Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Forbedring av apoptotiske og autophagic Induksjon av en roman syntetisk C-1 Analog av 7-deoxypancratistatin i Human Breast adenokarsinom og neuroblastom celler med Tamoxifen

doi: 10.3791/3586 Published: May 30, 2012

Summary

Vi har syntetisert en roman analog pancratistatin med sammenlignbare anti-kreft aktivitet som innfødt pancratistatin, interessant, combinatory behandling med tamoxifen ga en drastisk forbedring i apoptotisk og autophagic induksjon av mitokondrie målretting med minimal effekt på noncancerous fibroblaster. Dermed kunne JCTH-4 i kombinasjon med tamoxifen gi en trygg anti-kreft behandling.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Innledning

Apoptose, eller skriv jeg programmert celledød, er en fysiologisk prosess som kan operere extrinsically, via binding av en død ligand til en død reseptor, eller egentlig. Den indre vei av apoptose er initiert av intracellulær stress som DNA skade og dysfunksjon i mitokondriene, dette til slutt fører til permeabilization av mitokondriene, spredning av mitokondriemembranen potensial (MMP), frigjøring av apoptogenic faktorer fra mitokondrie intermembrane plass, og påfølgende gjennomføring av apoptose en.

Autophagy er en prosess der en celle pauser, degraderer og resirkulerer sine egne intracellulære komponenter samtidig opprettholde plasmamembranen integritet, det er utløst av ulike typer mobile påkjenninger, inkludert oksidativt stress, hypoksi, protein tilslag, nærings deprivasjon, vekst faktor deprivasjon, og skadede organeller 2. I de innledende faseneav denne prosessen, er cytosoliske materiale omsluttet av autophagosomes, dobbelt membraned blemmer, som fuserer og lysosomer å danne autolysosomes. Innlegg lysosomal fusion, cytosoliske materialer tidligere tatt opp av autophagosomes brytes ned av lysosomale enzymer 2. Omfattende aktivering av denne veien gir omfattende nedbrytning av intracellulære komponenter som kan føre til autophagic celledød eller type II programmert celledød tre.

Unndragelse av celledød har vært regnet som en av kjennetegnene til kreft fire. Kreft er en sykdom karakterisert ved ukontrollert cellevekst og spredning fem. Særlig oppstår neuroblastom fra å utvikle nerve celler i det sympatiske nervesystemet fra neural crest 6. Det er den vanligste solide svulst oppstår i små barn, står for omtrent 9% av alle barndommen kreft 7. Selv om mye fremgang har blitt gjort til nå, er denne sykdommen problematiskbåde grunnleggende forskere og klinikere. På den annen side, er brystkreft den vanligste kreftformen blant kvinner 8. Tamoxifen (TAM) har blitt hyppig brukt til behandling i hormon-responsive brystkrefttilfeller som en østrogen reseptor (ER) antagonist 9. Likevel, andre rapporter gi bevis av nye uavhengige mekanismer av apoptose-induksjon TAM. Spesielt samhandler TAM med Complex jeg av den mitokondrielle luftveiene kjeden (MRC) på sitt Flavin mononucleotide (FMN) område 10.

PST er en naturlig forbindelse isolert fra Hymenocallis littoralis anlegget. Kontrastfarger fra mange kjemoterapeutika for tiden i bruk, har det vist seg å indusere apoptose, i en ikke-gentoksisk måte, selektivt i ulike kreft celletyper via mitochondrial målretting 11-15. Imidlertid har preklinisk og klinisk arbeid blitt hindret av tilgjengelighet sin, det er til stede ved svært lave mengder i sin naturlige kilde og mange complicasjon byrde sin kjemisk syntese. Vi har syntetisert og vist syntetiske analoger av 7-deoxypancratistatin og observert lignende anti-kreft aktivitet i en C-1 Acetoxymethyl derivatet, JC-TH-acetat-4 (JCTH-4) 16. Vi har nå i hånden en syntetisk PST analog med potent anti-kreft aktivitet. Den syntese har blitt standardisert og kan skaleres opp til å produsere tilstrekkelige mengder for preklinisk og klinisk arbeid. Siden naturlig PST og TAM både mål i mitokondriene, ville det være interessant å undersøke den kombinerte effekten av en syntetisk analog av PST på menneskelig brystkreft og neuroblastom celler i kombinasjon med TAM.

Heri, rapporterer vi selektiv cytotoksisitet av JCTH-4 i human neuroblastom (SH-SY5Y) og bryst adenokarsinom (MCF7) celler. JCTH-4 var i stand til å indusere apoptose i begge cellelinjer fra mitokondrie målretting; JCTH-4 forårsaket spredning av MMP og en økning i reaktive oksygenforbindelser (ROS) produksjon i isolerte mitochondria fra disse kreftcellene. Videre ble autophagy indusert av JCTH-4 i MCF7 celler. Interessant, tillegg av TAM til JCTH-4 fornærmelse forbedret de nevnte virkningene av JCTH-4 i SH-SY5Y og MCF7 celler. Morfologiske endringer indusert av JCTH-4 og TAM alene og i kombinasjon i MCF7 celler ble overvåket via gang-lapse mikroskopi av fase kontrast eller lyse felt bilder. Normale menneskelige foster fibroblaster (NFF) viste en markert nedgang i følsomhet overfor JCTH-4 både alene og i kombinasjon med TAM. Derfor er disse observasjonene tyder JCTH-4, alene og i sammen med TAM, å være en trygg og effektiv kjemoterapeutika agent mot brystkreft og neuroblastom.

Materialer og metoder

1. Cell Culture

  1. Vokse og kultur SH-SY5Y humane neuroblastom celler (ATCC, Kat. Nr. CRL-2266, Manassas, VA, USA) med Dulbecco modifiserte Eagles Medium F-12 HAM (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada) supplert med 2 mm L-Glutamine, 10% fosteret storfe serum (FBS) og 10 mg / ml gentamicin (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada). Opprettholde celler ved 37 ° C og 5% CO 2.
  2. Vokse og kultur MCF7 menneskelige brystkreft adenokarsinom celler (ATCC, Kat. Nr. HTB-22, Manassas, VA, USA) i RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich Canada, Mississauga, ON, Canada) supplert med 10% FBS standard (Thermo Scientific, Waltham, MA) og 10 mg / ml gentamicin (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada). Opprettholde celler ved 37 ° C og 5% CO 2.
  3. Dyrk og kultur den tilsynelatende normale menneskelige fosteret fibroblast (NFF) cellelinje (Coriell Institute for Medical Research, Kat. Nr. AG04431B, Camden, NJ, USA) i Dulbecco modifiserte Eagle medium, høye glukose (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA ) supplert med 15% FBS og 10 mg / ml gentamicin (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada). Opprettholde celler ved 37 ° C og 5% CO 2.

