 par rapport à 10 uM TAM. NFF: * p <0,005 par rapport à 10 uM TAM + 1 uM JCTH-4 dans les cellules MCF7; # p <0,01 par rapport à 10 uM TAM + 1 uM JCTH-4 à SH-SY5Y.
Figure 5. JCTH-4 et acte TAM sur les mitochondries. (A) cellules MCF7 ont été cultivées sur des lamelles et traitées avec les concentrations indiquées de médicaments pendant 72 heures et colorées avec TMRM pour évaluer MMP. Les cellules du groupe de contrôle ont été traités avec un solvant (DMSO). Les images ont été capturées à un grossissement de 400x sur un microscope à fluorescence. La barre d'échelle = 15 um. (B) les mitochondries isolées à partir de cellules SH-SY5Y ont été traités avec JCTH-4 et TAM aux concentrations indiquées et la production de ROS a été évaluée avec le substrat Amplex Rouge en présence de peroxydase de raifort (HRP). Les cellules du groupe de contrôle ont été traités avec un solvant (DMSO). Le paraquat (PQ) a été utilisé à une concentration de 250 uM comme un contrôle positif. Lectures de fluorescence ont été obtenus après 2 heures de traitement à l'Ex. 560 nm et EM. 590 nm et exprimée en rapport fluorescencunités électroniques (RFU). Les statistiques ont été obtenues en utilisant la version GraphPad Prism 5.0. Les données sont représentatives de 3 expériences indépendantes avec des tendances similaires. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± écart-type de quadruplicates de 1 expérience indépendante. * P <0,05, ** p <0,005, *** p <0,001 par rapport au contrôle; # p <0,05 par rapport à 1 uM JCTH-4; † p TAM uM <0,05 par rapport à 10; @ p <0,05 par rapport 250 uM PQ.
Figure 6. TAM améliore l'induction de l'autophagie JCTH-4. (A) cellules MCF7 ont été cultivées sur des lamelles et soumis à l'insulte JCTH-4 et TAM aux concentrations indiquées pour 72 heures. Cellules du groupe contrôle ont été traités avec un solvant (DMSO). Post-traitement, les cellules MCF7 ont été colorés avec du MDC pour détecter vacuoles autophagiques. Les images ont été capturées à un grossissement de 400x sur un microscope à fluorescence. Échelle = 15 um. (b) les analyses de Western blot ont été réalisées pour LC3 et β-actine sur des lysats cellulaires de cellules MCF7 traitées avec les concentrations indiquées de médicaments pour 72 heures. Analyses densitométriques ont été exécutés en utilisant le logiciel ImageJ. Les statistiques ont été effectuées en utilisant la version GraphPad Prism 5.0. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± écart-type. * P <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0005 par rapport au contrôle; # p <0,001 versus 1 uM JCTH-4; † p <0,001 par rapport à 10 uM TAM.
Liste des abréviations.
| ER | récepteur des oestrogènes |
| FMN | mononucléotide flavine |
| JCTH-4 | JC-TH-acétate-4 |
| LC3 | associée aux microtubules chaîne légère de protéine 1 3 |
| MDC | monodansylcadavérine |
| MMP | mitochondrpotentiel de membrane ial |
| MRC | de la chaîne respiratoire mitochondriale |
| NFF | normale des fibroblastes du foetus humain |
| PQ | paraquat |
| PST | pancratistatine |
| RFU | unités relatives de fluorescence |
| ROS | espèces réactives de l'oxygène |
| TAM | tamoxifène |
| TMRM | l'ester méthylique de la tétraméthylrhodamine |
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Discussion
Composés PST et similaires ont été montré pour avoir des propriétés anticancéreuses 11-15,21. Nous avons précédemment rapporté PST naturelle de déstabiliser sélectivement les mitochondries dans les cellules cancéreuses, ce qui induit l'apoptose ainsi par la libération de facteurs de apoptogènes 12,14. Il est fort probable que JCTH-4 actes par le biais du même mécanisme; JCTH-4 a causé l'effondrement MMP dans les cellules MCF7 comme on le voit avec une coloration TMRM (Fig. 5a), et a augmenté la production de ROS dans les mitochondries isolées de cellules SH-SY5Y (Fig. 5b), indicative de la dysfonction mitochondriale. Ainsi, l'induction de l'apoptose par JCTH-4 est très probablement grâce à un ciblage mitochondrial dans les cellules cancéreuses.
De nombreuses différences existent entre les cellules non cancéreuses et le cancer qui pourraient servir de base à la sélectivité du cancer par JCTH-4. Les cellules cancéreuses sont très dépendants de la glycolyse et moins sur les mitochondries pour la production d'énergie, ce phénomène est appelé à uns l'effet Warburg 22. Cette activité métabolique dans les cellules cancéreuses conduit à une forte acidité dans le cytosol. Par conséquent, l'environnement acide cytosolique contribue hyperpolarisation des cellules cancéreuses mitochondries, qui a été liée à une capacité accrue d'envahir et de se soustraire à l'apoptose 23. Hyperpolariztion des mitochondries des cellules cancéreuses peuvent cependant rendre les cellules cancéreuses plus vulnérables à JCTH-4, une fois pris dans la cellule, JCTH-4 peut acquérir une charge positive grâce à la transformation enzymatique et peut être sélectivement repris dans la cellule du cancer mitochondries en raison de leur nature hyperpolarisé. En outre, un tableau des mitochondries protéines associées anti-apoptotiques ont été révélées fortement exprimé dans les cellules cancéreuses qui interdisent perméabilisation de la membrane mitochondriale et l'exécution subséquente de l'apoptose comme les protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 des protéines 24-26.
