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Medicine

ヒト乳癌癌とタモキシフェンによる神経芽腫細胞の7 deoxypancratistatinの新規合成C-1アナログによるアポトーシスとオートファジー誘導の強化

doi: 10.3791/3586 Published: May 30, 2012

Summary

我々は、ネイティブpancratistatinと同等の抗癌活性をpancratistatinの新規アナログを合成した。興味深いことに、タモキシフェンとの組合せ治療は、非癌性線維芽細胞への影響を最小限に抑えながらミトコンドリア標的化によるアポトーシスとオートファジー誘導の大幅な向上が得られた。したがって、タモキシフェンとの併用でJCTH-4は、安全な抗がん治療を提供することができます。

Abstract

乳がんは、北米での女性の間で最も一般的な癌の一つです。電離放射線を含む多くの現在の抗がん治療、DNA損傷を介してアポトーシスを誘導する。残念ながら、このような治療は、がん細胞への非選択的であり、正常細胞で同様の毒性を生成します。我々は、天然化合物のpancratistatin(PST)で癌細胞のアポトーシスの選択的な誘導が報告されています。最近、小説PSTアナログ、7 deoxypancratistatin(JCTH-4)のC-1アセトキシメチル誘導体​​は、de novo合成によって生成され、それはいくつかの癌細胞株に匹敵する選択的なアポトーシス誘導活性を示すされました。最近、オートファジーは、化学療法に反応してプロの生存とプロ死のメカニズムの両方としての悪性腫瘍に関与している。タモキシフェン(TAM)は、常に多くのがんのプロ生存オートファジーの誘導を実証しています。本研究では、単独およびTAMとの組み合わせでJCTH-4の効果はヒト乳癌canceで細胞死を誘導するR(MCF7)及び神経芽細胞腫(SH-SY5Y)細胞を評価した。 TAM単独でオートファジーが、オートファジーのいくつかの誘導とアポトーシスの有意な誘導を引き起こしただけでJCTH-4に対し、重要でない細胞死を誘導した。興味深いことに、組合せ治療は、アポトーシスとオートファジー誘導の大幅な増加をもたらした。我々はTAM-誘発オートファジー、JCTH-4-誘導アポトーシスとオートファジーと、タイムラプス顕微鏡を用いて、組み合わせ治療で加速された細胞死を受けているMCF7細胞の経時的形態学的変化をモニターした。我々は、これらの癌細胞でミトコンドリア標的化することによってアポトーシス/オートファジーを誘導するために、これらの化合物を示している。重要なことは、これらの治療は、非癌性ヒト線維芽細胞の生存に影響を及ぼさなかった。したがって、これらの結果はJCTH-4 TAMとの組み合わせでは、乳がんと神経芽細胞腫細胞に対する安全かつ非常に強力な抗癌治療薬として使用することができることを示しています。

Protocol

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はじめに

アポトーシス、または私がプログラム細胞死を入力し、本質的に死の受容体に死のリガンドの結合、または経由して、外因性動作することができます生理的プロセスです。アポトーシスの内因性経路は、そのようなDNA損傷とミトコンドリアの機能不全のような細胞内ストレスによって開始され、これが最終的にミトコンドリアの膜電位のミトコンドリア、消費電力(MMP)の透過性、ミトコンドリアの膜間スペースからapoptogenic因子の放出、およびその後の実行につながるアポトーシス1。

オートファジーは、細胞休憩のプロセスで低下し、細胞膜の整合性を維持しながら、独自の細胞内成分をリサイクルし、それが酸化ストレス、低酸素、タンパク質凝集体は、栄養欠乏、成長因子の欠乏を含む細胞のストレスのタイプによって異なるトリガされ、損傷した細胞小器官2。初期段階でこのプロセスにより、細胞質材料はautolysosomesを形成するためにリソソームに融合させるオートファゴソーム、ダブルmembraned小胞に包まれています。リソソームの融合を投稿する、以前にオートファゴソームに取り込まれた細胞質の材料は、リソソーム酵素2で分解される。この経路の広範な活性化は、自己貪食性細胞死またはII型プログラム細胞死3につながる可能性があります細胞内成分の豊富な劣化をもたらします。

細胞死の回避は癌4の特徴の一つと考えられてきた。がんが制御されていない細胞の成長および増殖5によって特徴付けられる疾患である。特に、神経芽細胞腫では神経堤6から交感神経系の神経細胞の開発に起因しています。それはすべての小児がんの7の約9%を占め、幼児に発生する最も一般的な固形腫瘍である。多くの進歩がこれまでに行われているが、この病気は問題が残って基本的な科学者や臨床医の両方に適用されます。一方、乳がんは女性の8の間で最も一般的な癌である。タモキシフェン(TAM)が頻繁にエストロゲン受容体(ER)アンタゴニスト9とホルモン応答性乳癌の治療のために使用されています。それにもかかわらず、他のレポートでは、TAMによるアポトーシス誘導の追加の独立したメカニズムの証拠を提供しています。特に、TAMは、フラビンモノヌクレオチド(FMN)は、サイト10でミトコンドリア呼吸鎖(MRC)の複合体Iと相互作用する。

PSTはHymenocallisサキシマスオウノキの植物から単離された天然の化合物である。現在使用中の多くの化学療法から対照的な、それは選択的に11から15を標的とミトコンドリアを介した種々の癌細胞の種類では、非遺伝毒性の方法で、アポトーシスを誘導することが示されている。しかしながら、前臨床および臨床の仕事は、その利用可能性によって妨げられてきた、それは、その天然源と多くのcomplic非常に低い量で存在しているゴム手袋は、負担に化学合成します。我々は合成され、スクリーニング7 deoxypancratistatinの合成類似し、C-1アセトキシメチル誘導体、JC-TH-酢酸-4(JCTH-4)16に類似した抗癌作用を観察した。我々は今、手に強力な抗癌活性を有する合成のPSTのアナログを持っています。その合成は、標準化されており、前臨床および臨床研究のために十分な量を生成するためにスケールアップすることができます。以来、自然のPSTとTAMの両方をターゲットミトコンドリア、それはTAMとの組み合わせで、ヒト乳癌および神経芽細胞腫細胞にPSTの合成アナログの複合効果を調査するために興味深いものになるだろう。