2. Drug Forberedelse

  1. Vei ut tamoksifen (TAM) citrate salt (Sigma-Aldrich, Kat. T9262 No, Mississauga, ON, Canada) og oppløse den i DMSO å forberede en 10 mM stamløsning. Oppbevares stamløsning ved -20 ° C inntil bruk. Alle kjøretøy kontroller brukt i denne studien inneholdt DMSO på mindre enn 0,5%.
  2. Gjenta trinn 2.1 til å utarbeide en 1 mm stamløsning oppløst i DMSO av JC-TH-acetat-4 (JCTH-4), produsert av chemoenzymatic syntese fra bromobenzene som tidligere beskrevet 16. Oppbevares stamløsning ved -20 ° C inntil bruk. Alle kjøretøy kontroller brukt i denne studien inneholdt DMSO på mindre enn 0,5%.

3. Time-Lapse Mikroskopi

  1. Plate ca 2,0 x 10 5 MCF7 celler i 35 mm glassbunn kultur retter (Mattek Corporation, Kat. Nr. P35G-014-C, Ashland, MA, USA) i sterile forhold i en klasse II biosikkerhet skap og tillate dem å vokse på 37 ° C og 5% CO 2.
  2. Når cellene nå 60 til 70% samløpet, behandle dem med 1 mM JCTH-4 ved hjelp av en 1 mmstamløsning oppløst i DMSO og 10 mM TAM hjelp av en 10 mM stamløsning oppløst i DMSO, alene og i kombinasjon i en klasse II biosikkerhet skap.
  3. Etter behandling av celler i 48 timer, sted celler i en oppvarmet kammer ved 37 ° C med 5% CO 2 på en scene av en Leica DMI6000 fluorescerende mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland).
  4. Bruke LAS AF6000 programvare, sette mikroskop for å ta fasekontrast eller lyse felt mikrografer på 400x forstørrelse hvert 5. minutt i 18 timer.

4. Nuclear Farging

  1. Plate ca 2,0 x 10 5 MCF7 eller SH-SY5Y celler i hver brønn av en 6 godt klar bunn vevskultur plate i en klasse II biosikkerhet skap og tillate dem å vokse ved 37 ° C og 5% CO 2.
  2. Når cellene nå 60 til 70% samløpet, behandle dem med 1 mM JCTH-4 ved hjelp av en 1 mm stamløsning oppløst i DMSO og 10 mM TAM hjelp av en 10 mM stamløsning oppløst i DMSO, bådealene og i kombinasjon i en klasse II biosikkerhet skap.
  3. Inkuber cellene med de nevnte behandlinger ved 37 ° C og 5% CO 2 i 48 timer (SH-SY5Y celler) eller 72 timer (MCF7 celler).
  4. Etter behandling og inkubering av celler med narkotika, direkte legge Hoechst 33342 fargestoff (molekylære prober, Eugene, OR, USA) til media av de behandlede cellene til en endelig konsentrasjon på 10 mM å farge kjerner.
  5. Inkuber cellene med Hoechst fargestoff i 5 til 10 minutter beskyttet mot lys.
  6. Sett platen på scenen av en Leica DM IRB invertert fluorescens mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland).
  7. Ta fluorescerende og fase mikrografer på 400x forstørrelse.

5. Annexin V Binding Assay

  1. Plate ca 5,0 x 10 5 MCF7, SH-SY5Y, eller NFFs celler i 10 ml vevskulturstudier plater i en klasse II biosikkerhet skap og tillate dem å vokse ved 37 ° C og 5% CO 2.
  2. Whøne celler nå 60 til 70% samløpet, behandle dem med 1 mM JCTH-4 ved hjelp av en 1 mm stamløsning oppløst i DMSO og 10 mM TAM hjelp av en 10 mM stamløsning oppløst i DMSO, både alene og i kombinasjon i en klasse II biosikkerhet skap.
  3. Inkuber cellene med de nevnte behandlinger ved 37 ° C og 5% CO 2 i 48 timer (SH-SY5Y celler) eller 72 timer (MCF7 og NFF celler).
  4. Forbered Annexin V binding buffer i DDH 2 O med 10 mm HEPES, 10 mm NaOH, 140 mM NaCl, og 1 mm CaCl 2 ved pH 7,6 og oppbevar ved 4 ° C inntil bruk.
  5. Etter behandling og inkubering av celler med narkotika, fjerne mediene fra platene inneholder suspendert celler og plassere den i et eget 15 ml konisk tube for hver enkelt behandling gruppe merkes med riktig behandling.
  6. Ta heftende celler fra platene med trypsin.
  7. Etter at cellene løftes fra platen som en følge av trypsin, aspirer media plassert i 15 ml kjeglesnittetal tube i trinn 5,4 og legg den tilbake i sin opprinnelige plater med trypsin suspendert cellene.
  8. Med elektronisk pipette filler og serologiske pipetter, bland media med trypsin cellen løsningen og sette denne blandingen tilbake i de tilsvarende 15 ml koniske rør.
  9. Sentrifuger cellene ved 600 xg i 5 minutter ved 4 ° C, fjern supernatanten fra hvert rør, og Resuspender celler i PBS.
  10. Sentrifuger cellene ved 600 xg i 5 minutter, fjern supernatanten fra hvert rør, og Resuspender celler i merkede microfuge rør med ca 50-70 mL av Annexin V binding buffer.
  11. Legg Annexin V AlexaFluor-488 (01:50) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada) og Hoechst fargestoff til en endelig konsentrasjon på 10 mM og inkuberes i 15 minutter beskyttet mot lys.
  12. Etter inkubasjon, vortex en av de microfuge rør, legg 7-10 mL av cellen blandingen til et objektglass, plassere en dekkglass overtop av cellen blandingen på microscope lysbilde og ta fluorescerende mikrografer, både Annexin V og Hoechst bilder for hver visning, på 400x forstørrelse på en Leica DM IRB invertert fluorescens mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland). Gjenta for hver eksperimentell prøve i hver av de resterende microfuge rørene.