En présence de diverses formes de stress cellulaire, l'autophagie est déclenchéeune réponse pro-survie, qui permet aux cellules de survivre dans des conditions défavorables 2. Au cours de la stimulation de cette voie peut cependant conduire à une détérioration importante de l'état civil composants intracellulaires qui ont donné lieu à 3 de la mort cellulaire autophagique. Réponses autophagiques la fois la survie pro-et pro-mort ont été associés à l'insulte chimiothérapeutique 3. Une dysfonction mitochondriale par JCTH-4 conduisant à un stress oxydatif pourrait déclencher une réponse automatique par défaut autophagique. En effet nous avons pu observer une certaine induction autophagique avec l'apoptose avec JCTH-4 de traitement (fig. 2a, b 3a, b 6a, b). Bien que TAM a été bien établi comme un antagoniste ER ER dans les cellules positives pour le cancer du sein, il a été montré récemment à interagir avec les mitochondries, se liant au site FMN du complexe I 10. En outre, TAM est un inducteur bien connu de l'autophagie dans de nombreux types de cellules cancéreuses 3. En effet, TAM a fait provoquer une augmentation de la production de ROS dans isolé mitochondria (Fig. 5b). Toutefois, une telle interaction s'est avérée insuffisante pour provoquer l'effondrement MMP (Fig. 5a), mais suffisante pour induire une typique pro-survie réponse autophagique. Vaste induction autophagique a été observée lorsque JCTH-4 et TAM ont été utilisés en combinaison (Fig. 6a, b), qui a été accompagnée par une augmentation de la réponse cytotoxique (Fig. 4a, b), évocatrice d'une réponse pro-mort autophagique; néanmoins, les cellules cancéreuses finissent par mourir par apoptose à la suite de la perméabilisation des mitochondries et la libération du facteur apoptogène. Cette sensibilisation par TAM à JCTH-4 insulte peut être attribuée à l'augmentation de la production de ROS par TAM. Parce que les deux TAM et JCTH-4 sont capables de générer un stress oxydatif, la production combinatoire d'un tel stress avec les deux composés peuvent conduire à l'induction autophagique vaste donnant lieu à une réponse au détriment autophagique et / ou étendue perméabilisation mitochondriale et l'apoptose subséquente. Thle traitement est combiné n'affecte pas la viabilité des fibroblastes non cancéreuses (Fig. 4c). Ces résultats indiquent que JCTH-4 seul et en combinaison avec TAM peut être utilisé efficacement pour traiter le cancer du sein et le neuroblastome sans provoquer d'effets néfastes sur les cellules non cancéreuses.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les Chevaliers de Colomb chapitre 9671 (Windsor, Ontario), et un des IRSC Frederick Banting et Charles Best Bourse d'études supérieures du Canada décerné à Dennis Ma. Merci à Robert Hodge et Elizabeth Fidalgo da Silva pour leur aide avec la microscopie time-lapse. Merci à Katie Facecchia pour l'édition des vidéos microscopie time-lapse. Nous aimerions également remercier Sudipa Juin Chatterjee et Phillip Tremblay pour l'examen critique de ce manuscrit. Ce travail est dédié à la mémoire de Kevin Couvillon qui a perdu sa bataille contre le cancer en 2010.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | ATCC | CRL-2266 | |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM | Sigma-Aldrich | 51448C | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
| MCF7 cell line | ATCC | HTB-22 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R 0883 | |
| Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) | Coriell Institute for Medical Research | AG04431B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30022.01 | |
| Tamoxifen citrate salt | Sigma-Aldrich | T9262 | |
| 35 mm glass bottom culture dishes | MatTek Corp. | P35G-014-C | |
| Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| H–chst 33342 dye | Molecular Probes, Life Technologies | H3570 | |
| Leica DM IRB inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| Annexin V AlexaFluor-488 | Invitrogen | A13201 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| Haemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| WST-1 reagent | Roche Group | 11644807001 | |
| Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter | PerkinElmer, Inc. | 1420-011 | |
| Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) | GIBCO, by Life Technologies | T-668 | |
| Glass tissue grinder | Fisher Scientific | K8885300-0002 | |
| BioRad protein assay | Bio-Rad | 500-0001Bottom of Form | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Horseradish peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8125 | |
| SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | 3126666 | |
| Anti-LC3 antibody raised in rabbit | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6728 | |
| Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6802 | |
| Chemiluminescence peroxidase substrate | Sigma-Aldrich | CPS160 | |
| Monodansylcadaverine | Sigma-Aldrich | 30432 |
References
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