ここで、我々はヒト神経芽細胞腫(SH-SY5Y)と乳房腺癌(MCF7)細胞内でJCTH-4の選択的な細胞毒性を報告します。 JCTH-4は、ミトコンドリアの標的化することによって両方の細胞株においてアポトーシスを誘導することができた。JCTH-4の原因となったMMPの消費電力と孤立mitochにおける活性酸素種の増加(ROS)産生これらの癌細胞からondria。さらに、オートファジーは、MCF7細胞でJCTH-4によって誘導された。興味深いことに、JCTH-4侮辱にTAMの追加は、SH-SY5YとMCF7細胞におけるJCTH-4の上記の効果を強化しました。 JCTH-4、TAM単独およびMCF7細胞内での組み合わせによって誘導される形態学的変化は、位相コントラストや明視野画像のタイムラプス顕微鏡を介してモニターした。正常ヒト胎児線維芽細胞(NFF)の両方単独でTAMとの組み合わせでJCTH-4への感度の著しい減少を示した。したがって、これらの観​​察結果は、乳癌および神経芽細胞腫に対する安全で有効な化学療法剤であるためには、TAMでJCTH-4、単独でお勧めします。

材料と方法

1。細胞培養

  1. 成長および2mMを添加したダルベッコ改変イーグル培地F-12 HAM(Sigma-Aldrich社、ミシサガ、ON、カナダ)との文化は、SH-SY5Yヒト神経芽細胞腫細胞(ATCC、カタログ番号CRL-2266、マナサス、バージニア州、米国) L-グルタミンE、10%ウシ胎児血清(FBS)および10 mg / mlのゲンタマイシン(GIBCO BRL、VWR、ミシサガ、ON、カナダ)。 37℃、5%CO 2で細胞を維持します。
  2. 10%FBS標準(サーモを補充したRPMI-1640培地(Sigma-Aldrich社、カナダ、ミシサガ、ON、カナダ)で成長し、文化MCF7ヒト乳癌腺癌細胞(ATCC、カタログ番号HTB-22、マナッサス、バージニア州、米国)科学的、ウォルサム、MA)および10 mg / mLのゲンタマイシン(GIBCO BRL、VWR、ミシサガ、ON、カナダ)。 37℃、5%CO 2で細胞を維持します。
  3. ダルベッコ変法イーグル培地、高グルコース(サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、アメリカでは明らかに正常なヒト胎児線維芽細胞(NFF)セルライン(医学研究のための医学研究所、カタログ番号AG04431B、カムデン、ニュージャージー州、米国)の成長と文化)15%FBSおよび10 mg / mLのゲンタマイシン(GIBCO BRL、VWR、ミシサガ、ON、カナダ)を添加した。 37℃、5%CO 2で細胞を維持します。

2。薬剤の準備

  1. タモキシフェンを秤量(TAM)クエン酸塩(Sigma-Aldrich社、カタログ番号T9262、ミシサガ、ON、カナダ)と10 mMストック溶液を調製し、DMSOで溶解する。使用するまで-20℃で保存原液。本研究で使用されているすべての車両のコントロールは、0.5%未満でDMSOが含まれていました。
  2. 前述の16としてブロモベンゼンからの化学酵素合成によって生成されたJC-TH-酢酸-4(JCTH-4)のDMSOに溶解し1mMのストック溶液を調製するために2.1を繰り返します。使用するまで-20℃で保存原液。本研究で使用されているすべての車両のコントロールは、0.5%未満でDMSOが含まれていました。

3。タイムラプス顕微鏡

  1. クラスIIバイオセーフティキャビネットの滅菌条件下で35 mmのガラス底の培養皿のプレート約2.0×10 5 MCF7細胞(マテック株式会社、カタログ番号P35G-014-C、アッシュランド、マサチューセッツ州、米国)とそれらで成長することができます37℃、5%CO 2。
  2. 細胞が60〜70%コンフルエントに達したときに、1mMのを使用して、1μMJCTH-4でそれらを扱うDMSO単独でとの組み合わせでクラスIIバイオセーフティキャビネット内に、DMSOに溶解した10mMのストック溶液を用いて、10μMのTAMに溶解しストック溶液。
  3. 48時間、37℃で加熱したチャンバー内で場所細胞°CライカDMI6000蛍光顕微鏡のステージ(ライカマイクロシステムズ、ヴェッツラー、ドイツ)の5%CO 2である。のための細胞の治療後
  4. LAS AF6000ソフトウェアを使用して、400倍の倍率で18時間5分ごとに位相コントラストや明視野顕微鏡写真を取るために顕微鏡を設定します。

4。核染色

  1. プレート約2.0×10 5 MCF7またはSH-SY5Y細胞はクラスIIバイオセーフティキャビネット内で6ウェルクリアボトム組織培養プレートの各ウェルに、それらを37℃、5%CO 2で成長することができます。
  2. 細胞が60〜70%コンフルエントに達したときに、DMSOに溶解した10mMのストック溶液を使用して、1 mMのDMSOに溶解しストック溶液を、10μMのTAMを使用して、1μMJCTH-4、両方でそれらを扱う単独およびクラスIIバイオセーフティキャビネットの組み合わせである。
  3. 37前述の治療法48時間(SH-SY5Y細胞)または72時間℃、5%CO 2(MCF7細胞)で細胞をインキュベートします。
  4. 薬による治療と細胞をインキュベートした後、直接、核を染色するために、10μMの最終濃度に処理した細胞の培地にヘキスト33342色素(Molecular Probes社、ユージーン、オレゴン州、米国)を追加します。
  5. 光から保護された5〜10分間Hoechst色素で細胞をインキュベートします。
  6. ライカDM IRBの倒立蛍光顕微鏡(ライカマイクロシステムズ、ヴェッツラー、ドイツ)のステージ上にプレートを置きます。
  7. 400Xの倍率で、蛍光および位相顕微鏡写真を取る。