6. Vannløselig tetrazoliumsalt (WST-1) Assay for celleviabilitet

  1. Trypsinize en konfluent T75 kolbe eller 10 cm vevskultur tallerken MCF7, SH-SY5Y, eller NFFs celler i en klasse II biosikkerhet skap.
  2. Etter at cellene har blitt løftet, tilsett 5 til 10 ml av media til trypsin og plasser media cellesuspensjon i en 15 ml konisk tube.
  3. Sentrifuger cellene ved 600 xg i 5 minutter, setter røret tilbake i biosikkerhet kabinettet, fjern supernatanten fra hvert rør, og resuspender cellene i ca 1 til 3 ml av media avhengig cellepelleten størrelse.
  4. Place 10 mL av cellen suspensjon i en microfuge tube, tilsett 10 mL av Trypan Blå farge (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada), og bland med en mikropipette.
  5. Load 10 mL av Trypan Blå suspendert celler i et haemocytometer (Hausser Scientific, USA), telle cellene, og beregne konsentrasjonen av celler av cellesuspensjon i den opprinnelige 15 ml konisk tube.
  6. Bruk denne konsentrasjonen å bestemme volumet av opprinnelige cellesuspensjon for å skape utvannet cellesuspensjoner med konsentrasjoner på 1,5 x 10 5 celler / ml for MCF7 og SH-SY5Y og 5,0 x 10 4 for NFFs celler som trengs for platekledning.
  7. Bruk utvannet cellesuspensjoner til plate 15 x 10 3 MCF7 eller SH-SY5Y celler / brønn eller 5,0 x 10 3 NFFs celler / brønn ved å tilsette 100 mL av de fortynnede cellesuspensjoner til hver brønn av en 96 godt klar bunn vevskultur plate. Inkuber cellene ved 37 ° C og 5% CO 2 over natten.
  8. Unn cellene med 1 mM JCTH-4 og 10 mM TAM både alene og i kombinasjon i en klasse II biosikkerhet skap for 72 timerss for MCF7 og NFF celler, og i 48 timer for SH-SY5Y celler.
  9. Etter behandling og inkubering av narkotika, tilsett 10 mL av WST-en reagens (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) til hver brønn og Inkuber platen i 4 timer ved 37 ° C og 5% CO 2.
  10. Ta avlesninger ved 450 nm på en Wallac Victor 3 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Canada) og uttrykke dem som prosentandeler av løsningsmiddelet kontrollgruppene.

7. Tetramethylrhodamine Methyl Ester (TMRM) Farging

  1. Plasser en dekkglass i hver brønn i en 6 godt klar bunn vevskultur plate og plate MCF7 celler i hver brønn av en 6 brønn vevskultur plate i en klasse II biosikkerhet skap. Tillate dem å vokse ved 37 ° C og 5% CO 2.
  2. Når cellene nå 60 til 70% samløpet, behandle dem med 1 mM JCTH-4 ved hjelp av en 1 mm stamløsning oppløst i DMSO og 10 mM TAM hjelp av en 10 mM stamløsning oppløst i DMSO,både alene og i kombinasjon i en klasse II biosikkerhet skap.
  3. Inkuber cellene med de nevnte behandlinger ved 37 ° C og 5% CO 2 i 72 timer.
  4. Etter behandling og inkubering av celler med narkotika, direkte legge Hoechst 33342 fargestoff (molekylære prober, Eugene, OR, USA) til media av de behandlede cellene til en endelig konsentrasjon på 10 mM å farge kjerner samt tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM ) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada) i en endelig konsentrasjon på 200 nM.
  5. Inkuber cellene med fargestoffer ved 5% CO 2 og 37 ° C i 45 minutter beskyttet mot lys.
  6. Pipetter 8 mL av media eller PBS på et objektglass og ta en dekkglass fra 6 brønnen platen og legg den på toppen av media eller PBS på objektglass med cellene vender nedover med pinsett.
  7. Ta fluorescerende mikrografer, både Hoechst og TMRM mikrografer for hver visning, med en Leica DM IRB invertert fluorescens mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) ved 400x forstørrelse.

8. Mitokondrie Isolasjon

  1. Forbered ca 10 ml av hypoton buffer (1 mM EDTA, 5 mm Tris-HCl, 210 mm mannitol, 70 mm sukrose, 10 mM Leu-futt, 10 mM Pep-A, og 100 mM PMSF) og reaksjon buffer og holde begge løsningene på is.
  2. Med omtrent 8 til 10 konfluent T75 vevskulturstudier flasker av SH-SY5Y celler, trypsinize cellene, legge media for å nøytralisere den trypsin, samle cellesuspensjoner i 50 ml koniske rør, og sentrifuger rørene på 600 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
  3. Fjern supernatanten og resuspender celle pellets i ca 10 til 20 ml kald PBS, sentrifuger rørene på 600 xg i 5 minutter ved 4 ° C, og gjenta denne vaskeprosessen gang.
  4. Fjern supernatanten og resuspender cellene i kaldt hypoton buffer. Homogenisere celler manuelt med en glassfiberduk jeksel og sentrifuger cellen lysate ved 600 xg i 5 minutter ved 4 ° C.

9. Amplex Red Assay

  1. Etter å isolere mitokondrier fra celler, anslå konsentrasjonen av protein i prøven av isolerte mitokondrier bruke en standard kurve kjente konsentrasjoner av 1mg/mL BSA (Bovine serum albumin) med BioRad protein assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA USA) .
  2. Bruke den beregnede konsentrasjonen av protein av isolerte mitokondrier løsningen, beregne volumet av denne løsningen for å gi 20 mikrogram av protein. Pipettering dette volumet i hver brønn av en ugjennomsiktig 96-brønnen plate å laste 20 mikrogram av protein / brønn.
  3. Fyll hver brønn i platen til et totalt volum på 100 mL med reaksjon buffer, behandling for narkotikamisbruk (med en endelig konsentrasjon på 1 mM JCTH-4, og / eller 10 mm TAM, eller 250 mM PQ (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON , Canada) brukes som en positiv kontroll), Amplex Red reagensen på en endelig konsentrasjon på 50 mikrometer, og pepperrot peroksidase (HRP) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada) i forholdet 6 U/200 mL.
  4. Etter en to timers inkubasjon, ta fluorescens avlesing i Ex. 560 nm og Em. 590 nm på en spektrofluorometer (SpectraMax Gemini XPS, molekylære enheter, Sunnyvale, CA, USA).

10. Cellular lysate Forberedelse

  1. Grow MCF7 cellene til 60 til 70% samløpet i 10 cm vevskulturstudier plater.
  2. Unn celler med 1 mM JCTH-4 og 10 mM TAM alene og i kombinasjon for 72 timer med ca 10 til 15 plater per behandling gruppe.
  3. Forbered cellelyse buffer (10 mM Tris HCl ved pH 7,2, 5 mm KCl, 1 mM MgCl 2, 1 mm EGTA, 1% Triton-X-100, 10 mM Leu-futt, 10 mM Pep-A, og 100 mM PMSF ) og oppbevar ved 4 ° C inntil bruk.
  4. Mekanisk løsne cellene fra platen flater med en celle skraper og samle celler i merkede 50ml koniske rør.
  5. Sentrifuger rørene ved 600 xg i 5 minutter ved 4 ° C, Fjern supernatanten og resuspender celle pellets i ca 10 til 20 ml kald PBS, sentrifuger rørene på 600 xgi 5 minutter ved 4 ° C, og gjenta denne vaskeprosessen gang.
  6. Fjern supernatanten og resuspender cellene i kaldt cellelyse buffer. Homogenisere celler manuelt med en glassfiberduk jeksel og sentrifuger cellen lysate ved 600 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
  7. Kast pellets og lagre celle lysates ved -20 ° C inntil bruk.

11. Western blot analyser

  1. Bestem protein konsentrasjonen av celle lysates bruker BioRad protein assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA USA). Utsett protein prøvene til SDS-PAGE og transfer protein til en nitrocellulose membran.
  2. Etter overføringen, blokk membraner med en 5% w / v melk TBST (Tris-bufret saltvann Tween-20) løsning for en time.
  3. Probe membraner med en mauri-LC3 antistoff oppvokst i kanin (1:500) (Novus Biologicals, Kat. nr. NB100-2220, Littleton, CO, USA), eller en anti-β-Actin antistoff oppvokst i mus (1:1000) (Santa Cruz Bioteknologi, Inc., Kat. nr. sc-81178, Paso Robles, California, USA) over natten ved 4 ° C.
  4. Tema membraner til en 15 minutt og to 5 minutt vasker i TBST og inkuber med en anti-mus (1:2000) eller en anti-kanin (1:2000) pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Abcam, Cat. Nr. ab6728 & ab6802, Cambridge, MA, USA) for en time ved 4 ° C.
  5. Tema membraner til tre påfølgende fem minutt vasker i TBST og visualisere proteiner band med forbedret chemiluminescence reagens (Sigma-Aldrich, CPS160, Mississauga, ON, Canada).
  6. Fremført densitometry analyser ved hjelp ImageJ programvare.

12. Monodansylcadaverine (MDC) Farging

  1. Plasser en dekkglass i hver brønn i en 6 godt klar bunn vevskultur plate og plate MCF7 celler i hver brønn av en 6vel klart bunn vevskultur plate i en klasse II biosikkerhet skap. Tillate dem å vokse ved 37 ° C og 5% CO 2.
  2. Når cellene nå 60 til 70% samløpet, behandle dem med 1 mM JCTH-4 ved hjelp av en 1 mm stamløsning oppløst i DMSO og 10 mM TAM hjelp av en 10 mM stamløsning oppløst i DMSO, både alene og i kombinasjon i en klasse II biosikkerhet skap.
  3. Inkuber cellene med de nevnte behandlinger ved 37 ° C og 5% CO 2 i 72 timer.
  4. Etter behandling og inkubering av celler med legemidler, direkte legge Monodansylcadaverine (MDC) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada) til en endelig konsentrasjon på 0,1 mm til hver brønn for 15 min.
  5. Inkuber cellene med fargestoff ved 5% CO 2 og 37 ° C i 15 minutter beskyttet mot lys.
  6. Pipetter 30 mL av media eller PBS på et objektglass og ta en dekkglass fra 6 brønnen platen og legg den på toppen av media eller PBS på objektglass med celler FACIng nedover med pinsett.
  7. Ta fluorescerende MDC og fase mikrografer, for hver visning, med en Leica DM IRB invertert fluorescens mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) ved 400x forstørrelse.

13. Representative Resultater

Selektiv Induksjon av apoptose i Human Breast adenokarsinom og neuroblastom celler ved JCTH-4: Forbedring av aktivitet ved TAM

Selektiv induksjon av apoptose ble vist i forskjellige kreftceller ved naturlig PST (Fig. 1a) 11-13. På grunn av den lave tilgjengeligheten av PST, har vi syntetisert analoger av 7-deoxypancratistatin (JCTH-4, fig. 1b) og vist dem for lignende anti-kreft aktivitet i menneskelig bryst adenokarsinom (MCF7) og neuroblastom celler (SH-SY5Y). I den første fasen av eksperimenter, ønsket vi å overvåke morfologiske endringer over tid etter behandling med JCTH-4 og TAM alene og i kombinasjon i MCF7 celles. MCF7 celler ble overvåket i 18 timer, som sett i videoen en produsert av time-lapse mikroskopi med fasekontrast bilder, med løsemiddel behandling (kontroll) for 48 timer, og disse cellene viste ingen store endringer i morfologi. I kontrast, etter 48 timer med en mM JCTH-4 behandling, viste disse cellene morfologiske endringer knyttet til apoptose som svinn, blebbing, apoptotisk kroppen formasjon som sett i Video 2. På den annen side, produsert TAM behandling alene i MCF7 celler en meget distinkt morfologi inkludert punctate inneslutninger som tyder på autophagosomes knyttet autophagy (Video 3). Veldig minimal apoptotisk morfologi ble observert og cellene generelt utstilt sunt morfologi sammenlignbart med løsemiddelet kontrollen behandlet MCF7 celler. Interessant, i nærvær av TAM ble apoptotisk induksjon JCTH-4 drastisk forbedret indikert ved økt apoptotisk morfologi i MCF7 celler etter 48 timer som illustrerted i Video 4.