5。アネキシンV結合アッセイ

  1. クラスIIバイオセーフティキャビネット内で10mLの組織培養プレートにプレート約5.0×10 5 MCF7、SH-SY5Y、またはNFF細胞とそれらを37℃、5%CO 2で成長することができます。
  2. W鶏の細胞は60〜70%コンフルエントに到達し、1μMJCTH-4は、DMSOに溶解し1mMのストック溶液とクラスIIバイオセーフティのDMSOに溶解した10mMのストック溶液を用いて、10μMのTAMは、両方の単独および組み合わせを使用してそれらを扱うキャビネット。
  3. 37前述の治療法48時間(SH-SY5Y細胞)または72時間℃、5%CO 2(MCF7およびNFF細胞)で細胞をインキュベートします。
  4. 10mMのHEPES、使用するまで、10mMのNaOHを、140mMのNaCl、および4でpHを7.6とお店で1mMのCaCl 2°CでのddH 2 O中にアネキシンV結合バッファーを準備します。
  5. 治療と薬と細胞をインキュベートした後、浮遊細胞を含むプレートから培地を除去し、適切な治療で標識されたそれぞれ異なる治療群ごとに別々の15 mLのコニカルチューブに入れます。
  6. トリプシンを用いてプレートから接着細胞をデタッチします。
  7. トリプシンの結果として、プレートから持ち上げられた細胞の後、15 mLの円錐に配置培地を吸引除去するらは、ステップ5.4のチューブとトリプシン細胞懸濁液で、元のプレートに戻します。
  8. 電子ピペットフィラーと血清ピペットで、トリプシンの細胞溶液を用いてメディアを混在させると、それに対応する15 mLのコニカルチューブに戻し、この混合物を配置します。
  9. 4℃で5分間、600 xgで細胞を遠心分離°C、各チューブから上清を除去し、PBSに再懸濁します。
  10. 5分間600×gで遠心し、各チューブから上清を除去し、アネキシンVの結合バッファー50〜70μLで標識したマイクロチューブに再懸濁します。
  11. 10μMの最終濃度にアネキシンV AlexaFluor-488(1:50)(Sigma-Aldrich社、ミシサガ、ON、カナダ)とヘキスト染料を追加し、光から保護し、15分間インキュベートします。
  12. インキュベーション後、遠心管の渦1つは、顕微鏡のスライドに細胞液の7から10μLを加え、microscopに細胞混合物のカバースリップを頭上に置く蛍光顕微鏡(ライカマイクロシステムズ、ヴェッツラー、ドイツ)を反転ライカDM IRBで400倍の倍率で電子スライド、ビューごとに蛍光顕微鏡、アネキシンVおよびHoechstイメージの両方を取る。残りのマイクロチューブの各々に各実験サンプルについて、この手順を繰り返します。

6。水溶性テトラゾリウム塩(WST-1)細胞生存率のアッセイ

  1. クラスIIバイオセーフティキャビネット内でコンフルエントT75フラスコまたは10 cmの組織培養MCF7の皿、SH-SY5Y、またはNFF細胞をトリプシン処理。
  2. 細胞が解除された後、トリプシンにメディアの5〜10 mLを加え、15 mLコニカルチューブ内のメディア細胞懸濁液を配置します。
  3. 5分間600×gで遠心し、バイオセーフティキャビネットに戻ってチューブを配置し、各チューブから上清を除去し、細胞ペレットのサイズに応じてメディアの約1〜3 mLの細胞を再懸濁します。
  4. マイクロ遠心チューブに細胞懸濁液の代わりに10μL、トリパンブルー染料(Sの10μLを追加igma-Aldrichは、ミシサガ、ON、カナダ)、マイクロピペットで混ぜる。
  5. haemocytometer(Hausser科学、アメリカ)のトリパンブルー細胞懸濁液の10μLをロードし、細胞をカウントし、元の15 mLコニカルチューブに細胞懸濁液の細胞の濃度を計算します。
  6. MCF7およびSH-SY5Yとメッキするために必要なNFF細胞の5.0×10 4 1.5×10 5細胞/ mLの濃度で希釈した細胞懸濁液を作成するために必要な元の細胞懸濁液の体積を決定するために、この濃度を使用しています。
  7. /は、96ウェル透明底組織培養プレートの各ウェルに希釈した細胞懸濁液を100μLを加えることによっても×10 3 MCF7またはSH-SY5Y細胞/ウェルまたは5.0×10 3 NFF細胞板15に希釈した細胞懸濁液を使用しています。 37℃、5%CO 2で一晩細胞をインキュベートします。
  8. 72時間に1μMJCTH-4および10μMのTAMの両方単独およびクラスIIバイオセーフティキャビネットの組み合わせを持つ細胞を治療するMCF7およびNFF細胞、およびSH-SY5Y細胞に対する48時間の。
  9. 薬の治療とのインキュベーション後、各ウェルにWST-1試薬(米国、INロシュ·ダイアグノスティックス、インディアナポリス、インディアナ州)10μLを追加し、37℃で4時間プレートをインキュベート℃、5%CO 2。
  10. ワラックビクター3 1420マルチラベルカウンター(パーキンエルマー社、ウッドブリッジ、ON、カナダ)の450nmでの吸光度をとり、溶媒対照群の割合としてそれらを表現しています。