I den andre fasen av forsøkene benyttet vi fluorescerende fargestoffer for å vurdere induksjon av apoptose. Etter 72 timer og 48 timer med en mM JCTH-4 behandling i MCF7 og SH-SY5Y celler henholdsvis, ble Hoechst fargestoff som brukes og til å overvåke kjernefysisk morfologi. Resultatene indikerte kondensert, brightly farget atomkjerner ledsaget av apoptotiske legemer i MCF7 og SH-SY5Y celler, som tyder på apoptotisk induksjon (Fig. 2a, b). TAM behandling alene gitt minimal apoptotisk kjernefysisk morfologi i MCF7 og SH-SY5Y celler; atomkjerner var store, runde, og dunkelt farget med Hoechst sammenlignbar solvent kontrollgruppen (Fig. 2a, b). I avtalen med 4 Video, kjerner av MCF7 og SH-SY5Y celler viste en markant økning i apoptotisk morfologi med kombinasjonen behandling etter 72 timer (Fig. 2a, b).

For å bekrefte apoptotisk induksjon, ble cellene evaluert for phosphatidylserine eksternalisering, en markør for apoptose, via en Annexin V bindende analysen 17. MCF7 og SH-SY5Y celler behandlet for 72 og 48 timer henholdsvis med 1 mM JCTH-4 alene og i kombinasjon med 10 mm TAM var positive for Annexin V binding, angitt med den grønne fluorescens, bekrefter induksjon av apoptose (fig 3a, b ). Ingen tydelig eksternalisering phosphatidylserine ble observert i MCF7 og SH-SY5Y celler behandles med TAM alene, samt i NFFs celler behandlet med alle de nevnte behandlinger gruppene etter 72 timer (Fig. 3c). Derfor induserer JCTH-4 alene og i kombinasjon med TAM selektivt apoptose i MCF7 og SH-SY5Y celler.

For å kvantifisere effekten av JCTH-4 alene og i kombinasjon med TAM, en WST-1 basert kolorimetrisk analysen for celleviabilitet, en indikator på aktiv celle metabolisme, ble utført på MCF7 og NFF celler behandlet for 72 timer og SH-SY5Y celler behandlet for 48 timer.Sammenlignet med løsemiddel kontrollgruppene, nedsatt en mM JCTH-fire aktive cellen metabolisme med over 50%, mens 10 mM TAM alene utstilt ingen signifikant forskjell i både MCF7 og SH-SY5Y celler (4a Fig. b). Interessant i MCF7 og SH-SY5Y celler, resulterte tillegg av TAM til JCTH-4 fornærmelse i en synergistisk reduksjon i celle metabolisme. NFFs celler var drastisk mindre følsomme for både JCTH-4 alene og JCTH-4 med TAM (Fig. 4c). Derfor demonstrerer JCTH-4 selektiv synergistisk aktivitet med TAM i MCF7 og SH-SY5Y celler.

Mitokondrie Målretting av JCTH-4

For å se om JCTH-4 er rettet mot mitokondrier å indusere apoptose mitokondriemembranen potensialet i hele celler og ROS generasjon i isolerte mitokondrier ble overvåket. MCF7 celler ble behandlet i 72 timer og farget med TMRM. 1 mM JCTH-4 redusert MMP, indikert ved tap av røde fluorescens (fig 5a). Men med the tillegg av 10 mM TAM, var en større spredning av MMP observert, mens 10 mM TAM alene hadde ingen tydelig effekt på MMP.

Som øker ROS generasjon har blitt assosiert til mitokondriemembranen permeabilization og apoptose induksjon, ble produksjonen av ROS vurdert med Amplex rødt fargestoff i isolerte mitokondrier fra SH-SY5Y celler behandlet med 1 mM JCTH-4 og 10 mM TAM, alene og i kombinasjon 18 -20. Fluorescens målingene ble uttrykt som relative fluorescens enheter (RFU). Økninger i ROS generasjon ble observert med JCTH-4 og TAM alene (Fig. 5b). Interessant, ga kombinasjonsbehandling en større økning i ROS produksjon. En kjent induser av ros produksjon i mitokondriene, PQ, ble benyttet som en positiv kontroll.

Induksjon av Autophagy ved JCTH-4 og TAM

Autophagic induksjon har vært tilknyttet til kjemoterapeutisk fornærmelse av mange forskjellige forbindelser (Fig. 6a). Spesielt var intensiteten av MDC flekker størst med kombinasjonsbehandling, etterfulgt av TAM alene, og JCTH-4 alene.

Under autophagy, microtubuli-assosiert protein 1 lett kjede 3 (LC3) normalt ligger i cytosol (LC3-I), er lipidated med phosphatidylethanolamine og senere lokalisert til autophagosomal membraner (LC3-II) 2. For å bekrefte induksjon av autophagy, var nivået på LC3-II vurderes i MCF7 celler behandlet i 72 timer via Western blot analyser. 1 mM JCTH-4 litt indusert konvertering av LC3-I til LC3-II mens 10 mM TAM produsert en større autophagic respons (Fig.6b). Interessant, resulterte kombinasjonsbehandling i størst induksjon av autophagy, som gir en LC3-II til LC3-I ratio større enn 3. Derfor er disse resultatene viser autophagic induksjon i MCF7 celler ved JCTH-4 og TAM alene og i kombinasjon, med størst respons i celler med kombinasjonen behandling.

Supplemental Video 1. Cellular morfologi MCF7 celler behandlet med løsemiddel kontroll. MCF7 celler ble overvåket mellom 48 og 66 timer etter løsemiddel kontroll behandling (DMSO) ved hjelp av time-lapse mikroskopi med fasekontrast bilder. Celler ble opprettholdt ved 37 ° C og 5% CO 2. Bilder ble tatt til fange ved 400x forstørrelse. Klikk her for å se video .

Supplemental Video 2. Induksjon av apoptotisk mobilnettet morfologi i MCF7 celler behandlet med JCTH-4. MCF7 celler ble overvåket mellom 48 og 66 timer etter behandling viddH 1 mM JCTH-4 ved hjelp av time-lapse mikroskopi med fasekontrast bilder. Celler ble opprettholdt ved 37 ° C og 5% CO 2. Bilder ble tatt til fange ved 400x forstørrelse. Klikk her for å se video .

Supplemental Video 3. Induksjon av autophagic mobilnettet morfologi i MCF7 celler behandlet med TAM. MCF7 celler ble overvåket mellom 48 og 66 timer etter behandling med 10 mM TAM bruke time-lapse mikroskopi med fasekontrast bilder. Celler ble opprettholdt ved 37 ° C og 5% CO 2. Bilder ble tatt til fange ved 400x forstørrelse. Klikk her for å se video .

Supplemental Video 4. Enhanced apoptotisk morfologi ved JCTH-4 med TAM i MCF7 celler. MCF7 celler ble overvåket mellom 48 og 66 timer etter behandling med både en mM JCTH-4 og 10 mM TAM bruke time-lapse mikroskopi med fase fortsRast bilder. Celler ble opprettholdt ved 37 ° C og 5% CO 2. Bilder ble tatt til fange ved 400x forstørrelse. Klikk her for å se video .

Figur 1
Figur 1. Structural sammenligning av PST til en syntetisk 7-deoxy analog. (A) Kjemisk struktur av pancratistatin (PST). (B) Kjemisk struktur av JC-TH-acetat-4 (JCTH-4).

Figur 2
Figur 2. JCTH-4 induserer kjernefysisk apoptotisk morfologi med økt aktivitet med TAM. Nuclear morfologi (a) MCF7 og (b) SH-SY5Y celler behandlet for 72 og 48 timer henholdsvis med de indikerte konsentrasjoner av TAM og JCTH-4 beiset med Hoechst fargestoff. Kontroll grupper ble behandlet med løsemiddel (DMSO). Bilder ble tatt på 400x forstørrelse på en fluorescerende mikroskop. Scale bar = 15 mikrometer.

Figur 3
Figur 3. JCTH-4 årsaker phosphatidylserine eksternalisering alene og i kombinasjon med TAM selektivt i kreftceller. Annexin V binding til eksternaliserte phosphatidylserine ble evaluert for å verifisere induksjon av apoptose induksjon i (a) MCF7 (72 timer), (b) SH-SY5Y (48 timer), og (c) NFF (72 timer) celler behandlet med JCTH-4 og TAM den indikerte konsentrasjoner. Kontroll grupper ble behandlet med løsemiddel (DMSO). Bilder ble tatt på 400x forstørrelse på en fluorescerende mikroskop. Scale bar = 15 mikrometer.

Figur 4
Figur 4. TAM forbedrer levedyktighet reduksjon av JCTH-4 selektivt i kreftceller. 96-vel platene var seedet with (a) MCF7, (b) SH-SY5Y, og (c) NFFs celler og behandles med JCTH-4 og TAM den indikerte konsentrasjoner. MCF7 og NFF celler ble behandlet i 72 timer og SH-SY5Y ble behandlet i 48 timer. Innlegg medikamentell behandling og inkubasjon, ble WST-1 reagens lagt til hver brønn, og avlesninger ble tatt ved 450 nm og uttrykt som en prosentandel av kontroll (DMSO). Statistikk som ble utført med GraphPad Prism versjon 5.0. Verdiene uttrykkes som gjennomsnitt ± SD fra quadruplicates av 3 uavhengige eksperimenter. MCF7: * p <0,001, ** p <0,0001 versus kontroll, # p <0,05 versus en mM JCTH-4; † p <0,0001 mot 10 mM TAM. SH-SY5Y: * p <0,0005 versus kontroll, # p <0,005 versus en mM JCTH-4; † p <0,005 versus 10 mM TAM. NFF: * p <0,005 versus 10 mM TAM + 1 mM JCTH-4 i MCF7 celler, # p <0,01 versus 10 mM TAM + 1 mM JCTH-4 i SH-SY5Y celler.

Figur 5
Figur 5. JCTH-4 og TAM handle på mitokondriene. (A) MCF7 cellene ble dyrket på Dekkglass og behandles med de indikerte konsentrasjoner av legemidler for 72 timer og farget med TMRM å evaluere MMP. Celler i kontrollgruppen ble behandlet med løsemiddel (DMSO). Bilder ble tatt til fange ved 400x forstørrelse på en fluorescens mikroskop. Scale bar = 15 mikrometer. (B) Isolert mitokondrier fra SH-SY5Y celler ble behandlet med JCTH-4 og TAM den indikerte konsentrasjoner og ROS produksjonen ble vurdert med Amplex Red substrat i nærvær av pepperrot peroksidase (HRP). Kontrollgruppen celler ble behandlet med løsemiddel (DMSO). Paraquat (PQ) ble brukt i en konsentrasjon på 250 mM som en positiv kontroll. Fluorescens målingene ble oppnådd etter 2 timers behandling på Ex. 560 nm og Em. 590 nm og uttrykt som relativ fluorescence-enheter (RFU). Statistikken ble innhentet ved hjelp GraphPad Prism versjon 5.0. Data er representativ for 3 uavhengige eksperimenter med lignende trender. Verdiene uttrykkes som gjennomsnitt ± SD av quadruplicates av en uavhengig eksperiment. * P <0,05, ** p <0,005, *** p <0,001 versus kontroll, # p <0,05 versus en mM JCTH-4; † p <0,05 versus 10 mM TAM; @ p <0,05 versus 250 mM PQ.