7。テトラメチルエステル(TMRM)染色

  1. クラスIIバイオセーフティキャビネット内で6ウェル組織培養プレートの各ウェルで6ウェルクリアボトム組織培養プレートとプレートMCF7細胞の各ウェルにカバースリップを置きます。彼らは37℃、5%CO 2で成長することができます。
  2. 細胞が60〜70%コンフルエントに達したときに、DMSOに溶解した10mMのストック溶液を使用して、1 mMのDMSOに溶解しストック溶液を、10μMのTAMを使用して、1μMJCTH-4でそれらを扱う、クラスIIバイオセーフティキャビネット内の単独および組み合わせの両方で。
  3. 37前述の治療で72時間℃、5%CO 2で細胞をインキュベートします。
  4. 薬による治療と細胞をインキュベートした後、直接、核だけでなく、テトラメチルエステル(TMRMを染色するために、10μMの最終濃度に処理した細胞の培地にヘキスト33342色素(Molecular Probes社、ユージーン、オレゴン州、米国)を追加)(ギブコBRL、VWR、ミシサガ、ON、カナダ)200nMの最終濃度。
  5. 光から保護し、45分間5%CO 2、37℃で色素で細胞をインキュベートします。
  6. ピペット顕微鏡スライド上にメディアまたはPBS 8μL、6ウェルプレートからカバースリップを取るとピンセットで下向きに細胞を顕微鏡スライド上にメディアまたはPBSの上に置きます。
  7. 蛍光顕微鏡を反転ライカDM IRBと、蛍光顕微鏡、各ビューのヘキストとTMRM顕微鏡の両方を取る(ライカマイクロシステムズ、400Xの倍率でウェッツラー、ドイツ)。

8。ミトコンドリアの分離

  1. 10低張緩衝液(1mMのEDTA、5mMのトリス-HCl、210 mMのマンニトール、70 mMスクロース、10μMLEU-PEP、10μMPEP-、及び100μMPMSF)を加え、反応バッファーについて準備し、両方のソリューションを維持する冷やして。
  2. SH-SY5Y細胞の約8〜10コンフルエントT75組織培養フラスコで、細胞をトリプシン処理トリプシンを中和するためにメディアを追加し、50 mLコニカルチューブに細胞懸濁液を収集し、4℃で5分間、600 xgでチューブを遠心° C.
  3. 冷PBSの約10〜20 mLの上清と再懸濁し、細胞ペレットを取り出し、4℃で5分間、600 xgでチューブを遠心し、一度この洗浄プロセスを繰り返します。
  4. 上清を除去し、冷低張緩衝液で細胞を再懸濁します。ガラスの組織グラインダーを使用して手動で細胞をホモジナイズし、4℃で5分間、600 xgで細胞ライセートを遠心分離℃に

9。 Amplexレッドアッセイ

  1. 細胞からミトコンドリアを単離した後、BioRadタンパク質アッセイ(バイオラッド、ヘラクレス、米国カリフォルニア州)で1mg/mL BSA(ウシ血清アルブミン)の既知濃度の標準曲線を用いて単離されたミトコンドリアのサンプルのタンパク質の濃度を推定。
  2. 単離されたミトコンドリア溶液のタンパク質濃度の推定を使用して、20μgのタンパク質を与えるためにこの溶液の体積を計算します。タンパク質/ウェルの20μgをロードするために不透明な96ウェルプレートの各ウェルにこのボリュームをピペット。
  3. 、反応緩衝液を100μLの総容量に薬物治療をプレートの各ウェルを埋める(1μMJCTH-4、および/または10μMのTAM、または250μMPQ(Sigma-Aldrichは、ミシサガの最終濃度と、ON 、Cポジティブコントロールとして使用穴田))、50μMの最終濃度でAmplexレッド試薬、6 U/200μLの割合で西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(Sigma-Aldrich社、ミシサガ、ON、カナダ)。
  4. 2時間のインキュベーション後に、例での蛍光測定値を取る。 560 nmおよびエム。蛍光光度計で590nmの(SpectraMaxジェミニXPS、分子デバイス、サニーベール、カリフォルニア州、米国)。

10。細胞溶解物の調製

  1. 10cmの組織培養プレートで60〜70%コンフルエントになるまでMCF7細胞を成長させる。
  2. 1μMJCTH-4および10μMのTAM単独治療群ごとに約10〜15プレートを72時間の組み合わせで細胞を処理します。
  3. 10μMLEU-PEP、10μMのPEP-、及び100μMPMSF、細胞溶解緩衝液(pH7.2の10mMのトリスHCl、5 mMの塩化カリウム、1mMのMgCl 2、1mMのEGTA、1%トリトンX-100の準備)とストア4℃で使用するまでC。
  4. 機械的にセルスクレーパーでプレート表面から細胞をはがすとラベルされた50の細胞を回収mLコニカルチューブ。
  5. 4°Cで5分間600×gでチューブを遠心し、4°Cで5分間冷却したPBS、遠心分離機600 xgでチューブの約10〜20 mLの上清と再懸濁し、細胞ペレットを削除し、この洗浄プロセスを繰り返す一度。
  6. 上清を除去し、冷細胞溶解緩衝液で細胞を再懸濁します。ガラスの組織グラインダーを使用して手動で細胞をホモジナイズし、4℃で5分間、600 xgで細胞ライセートを遠心分離℃に
  7. ペレットを廃棄し、使用するまで-20℃で細胞ライセートを格納します。

11。ウェスタンブロット解析

  1. BioRadタンパク質アッセイ(Bio-Rad社、ヘラクレス、CA、米国)を使用して、細胞溶解物のタンパク質濃度を決定します。ニトロセルロース膜にSDS-PAGEおよび転送蛋白質の対象に、タンパク質サンプルを。
  2. 転送後、1時間、5%(w / v)の牛乳をTBST(トリス緩衝生理食塩水のTween-20)溶液を用いたブロック膜。
  3. アリプローブ膜ウサギで提起されたI-LC3抗体(1:500)(Novusのバイオ、カタログ番号NB100-2220、リトルトン、コロラド州、米国)、またはマウスで提起された抗β-アクチン抗体(1:1000)(サンタクルス4でバイオテクノロジー社、カタログ番号SC-81178、パソローバルズ、カリフォルニア州、米国)℃で一晩
  4. 抗マウス(1:2000)または抗ウサギ(1​​:2000)、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体(アブカム&カタログ番号ab6728と1つの15分とTBSTとインキュベートの2つの5分間の洗浄の対象と膜4℃で1時間ab6802、ケンブリッジ、MA、米国)℃
  5. 対象膜をTBSTで3回連続して5分間洗浄へと強化された化学発光試薬(Sigma-Aldrich社、CPS160、ミシサガ、ON、カナダ)のタンパク質のバンドを視覚化することができます。
  6. ImageJのソフトウェアを使用してデンシトメトリー解析を行った。

12。 Monodansylcadaverine(MDC)染色

  1. 6の各ウェルに6ウェルクリアボトム組織培養プレートとプレートの各ウェルMCF7細胞にカバースリップを置きクラスIIバイオセーフティキャビネット内でも明確な底組織培養プレート。彼らは37℃、5%CO 2で成長することができます。
  2. 細胞が60〜70%コンフルエントに達したときに、クラスIIバイオにDMSOに溶解し、10mMのストック溶液は、両方の単独および組み合わせを使用して、1 mMのDMSOに溶解しストック溶液を、10μMのTAMを使用して、1μMJCTH-4でそれらを扱うキャビネット。
  3. 37前述の治療で72時間℃、5%CO 2で細胞をインキュベートします。
  4. 薬物による細胞の処理とインキュベートした後、直接15分間各ウェルに0.1mMの最終濃度にMonodansylcadaverine(MDC)(Sigma-Aldrich社、ミシサガ、ON、カナダ)を追加します。
  5. 光から保護して15分間5%CO 2、37℃で色素細胞をインキュベートします。
  6. ピペット顕微鏡スライド上にメディアまたはPBSの30μL、6ウェルプレートからカバースリップを取ると細胞faciの顕微鏡スライド上にメディアまたはPBSの上に置くピンセットでNG下向き。
  7. 400Xの倍率で、蛍光顕微鏡(ライカマイクロシステムズ、ウェッツラー、ドイツ)を反転ライカDM IRBと、各ビューに対して、蛍光MDCと位相顕微鏡写真を取る。

13。代表的な結果

JCTH-4によるヒト乳腺癌および神経芽腫細胞のアポトーシスの選択的誘導:TAMによる活性の増強

アポトーシスの選択的誘導は、自然のPST( 1a)11 月13日によって様々な癌細胞で示された。ので、PSTの低可用性に、我々は7 deoxypancratistatin(JCTH-4、 図1b)の類縁体を合成し、ヒトの乳房腺癌(MCF7)と神経芽腫細胞(SH-SY5Y)で同様の抗癌活性のためにそれらをスクリーニングした。実験の最初のフェーズでは、我々は、MCF7細胞でJCTH-4、TAM単独で治療後の経時的形態学的変化を監視し、組み合わせてしたかっただ。 MCF7細胞は48時間溶媒処理(コントロール)と、位相コントラスト画像をタイムラプス顕微鏡によって生成されたビデオ1に示すように、18時間監視された、これらの細胞は形態に大きな変化を示さなかった。対照的に、1μMJCTH-4治療の48時間後、これらの細胞は、そのような収縮などのアポトーシスに関連付けられている形態学的変化を示したビデオ2に見られるようにブレブ形成、アポトーシス小体の形成。一方、単独でMCF7細胞におけるTAM治療はオートファジー( ビデオ3)に関連付けられているオートファゴソームを示す点状の包有物を含む、非常に明確な形態を作り出した。非常に最小限のアポトーシスの形態を観察し、細胞は一般にMCF7細胞を処理し、溶媒対照に匹敵する健全な形態を示した。 illustratとして48時間後にMCF7細胞の増加アポトーシスの形態で示されるように興味深いことに、TAMの存在下で、JCTH-4によるアポトーシス誘導が大幅に強化されましたビデオ4のED。

実験の第2フェーズでは、我々は、アポトーシスの誘導を評価するために蛍光色素を利用した。 72時間、それぞれMCF7およびSH-SY5Y細胞に1μMJCTH-4治療の48時間後、Hoechst色素を用いた、核形態を監視する。結果は、MCF7とアポトーシス誘導の指標とSH-SY5Y細胞( 図2a、b)のアポトーシス小体を伴う凝縮し、明るく染色された核を示した。単独でTAM処理がMCF7およびSH-SY5Y細胞では最小限のアポトーシス核の形態が得られ、核は、大きな丸い、溶媒対照群( 図2a、b)に匹敵するヘキストとぼんやりと染色した。 ビデオ4、MCF7の核およびSH-SY5Y細胞と一致して72時間後の併用療法( 図2a、b)でアポトーシス形態の顕著な増加が表示されます。

アポトーシス誘導を確認するには、細胞は、pを評価したアネキシンV結合アッセイ17を介してhosphatidylserineの外部化、アポトーシスのマーカーで、。 MCF7およびSH-SY5Y細胞を1μMの一人でJCTH-4でそれぞれ72および48時間処理し、10μMのTAMとの組み合わせでアネキシンV結合のために陽性であった( 図3A、Bアポトーシスの誘導を確認し、緑色蛍光で示され。)ホスファチジルセリンのない明らかな外部化は、単独で、同様に72時間( 図3c)の後、前述のすべての治療群で治療NFF細胞のTAMで処理されたMCF7およびSH-SY5Y細胞で観察されなかった。したがって、単独およびTAMとの組み合わせでJCTH-4が選択的にMCF7およびSH-SY5Y細胞のアポトーシスを誘導する。

JCTH-4単独およびTAMとの組み合わせでの効果を定量化するために、細胞の生存のためのWST-1ベースの比色アッセイでは、アクティブな細胞代謝の指標は、MCF7で実行され、NFF細胞が72時間と処理SH-SY5Y細胞に処理した48時間。MCF7およびSH-SY5Y細胞( 図4a、b)の両方に有意差を示さなかっただけでは10μMのTAMながら溶媒対照群に比べ、1μMJCTH-4は、50%以上のアクティブセルの代謝を低下させた。興味深いことにMCF7およびSH-SY5Y細胞では、JCTH-4侮辱にTAMの添加は、細胞代謝の相乗的に減少した。 NFF細胞は、TAM( 図4c)と単独でJCTH-4とJCTH-4の両方に大幅に感受性が低かった。したがって、JCTH-4は、MCF7およびSH-SY5Y細胞におけるTAMとの選択的な相乗活性を示しています。

JCTH-4のミトコンドリア標的

JCTH-4が単離されたミトコンドリアの全細胞とROS生成にアポトーシスミトコンドリアの膜電位を誘導するミトコンドリアを標的としているかどうかを確認するには、モニターした。 MCF7細胞を72時間処理したとTMRMで染色した。 1μMJCTH-4は、赤色蛍光( 図5a)の損失によって示されるMMPを、減少した。しかし、目の単独で10μMのTAMがMMPには明らかな影響を与えなかったときに10μMのTAMのEに加え、MMPの大きな損失は、観察された。

ROSの生成が増加するが、ミトコンドリアの膜透過性とアポトーシス誘導に関連付けられているように、ROSの産生は、1μMJCTH-4および10μMのTAM、単独および組み合わせ18で処理されたSH-SY5Y細胞から単離されたミトコンドリアでAmplex赤い色素で評価した-20。蛍光測定値は相対蛍光単位(RFU)として表した。 ROS生成の増加がJCTH-4単独でTAM( 図5b)で観察した。興味深いことに、併用療法では、ROS産生のより大きな増加をもたらした。ミトコンドリアにおけるROS産生の既知の誘導剤、PQは、ポジティブコントロールとして用いた。

JCTH-4およびTAMによるオートファジーの誘導

オートファジーの誘導は、多くの異なる化合物による化学療法侮辱に関連付けられている図6a)で処理したMCF7細胞に存在していた。特に、MDC染色の強度だけではTAM続いて、併用療法で最大であり、単独でJCTH-4。

オートファジーの間に、通常は細胞質ゾル(LC3-I)、に位置する微小管関連タンパク質1軽鎖3(LC3)は、ホスファチジルエタノールアミンと脂質化され、その後autophagosomal膜(LC3-II)2にローカライズされた。オートファジーの誘導を確認するには、LC3-IIのレベルは、ウエスタンブロット分析を介して72時間処理したMCF7細胞で評価した。 10μMのTAMが大きいオートファジー応答を生成しながら、1μMJCTH-4はわずかにある( LC3-IIにLC3-Iの変換を誘発した6B)。興味深いことに、併用療法は、3以上のLC3-I比はLC3-IIを得た、オートファジーの最大誘導された。したがって、これらの結果は、併用療法と細胞内で最大の応答を、JCTH-4、TAM単独および組み合わせによるMCF7細胞におけるオートファジーの誘導を示しています。

補足ビデオ1。溶媒対照で処理されたMCF7細胞の細胞形態。 MCF7細胞は、48との間と66時間の位相コントラスト画像をタイムラプス顕微鏡を用いてポスト溶媒対照処理(DMSO)をモニターした。細胞は37℃、5%CO 2で維持した。画像は、400Xの倍率で撮影した。 ビデオを見るにはここをクリックしてください

補足ビデオ2。JCTH-4で処置したMCF7細胞におけるアポトーシス細胞の形態の誘導。 MCF7細胞は48および66時間後の治療のウィットとの間でモニターした位相コントラスト画像をタイムラプス顕微鏡を用いてhを1μMJCTH-4。細胞は37℃、5%CO 2で維持した。画像は、400Xの倍率で撮影した。 ビデオを見るにはここをクリックしてください

補足ビデオ3。TAMで処理されたMCF7細胞におけるオートファジー細胞形態の誘導。 MCF7細胞は、48および位相コントラスト画像をタイムラプス顕微鏡を用いて10μMのTAMと66時間後の処理の間にモニターした。細胞は37℃、5%CO 2で維持した。画像は、400Xの倍率で撮影した。 ビデオを見るにはここをクリックしてください

補足ビデオ4。MCF7細胞におけるTAMとJCTH-4で強化されたアポトーシスの形態。 MCF7細胞は、48との間と66時間共に1μMJCTH-4と相続きをタイムラプス顕微鏡を用いて10μMのTAMによる後処理をモニターしたRASTの写真。細胞は37℃、5%CO 2で維持した。画像は、400Xの倍率で撮影した。 ビデオを見るにはここをクリックしてください

図1
図1合成7-デオキシアナログへのPSTの構造比較。()pancratistatinの化学構造(PST)。JC-TH-酢酸-4(b)の化学構造(JCTH-4)。

図2
図2。JCTH-4 TAMと強化された活動の核アポトーシスの形態を誘導する。 MCF7()の核形態と、(b)SH-SY5Y細胞はTAMとJCTH-4 Hoechst色素で染色の指示濃度でそれぞれ72および48時間処理した。対照群は溶媒(Dで処理したMSO)。画像は、蛍光顕微鏡で400倍の倍率で撮影された。スケールバー=15μmで。

図3
図3。JCTH-4原因は外部化ホスファチジルセリン単独との組み合わせで癌細胞に選択的にTAMである。外部化されたホスファチジルセリンに結合するアネキシンV()は、MCF7(72時間)、(b)の SH-SY5Y(48時間)、およびJCTH-4で処理された(C)NFF(72時間)細胞にアポトーシス誘導の誘導を確認するために評価された指定された濃度とTAM。対照群は溶媒(DMSO)で処理した。画像は、蛍光顕微鏡で400倍の倍率で撮影された。スケールバー=15μmで。

図4
図4。TAMはJCTH-4選択的に癌細胞のことで生存率の低下を向上させます。 96ウェルプレートでは、シードのWiました日()MCF7、(b)の SH-SY5Y、および(c)NFF細胞とJCTH-4と示された濃度でのTAMで処理した。 MCF7およびNFF細胞は、72時間処理したとSH-SY5Yを48時間処理した。投稿薬物治療とインキュベーション、WST-1試薬を各ウェルに添加し、吸光度を450nmで採取し、コントロールの割合(DMSO)として表した。統計は、GraphPad Prismのバージョン5.0を用いて行った。値は、3つの独立した実験の4重からの平均±SDとして表される。 MCF7:* P <0.001、** P <0.0001対コントロール、#p <0.05対1μMJCTH-4、†P <0.0001対10μMのTAM。 SH-SY5Y:* P <0.0005対コントロール、#P <0.005対1μMJCTH-4、†P <0.005対10μMのTAM。 NFF:* P <0.005対10μMのTAM + MCF7細胞に1μMJCTH-4、# はp <0.01対10μMのTAM + 1μMJCTH-SH-SY5Y細胞では4。

図5
図5。JCTH-4とミトコンドリアにおけるTAMの行為。(a)の MCF7細胞はカバースリップ上で成長させ、薬物の指定された濃度で処理し72時間とMMPを評価するためにTMRMで染色した。対照群の細胞は、溶媒(DMSO)で処理した。画像は、蛍光顕微鏡で400倍の倍率で撮影した。スケールバー=15μmの(b)に SH-SY5Y細胞から単離したミトコンドリアが示された濃度とROS産生にJCTH-4とTAMで治療された西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)の存在下でAmplexレッド基質と評価した。対照群の細胞は、溶媒(DMSO)で処理した。パラコート(PQ)はポジティブコントロールとして250μMの濃度で使用されていました。蛍光の測定値はExでの治療の2時間後に得られた。 560 nmおよびエム。 590 nmおよび相対fluorescencのように表さ電子ユニット(RFU)。統計は、GraphPad Prismのバージョン5.0を使用して得られた。データは、同様の傾向を持つ3つの独立した実験の代表である。値は、1独立した実験の4重の平均値±SDとして表される。 * P <0.05、** P <0.005、*** P <0.001対照に対して、#p <0.05対1μMJCTH-4、†P <0.05対10μMのTAM; @ P <0.05対250μMPQ。

図6
図6:TAMはJCTH-4のオートファジー誘導を強化します。()MCF7細胞はカバースリップの上に成長し、72時間指示された濃度でJCTH-4とTAMの侮辱に供した。対照群の細胞は、溶媒(DMSO)で処理した。治療を掲示、MCF7細胞は貪食空胞を検出するためのMDCで染色した。画像は、蛍光顕微鏡で400倍の倍率で撮影した。スケールバー=15μmのb)のウェスタンブロット分析は、72時間の薬物示された濃度で処理されたMCF7細胞の細胞溶解物にLC3とβ-アクチンを実施した。デンシトメトリー分析は、ImageJのソフトウェアを使用して実行されました。統計は、GraphPad Prismのバージョン5.0を用いて行った。値は平均±SDとして表現さ​​れています。 * P <0.05、** P <0.005、*** P <0.0005対コントロール、#p <0.001対1μMJCTH-4、†P <0.001対10μMのTAM。

略語のリストが表示されます。

ER エストロゲン受容体
FMN フラビンモノヌクレオチド
JCTH-4 JC-TH-酢酸-4
LC3 微小管関連タンパク質1軽鎖3
MDC monodansylcadaverine
MMP mitochondrIAL膜電位
MRC ミトコンドリア呼吸鎖
NFF 正常ヒト胎児線維芽細胞
PQ パラコート
PST pancratistatin
RFU 相対蛍光単位
ROS 活性酸素種
TAM タモキシフェン
TMRM テトラメチルエステル

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Discussion

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PSTファイルと同様の化合物は抗がんプロパティ11-15,21を有すること示されいる。我々は以前、それによってapoptogenic要因12,14のリリースでアポトーシスを誘導する癌細胞に選択的にミトコンドリアを不安定にさせる自然のPSTが報告されています。それは最も可能性があり、同じ機構を介してJCTH-4行為、JCTH-4(TMRM染色( 図5A)で見て、SH-SY5Y細胞から単離されたミトコンドリアでのROSの生成を増加するとMCF7細胞におけるMMP崩壊を引き起こしたミトコンドリアの機能不全を示す図5b)。したがって、JCTH-4によるアポトーシスの誘導は、癌細胞内でミトコンドリア標的化を介して、おそらくです。

多数の相違点はJCTH-4による癌選択性の基礎として役立つことができる非癌と癌細胞間に存在しています。癌細胞は非常に解糖に依存し、エネルギー生産のためにミトコンドリアの少ないです。この現象は呼ばれていのワールブルク効果22。癌細胞のような代謝活性は、細胞質の高い酸味につながる。その結果、酸性の細胞質環境は、23アポトーシス侵入し、回避するために強化された能力にリンクされている癌細胞ミトコンドリア過分極に寄与している。ミトコンドリア癌細胞のHyperpolariztionしかし、JCTH-4に対する脆弱性癌細胞をレンダリングすることがあります。一度細胞に取り込ま、JCTH-4は、酵素処理により正電荷を取得することができると選択的に過分極の性質に起因するミトコンドリア癌細胞に取り込まれる可能性があります。また、ミトコンドリアに関連する抗アポトーシスタンパク質の配列は非常にミトコンドリア膜透過性とそのような24から26のタンパク質のBcl-2ファミリーのアポトーシスタンパク質のようなアポトーシスのその後の実行を禁止する癌細胞で発現させることが示されている。

細胞ストレスの様々な形態の存在下では、オートファジーは、次のようにトリガされますプロ生存応答、細胞が不利な条件2の下で生き残ることができます。この経路の刺激を介してしかし、自己貪食性細胞死3に上昇を与える重要な細胞内成分の豊富な故障につながる可能性があります。プロの生存とプロオートファジー死応答の両方が化学療法の侮辱3に関連付けられている。酸化ストレスにつながるJCTH-4によるミトコンドリア機能障害が自動デフォルトオートファジーの応答を引き起こす可能性があります。確かに我々はJCTH-4治療( 図2A、B 3A、B 6A、B)とアポトーシスと一緒にいくつかのオートファジー誘導を観察しました。 TAMはよくER陽性乳癌細胞におけるERアンタゴニストとして確立されているが、それは最近複合体I 10のFMNのサイトへのミトコンドリアの結合と相互作用することが示されています。さらに、TAMは、多くの癌細胞タイプ3間のオートファジーの既知の誘導物質である。確かに、TAMは、単離されたmitochのROS産生の増加を引き起こすたondria( 図5b)。しかし、このような相互作用が( 図5a)MMP崩壊を引き起こすには不十分であることが証明されたが、典型的なプロ生存オートファジー応答を誘導するのに十分。プロ死オートファジー応答を示唆する強化された細胞傷害性応答( 図4a、b)が、伴っていた組み合わせ( 図6a、b)に使用した場合JCTH-4とTAM豊富なオートファジーの誘導が観察され、それにもかかわらず、ミトコンドリアの透過性とapoptogenic因子放出の結果として、癌細胞は、最終的にアポトーシスで死亡しています。 JCTH-4侮辱にTAMによるそのような感作はTAMによるROS生成の増加に起因することがあります。 TAMとJCTH-4の両方が酸化ストレスを生成することができるため、両方の化合物とそのようなストレスの組み合わせ生産は有害なオートファジー応答および/または大規模なミトコンドリアの透過性とそれに続くアポトーシスを生じさせた大規模なオートファジー誘導につながる可能性があります。番目の組み合わされる治療は、非癌性線維芽細胞( 図4c)の生存に影響を与えません。これらの知見は、単独およびTAMとの組み合わせでJCTH-4は、非癌細胞への副作用を引き起こすことなく、乳癌および神経芽細胞腫の治療に効果的に使用することができることを示しています。

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Disclosures

利害の衝突が宣言されません。

Acknowledgments

この作品は、コロンバス章9671(ウィンザー、オンタリオ州)と、CIHRフレデリック·バンティングとデニス馬に授与チャールズ·ベスト、カナダ大学院奨学金の騎士によってサポートされています。タイムラプス顕微鏡で彼らの支援のためのロバート·ホッジとエリザベスフィダルゴ·ダ·シルヴァに感謝します。タイムラプス顕微鏡のビデオを編集するためのケイティFacecchiaに感謝します。また、この原稿の重要なレビューのためにSudipa 6月チャタジー、フィリップ·トレンブレイに感謝します。この作品は2010年には癌に対する彼の戦いを失ったケビンCouvillonのメモリに捧げられています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SH-SY5Y cell line ATCC CRL-2266
Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM Sigma-Aldrich 51448C
Fetal bovine serum GIBCO, by Life Technologies 16000-044
MCF7 cell line ATCC HTB-22
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R 0883
Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) Coriell Institute for Medical Research AG04431B
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30022.01
Tamoxifen citrate salt Sigma-Aldrich T9262
35 mm glass bottom culture dishes MatTek Corp. P35G-014-C
Leica DMI6000 B inverted microscope Leica Microsystems N/A
H–chst 33342 dye Molecular Probes, Life Technologies H3570
Leica DM IRB inverted fluorescence microscope Leica Microsystems N/A
Annexin V AlexaFluor-488 Invitrogen A13201
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154-20ML
Haemocytometer Fisher Scientific 267110
WST-1 reagent Roche Group 11644807001
Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter PerkinElmer, Inc. 1420-011
Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) GIBCO, by Life Technologies T-668
Glass tissue grinder Fisher Scientific K8885300-0002
BioRad protein assay Bio-Rad 500-0001Bottom of Form
Amplex Red Invitrogen A12222
Horseradish peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8125
SpectraMax Gemini XPS Molecular Devices 3126666
Anti-LC3 antibody raised in rabbit Novus Biologicals NB100-2220
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody Abcam ab6728
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody Abcam ab6802
Chemiluminescence peroxidase substrate Sigma-Aldrich CPS160
Monodansylcadaverine Sigma-Aldrich 30432

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References

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ヒト乳癌癌とタモキシフェンによる神経芽腫細胞の7 deoxypancratistatinの新規合成C-1アナログによるアポトーシスとオートファジー誘導の強化
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Ma, D., Collins, J., Hudlicky, T., Pandey, S. Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen. J. Vis. Exp. (63), e3586, doi:10.3791/3586 (2012).More

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