Figur 6
Figur 6. TAM forbedrer autophagic induksjon av JCTH-4. (A) MCF7 cellene ble dyrket på Dekkglass og utsatt for JCTH-4 og TAM fornærmelse den indikerte konsentrasjoner i 72 timer. Kontrollgruppe celler ble behandlet med løsemiddel (DMSO). Innlegg behandling, ble MCF7 celler farget med MDC å oppdage autophagic vakuoler. Bilder ble tatt til fange ved 400x forstørrelse på en fluorescens mikroskop. Scale bar = 15 mikrometer. (b) Western blot analyser ble utført for LC3 og β-Actin på celle lysates av MCF7 celler behandlet med de indikerte konsentrasjoner av legemidler til 72 timer. Densitometric analyser ble utført ved å bruke ImageJ programvare. Statistikk som ble utført med GraphPad Prism versjon 5.0. Verdiene uttrykkes som gjennomsnitt ± SD. * P <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0005 versus kontroll, # p <0,001 versus en mM JCTH-4; † p <0,001 versus 10 mM TAM.

Liste over forkortelser.

ER østrogen reseptor
FMN Flavin mononucleotide
JCTH-4 JC-TH-acetate-4
LC3 microtubuli-assosiert protein 1 lys kjeden tre
MDC monodansylcadaverine
MMP mitochondrIAL membranpotensiale
MRC mitokondrie luftveiene kjeden
NFF normal human føtal fibroblast
PQ Paraquat
PST pancratistatin
RFU relative fluorescens enheter
ROS reaktive oksygen arter
TAM tamoxifen
TMRM tetramethylrhodamine methyl ester

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PST og lignende forbindelser har vist seg å ha anti-kreft egenskaper 11-15,21. Vi har tidligere rapportert naturlig PST å destabilisere mitokondriene selektivt i kreftceller, som derved induserer apoptose ved utgivelsen av apoptogenic faktorer 12,14. Det er mest sannsynlig at JCTH-4 handlinger gjennom den samme mekanismen, JCTH-4 forårsaket MMP kollaps i MCF7 celler som sett med TMRM farging (Fig. 5a), og økt produksjon av ros i isolert mitokondriene fra SH-SY5Y celler (Fig. 5b), indikerer mitokondriell dysfunksjon. Dermed er induksjon av apoptose ved JCTH-fire mest sannsynlig gjennom mitokondrie annonsering i kreftceller.

Tallrike forskjeller mellom noncancerous og kreft celler som kan tjene som grunnlag for kreft selektivitet ved JCTH-4. Kreftceller er svært avhengig av glykolysen og mindre på mitokondrier for energiproduksjon, dette fenomenet kalles ener den Warburg effekten 22. Slik metabolsk aktivitet i kreftcellene fører til høy surhet i cytosol. Derfor bidrar det sure cytosoliske miljøet kreftcelle mitokondrier hyperpolariseringen som har vært knyttet til en forbedret evne til å invadere og unngå apoptose 23. Hyperpolariztion av kreft celle mitokondriene kan imidlertid gjøre kreftcellene sårbare for JCTH-4, en gang tatt inn i cellen, kan JCTH-4 erverve en positiv ladning gjennom enzymatisk behandling og kan selektivt tas opp i kreftcellen mitokondriene grunn av deres hyperpolarized naturen. Videre har en rekke mitokondrier tilhørende antiapoptotic proteiner vist seg å være høyt uttrykt i kreftceller som forbyr mitokondriemembranen permeabilization og påfølgende gjennomføring av apoptose som antiapoptotic proteiner av BCL-2 familie av proteiner 24-26.

I nærvær av ulike former for mobilnettet stress, er autophagy utløst somen pro-overlevelse respons, slik at celler for å overleve under ugunstige forhold 2. Over stimulering av denne veien kan imidlertid føre til omfattende nedbrytning av vitale intracellulære komponenter som gir opphav til autophagic celledød tre. Både pro-overlevelse og pro-død autophagic svar har blitt assosiert til kjemoterapeutisk fornærmelse tre. Mitokondriedysfunksjon av JCTH-4 fører til oksidativt stress kan utløse en automatisk standard autophagic respons. Faktisk gjorde vi observere noen autophagic induksjon sammen med apoptose med JCTH-4 behandling (Fig. 2a, b 3a, b 6a, b). Selv TAM har blitt godt etablert som en ER antagonist i ER positiv brystkreft celler, har det nylig blitt vist seg å samhandle med mitokondriene, binding til FMN stedet Complex jeg 10. Videre er TAM en velkjent induser av autophagy tvers mange kreft celletyper 3. Faktisk gjorde TAM føre til en økning i ROS generasjon i isolerte mitochondria (Fig. 5b). Det viste seg imidlertid slik interaksjon for å være utilstrekkelig for å forårsake MMP kollaps (Fig. 5a), men tilstrekkelig til å indusere en typisk pro-overlevelse autophagic respons. Omfattende autophagic induksjon ble observert da JCTH-4 og TAM ble brukt i kombinasjon (Fig. 6a, b), som ble ledsaget av en forbedret cytotoksisk reaksjon (Fig. 4a, b), kan tyde på en pro-død autophagic respons, likevel kreftcellene til slutt dø av apoptose som en følge av mitokondriell permeabilization og apoptogenic faktor utgivelse. Slik allergi ved TAM til JCTH-4 fornærmelse kan tilskrives økningen i ROS generasjon av TAM. Fordi både TAM og JCTH-4 er i stand til å generere oksidativt stress, kan kombinatorisk produksjonen av slikt stress med begge forbindelser føre til omfattende autophagic induksjon gir opphav til en skadelig autophagic respons og / eller omfattende mitochondrial permeabilization og påfølgende apoptose. Ther kombinert behandling påvirker ikke levedyktighet noncancerous fibroblaster (Fig. 4c). Disse funnene indikerer at JCTH-4 alene og i kombinasjon med TAM kan brukes effektivt til å behandle brystkreft og neuroblastom uten å forårsake bivirkninger på noncancerous celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet har vært støttet av Knights of Columbus kapittel 9671 (Windsor, Ontario), og en CIHR Frederick Banting og Charles Best Canada Graduate Scholarship tildelt Dennis Ma. Takk til Robert Hodge og Elizabeth Fidalgo da Silva for deres hjelp med time-lapse mikroskopi. Takk til Katie Facecchia for redigering av time-lapse mikroskopi videoer. Vi ønsker også å takke Sudipa juni Chatterjee og Phillip Tremblay for kritisk gjennomgang av dette manuskriptet. Dette arbeidet er dedikert til minne om Kevin Couvillon som mistet sin kamp mot kreft i 2010.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SH-SY5Y cell line ATCC CRL-2266
Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM Sigma-Aldrich 51448C
Fetal bovine serum GIBCO, by Life Technologies 16000-044
MCF7 cell line ATCC HTB-22
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R 0883
Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) Coriell Institute for Medical Research AG04431B
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30022.01
Tamoxifen citrate salt Sigma-Aldrich T9262
35 mm glass bottom culture dishes MatTek Corp. P35G-014-C
Leica DMI6000 B inverted microscope Leica Microsystems N/A
H–chst 33342 dye Molecular Probes, Life Technologies H3570
Leica DM IRB inverted fluorescence microscope Leica Microsystems N/A
Annexin V AlexaFluor-488 Invitrogen A13201
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154-20ML
Haemocytometer Fisher Scientific 267110
WST-1 reagent Roche Group 11644807001
Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter PerkinElmer, Inc. 1420-011
Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) GIBCO, by Life Technologies T-668
Glass tissue grinder Fisher Scientific K8885300-0002
BioRad protein assay Bio-Rad 500-0001Bottom of Form
Amplex Red Invitrogen A12222
Horseradish peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8125
SpectraMax Gemini XPS Molecular Devices 3126666
Anti-LC3 antibody raised in rabbit Novus Biologicals NB100-2220
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody Abcam ab6728
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody Abcam ab6802
Chemiluminescence peroxidase substrate Sigma-Aldrich CPS160
Monodansylcadaverine Sigma-Aldrich 30432

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Earnshaw, W. C. Apoptosis. A cellular poison cupboard. Nature. 397, 387-389 (1999).
  2. Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol. Cell. 40, 280-293 (2010).
  3. Dalby, K. N., Tekedereli, I., Lopez-Berestein, G., Ozpolat, B. Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeutic strategies in cancer. Autophagy. 6, 322-329 (2010).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Fearon, E. R. Human Cancer Syndromes: Clues to the Origin and Nature of Cancer. Science. 278, 1043-1050 (1997).
  6. Tsokos, M., Scarpa, S., Ross, R. A., Triche, T. J. Differentiation of human neuroblastoma recapitulates neural crest development. Study of morphology, neurotransmitter enzymes, and extracellular matrix proteins. The American Journal of Pathology. 128, 484-496 (1987).
  7. Schwab, M., Westermann, F., Hero, B., Berthold, F. Neuroblastoma: biology and molecular and chromosomal pathology. Lancet Oncol. 4, 472-480 (2003).
  8. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
  9. Howell, A. The endocrine prevention of breast cancer. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 22, 615-623 (2008).
  10. Moreira, P., Custodio, J., Morena, A., Oliveira, C., Santos, M. Tamoxifen and estradiol interact with the flavin mononucleotide site of complex I leading to mitochondrial failure. J. Biol. Chem. 281, 10143-10152 (2006).
  11. Kekre, N., Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin causes early activation of caspase-3 and the flipping of phosphatidyl serine followed by rapid apoptosis specifically in human lymphoma cells. Cancer Chemother. Pharmacol. 56, 29-38 (2005).
  12. McLachlan, A., Kekre, N., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin: a natural anti-cancer compound that targets mitochondria specifically in cancer cells to induce apoptosis. Apoptosis. 10, 619-630 (2005).
  13. Griffin, C., Hamm, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis in clinical leukemia samples with minimal effect on noncancerous peripheral blood mononuclear cells. Cancer Cell Int. 10, 6 (2010).
  14. Griffin, C., Karnik, A., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin selectively targets cancer cell mitochondria and reduces growth of human colon tumor xenografts. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 57-68 (2011).
  15. Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis and autophagy in metastatic prostate cancer cells. Int. J. Oncol. 38, 1549-1556 (2011).
  16. Collins, J., Rinner, U., Moser, M., Hudlicky, T., Ghiviriga, I., Romero, A. E., Kornienko, A., Ma, D., Griffin, C., Pandey, S. Chemoenzymatic synthesis of Amaryllidaceae constituents and biological evaluation of their C-1 analogues. The next generation synthesis of 7-deoxypancratistatin and trans-dihydrolycoricidine. J. Org. Chem. 75, 3069-3084 (2010).
  17. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. Biotechniques. 23, 525-531 (1997).
  18. Madesh, M., Hajnóczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
  19. Simon, H. U., Haj-Yehia, A., Levi-Schaffer, F. Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction. Apoptosis. 5, 415-418 (2000).
  20. Batandier, C., Leverve, X., Fontaine, E. Opening of the mitochondrial permeability transition pore induces reactive oxygen species production at the level of the respiratory chain complex I. J Biol Chem. 279, 17197-17204 (2004).
  21. Lefranc, F., Sauvage, S., Goietsenoven, G. V. an, Mégalizzi, V., Lamoral-Theys, D., Debeir, O., Spiegl-Kreinecker, S., Berger, W., Mathieu, V., Decaestecker, C., Kiss, R. Narciclasine, a plant growth modulator, activates Rho and stress fibers in glioblastoma cells. Mol. Cancer Ther. 8, 1739-1750 (2009).
  22. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
  23. Heerdt, B. G., Houston, M. A., Augenlicht, L. H. Growth properties of colonic tumor cells are a function of the intrinsic mitochondrial membrane potential. Cancer Res. 66, 1591-1596 (2006).
  24. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  25. Casellas, P., Galiegue, S., Basile, A. S. Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial function. Neurochem. Int. 40, 475-486 (2002).
  26. Mathupala, S. P., Rempel, A., Pedersen, P. L. Aberrant glycolytic metabolism of cancer cells: a remarkable coordination of genetic, transcriptional, post-translational, and mutational events that lead to a critical role for type II hexokinase. J. Bioenerg. Biomembr. 29, 339-343 (1997).
Forbedring av apoptotiske og autophagic Induksjon av en roman syntetisk C-1 Analog av 7-deoxypancratistatin i Human Breast adenokarsinom og neuroblastom celler med Tamoxifen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, D., Collins, J., Hudlicky, T., Pandey, S. Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen. J. Vis. Exp. (63), e3586, doi:10.3791/3586 (2012).More

Ma, D., Collins, J., Hudlicky, T., Pandey, S. Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen. J. Vis. Exp. (63), e3586, doi:10.3791/3586 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter