Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

İnsan Meme Adenokarsinom ve Tamoksifen Nöroblastom Hücreleri 7-deoxypancratistatin bir Roman Sentetik C-1 Analog tarafından Apoptotik ve Otofajik İndüksiyon Geliştirilmesi

doi: 10.3791/3586 Published: May 30, 2012

Summary

Biz yerli pancratistatin olarak karşılaştırılabilir anti-kanser aktivitesi ile pancratistatin bir roman analog sentezledik; ilginci, tamoksifen ile kombinatoriyel tedavi noncancerous fibroblastlar üzerinde minimal etkisi ile hedef mitokondriyal tarafından apoptotik ve otofajik indüksiyon köklü bir iyileştirme sağlamıştır. Böylece, tamoksifen ile kombinasyon halinde JCTH-4 güvenli bir anti-kanser terapisi sağlayabilir.

Abstract

Göğüs kanseri, Kuzey Amerika'da kadınlar arasında yaygın kanserler biridir. Iyonizan radyasyon dahil olmak üzere birçok güncel anti-kanser tedavileri, DNA hasarı ile apoptoza yol. Ne yazık ki, bu tür tedavi kanser hücrelerine non-selektif ve normal hücrelerde benzer bir toksisite üretirler. Biz doğal bileşik pancratistatin (PST) tarafından kanser hücrelerinde apoptoz seçici indüksiyon bildirdin. Son zamanlarda, yeni bir PST analoğu, 7-deoxypancratistatin (JCTH-4) ve bir C-1 asetoksimetil türevi de novo sentezi tarafından üretilen ve bazı kanser hücresi hatlarında karşılaştırılabilir seçici apoptosis teşvik edici aktivite sergileyen edildi. Son zamanlarda, otofaji kemoterapiye yanıt yanlısı hayatta kalma ve pro-ölüm mekanizmaları hem olarak malignitelerde ortaya konmuştur. Tamoksifen (TAM) değişmez sayısız kanser yanlısı yaşam otofaji indüksiyonu göstermiştir. Bu çalışmada, tek başına Tam ile kombinasyon halinde JCTH-4 etkinliğini insan göğüs rak gerçekleştirildi hücre ölümü indüklemek içinr (MCF7) ve nöroblastom (SH-SY5Y) hücreleri değerlendirildi. Yalnız JCTH-4 otofaji bazı indüksiyon ile apoptozisi önemli indüksiyon neden ise yalnız TAM otofaji uyarılan, ancak önemsiz hücre ölümü. İlginçtir, kombinatoriyel tedavi apoptotik ve otofajik indüksiyon köklü bir artış sağlamıştır. Biz time-lapse mikroskopi kullanılarak kombinatoryal tedavi ile TAM bağlı otofaji geçiren MCF7 hücrelerinde zamana bağlı morfolojik değişiklikler, JCTH-4-apopitozu ve otofaji, ve hızlandırılmış hücre ölümü izlenir. Biz bu kanser hücrelerinde mitokondriyal hedefleme apoptoz / otofaji ikna etmek için bu bileşiklerin göstermiştir. Önemlisi, bu tedaviler kanserli olmayan insan fibroblast hayatta etkilemedi. Böylece, bu sonuçlar JCTH-4 Tam ile kombinasyon halinde meme kanseri ve nöroblastoma hücrelerine karşı güvenilir ve çok kuvvetli bir anti-kanser tedavisi olarak kullanılan kalabileceğini göstermiştir.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Giriş

Apoptosis, ya da I, programlanmış hücre ölümü yazın, bir ölüm reseptörü için bir ölüm ligand bağlanması, ya özünde yoluyla, dışsal çalışabilir fizyolojik bir işlemdir. Apoptoz intrinsik yol gibi DNA hasarı ve mitokondriyal disfonksiyon olarak hücre içi stres tarafından başlatılır, bu sonuçta mitokondrial membran potansiyeli mitokondri, yayılımı (MMP), mitokondriyal arası boşlukta gelen apoptogenic faktörlerin sürümü permeabilization yol açar ve sonraki yürütme apoptoz 1.

Otofaji bir hücre araları, alçaltır ve plazma membran bütünlüğünü koruyarak kendi hücre içi bileşenlerinin geri dönüşümü olan bir süreç değil, oksidatif stres, hipoksi, protein agrega, beslenme yetersizliğine, büyüme faktörü yoksunluğu gibi hücresel stresler farklı tetiklediği ve bir Hasarlı organeller 2. Ilk aşamalarındaBu sürecin, sitozolik malzeme autolysosomes oluşturmak için lizozom birleşebilirler autophagosomes, çift membranlı veziküller, tarafından yutulmuş edilir. Lizozomal füzyon Mesaj, daha önce autophagosomes tarafından alınan sitozolik malzemeleri lizozomal enzimlerin 2 tarafından yıkılırlar. Bu yolun geniş aktivasyonu otofajik hücre ölümü ya da tip II programlanmış hücre ölümüne 3 yol açabilir hücre içi bileşenlerinin kapsamlı bozulması verir.

Hücre ölümü Evasion kanser 4 işaretlerinden biri olarak kabul edilmiştir. Kanser kontrolsüz hücre büyümesi ve proliferasyonu 5 ile karakterize edilen bir hastalıktır. Özellikle, nöroblastom nöral krest 6 sempatik sinir sisteminin sinir hücreleri gelişmekte doğar. Tüm çocukluk çağı kanserlerinin yaklaşık 7% 9 için muhasebe, küçük çocuklarda en sık görülen solid tümördür. Çok ilerleme bugüne kadar yapılmış olmasına rağmen, bu hastalığın sorun olmaya devamTemel bilim adamları ve klinisyenlerin hem de. Diğer taraftan, kadınlarda meme kanserinin 8 arasında en yaygın kanseridir. Tamoksifen (TAM) sık sık bir östrojen reseptörü (ER) 9 antagonisti gibi hormona duyarlı meme kanserinin tedavisi için kullanılmaktadır. Bununla birlikte, diğer raporlar TAM apoptozis indüksiyonu ek bağımsız mekanizmalar kanıtını oluşturur. Özellikle, TAM onun flavin mononükleotid (FMN) sitesinde 10 mitokondriyal solunum zinciri (MAM) Kompleks I ile etkileşime girer.

PST Hymenocallis littoralis bitki izole doğal bir bileşiktir. Şu anda kullanılan birçok kemoterapötik gelen zıt, bir mitokondriyal 11-15 hedefleme yoluyla çeşitli kanser hücre tiplerinde in seçici olmayan bir şekilde genotoksik, apoptoza neden olduğu gösterilmiştir. Ancak, klinik öncesi ve klinik çalışma bu durumu engellemiştir edilmiştir; onun doğal kaynak ve birçok istenme çok düşük miktarlarda mevcutations yükü kimyasal sentezi. Bu sentez ve gösterime 7-deoxypancratistatin sentetik analogları ve bir C-1 türevi asetoksimetil benzer anti-kanser aktivitesi, H.-TH-4-asetat (JCTH-4) 16 araştırmacılar tarafından gözlenmiştir. Biz şimdi elde güçlü anti-kanser aktivitesi olan bir sentetik PST analog sahiptir. Onun sentezi standardize edilmiştir ve klinik öncesi ve klinik çalışma için yeterli miktarda üretmek kadar ölçeklendirilebilir. Bu yana doğal PST ve TAM her iki hedef mitokondri, o TAM ile birlikte insan meme kanseri ve nöroblastom hücreleri üzerinde PST sentetik bir analoğu kombine etkisini araştırmak ilginç olacaktır.

Bu yazıda, seçici insan nöroblastom olarak JCTH-4 sitotoksisiteye (SH-SY5Y) ve meme adenokarsinomu (MCF7) hücreleri rapor. JCTH-4 mitokondriyal hedefleme tarafından her iki hücre apoptoza başardı; JCTH-4 MMP dağılımı ve reaktif oksijen türleri artış izole mitoch içinde (ROS) üretimine neden oluyorBu kanser hücreleri ondria. Dahası, otofaji MCF7 hücrelerinde JCTH-4 uyarılmıştır. İlginç bir şekilde, JCTH-4 hasara TAM ilavesiyle SH-SY5Y ve MCF7 hücrelerinde JCTH-4'ün sözü edilen etkileri geliştirilmiştir. JCTH-4 ve TAM tek başına ve birlikte MCF7 hücreleri tarafından uyarılan morfolojik değişiklikler, faz kontrast ve parlak bir alan resimlerin time-lapse mikroskobu ile takip edildi. Normal insan fetal fibroblast (NFF) hem de tek başına Tam ile kombinasyon halinde JCTH-4 duyarlılığı önemli bir azalma göstermiştir. Bu nedenle, bu gözlemler meme kanseri ve nöroblastoma karşı güvenilir ve etkili bir kemoterapötik madde olarak, Tam ile JCTH-4, tek başına ve in göstermektedir.

Gereç ve Yöntem

1. Hücre Kültürü

  1. Büyüme ve 2 mM ile desteklenmiş Dulbecco Modifiye Eagles Orta F-12 HAM (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Kanada) ile kültür SH-SY5Y insan nöroblastom hücreleri (ATCC, Kat. CRL-2266, Manassas, VA, ABD) L-glutamine,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 10 mg / ml gentamisin (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Kanada). 37 ° C'de ve% 5 CO2 azından hücreleri korur.
  2. Büyüme ve% 10 FBS standart (Termo ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamı (Sigma-Aldrich Kanada, Toronto, ON, Kanada) kültür MCF7 insan meme kanseri hücreleri (ATCC, Kat. HTB-22, Manassas, VA, ABD) Bilimsel, Waltham, MA) ve 10 mg / ml gentamisin (Kanada, ON Gibco BRL, VWR, Mississauga). 37 ° C'de ve% 5 CO2 azından hücreleri korur.
  3. Dulbecco Modifiye Eagle Orta, Yüksek Glikoz (Thermo Scientific, Waltham, MA, ABD görünüşte normal insan fetal fibroblast (NFF) hücre hattı (Tıbbi Araştırma Coriell Enstitüsü, Kat. AG04431B, Camden, NJ, USA) büyür ve kültür )% 15 FBS ve 10 mg / ml gentamisin (Kanada, ON Gibco BRL, VWR, Mississauga,) ile desteklenmiş. 37 ° C'de ve% 5 CO2 azından hücreleri korur.

2. İlaç Hazırlama

  1. Tamoksifen tarttın (TAM) sitrat tuzu (Sigma-Aldrich, Kat. T9262, Mississauga, ON, Kanada) ve 10 mM stok solüsyonu hazırlamak için DMSO içinde çözülür. Kullanılıncaya kadar -20 ° C'de Mağaza stok solüsyonu. Tüm aracın en az% 0.5 DMSO ihtiva Bu çalışmada kullanılan kontroller.
  2. Daha önce tarif edildiği gibi 16 bromobenzen gelen chemoenzymatic sentezi tarafından üretilen H.-TH-4-asetat (JCTH-4), bir DMSO içinde çözülmüş, bir 1 mM stok solüsyonu hazırlamak için 2,1 Adımını. Kullanılıncaya kadar -20 ° C'de Mağaza stok solüsyonu. Tüm aracın en az% 0.5 DMSO ihtiva Bu çalışmada kullanılan kontroller.

3. Time-Lapse Mikroskopi

  1. Tabak yaklaşık 2.0 x bir sınıf II biyogüvenlik kabine steril şartlarda 35 mm cam alt kültür kaplarına (MatTek Corp Corporation, Kat. P35G-014-C, Ashland, MA, ABD) 10 5 MCF7 hücreleri ve onları büyümeye izin 37 ° C'de ve% 5 CO2.
  2. Hücrelerin 60 ila 70% izdiham ulaştığınızda, 1 mM ile 1 mM JCTH-4 ile onları tedaviDMSO ve tek başına veya kombinasyon halinde bir sınıf II biyogüvenlik kabini içinde, DMSO içinde çözülmüş, bir 10 mM stok solüsyonu kullanılarak 10 uM TAM içinde çözülmüş stok solüsyonu.
  3. 48 saat, 37 derecede ısıtılmış bir odasında yer hücreleri ° C Leica DMI6000 floresan mikroskop bir sahne (Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya) üzerinde% 5 CO 2 ile. Için hücre tedavisinden sonra
  4. LAS AF6000 yazılımı kullanarak, 400x büyütme 18 saat her 5 dakikada bir faz kontrast ve parlak bir alan mikrograflarından almak için mikroskop ayarlayın.

4. Nükleer Boyama

  1. Tabak yaklaşık 2.0 her bir sınıf II biyogüvenlik kabini içinde 6 iyi net altındaki doku kültürü plakası iyi ve onları ° C ve% 5 CO 2 37 büyümeye izin x 10 5 MCF7 veya SH-SY5Y hücreler.
  2. Hücreler% 60-70 birleştiği ulaştığında, DMSO içinde çözülmüş, bir 10 mM stok solüsyonu kullanılarak 1 mM DMSO içinde çözülmüş stok solüsyonu ve 10 uM TAM kullanılarak 1 uM JCTH-4, her ikisi ile muameleyalnız ve sınıf II biyogüvenlik kabini içinde bir arada.
  3. 37 azından bahsedilen tedavileri ile birlikte inkübe hücreleri ° C'de ve% 5 saat 48 (SH-SY5Y hücreleri) veya 72 saat (MCF7 hücre) için CO 2.
  4. Ilaçlar ile arıtma ve hücrelerin inkübasyondan sonra, doğrudan çekirdekler leke 10 uM'lik bir son konsantrasyon muamele hücrelerinin ortam Hoechst 33.342 boya (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) ilave edilir.
  5. Işıktan korunan 5-10 dakika boyunca Hoechst boya ile hücreleri inkübe.
  6. Leica DM IRB ters floresan mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya) sahnede plakası yerleştirin.
  7. 400x büyütmede floresan, faz mikrografikleri atın.

5.. Annexin V Bağlanma Deneyi

  1. Tabak yaklaşık 5,0 x 10 5 MCF7, SH-SY5Y veya NFF hücreler sınıf II biyogüvenlik kabini içinde 10 ml doku kültürü plakaları ve onları ° C ve% 5 CO 2 37 büyümeye olanak sağlar.
  2. WTavuk hücreleri% 60-70 birleştiği ulaşması, DMSO ve 10 uM TAM bir sınıf II biyogüvenlik DMSO içinde çözülmüş, bir 10 mM stok çözeltisi, gerek tek başına ve kombinasyon halinde kullanan içinde çözülmüş, bir 1 mM stok solüsyonu kullanılarak 1 uM JCTH-4 ile muamele dolap.
  3. 37 azından bahsedilen tedavileri ile birlikte inkübe hücreleri ° C'de ve% 5 saat 48 (SH-SY5Y hücreleri) veya 72 saat (MCF7 ve NFF hücre) için CO 2.
  4. 10 mM HEPES, kullanılıncaya kadar 10 mM NaOH, 140 mM NaCl, ve 4 de pH 7.6 ve mağazadan 1 mM CaCI2 ° C ile GKD 2 O Annexin V bağlanma tampon hazırlayın.
  5. Tedavisi ve ilaçlarla hücrelerin inkübasyondan sonra, askıya hücreleri içeren plakalardan ortamını çıkarın ve uygun tedavi ile etiketli her farklı tedavi grubu için ayrı 15 mL konik tüp içine yerleştirin.
  6. Tripsin kullanılarak plakalardan yapışmış olan hücrelerin ayırın.
  7. Tripsin bir sonucu olarak levhadan kaldırılır hücreleri sonra, 15 mL konik yerleştirilir ortamı aspireal adım 5.4 tüp ve tripsin askıya hücreleri ile orijinal plakaları geri koyun.
  8. Elektronik pipet dolgu ve serolojik pipet ile, tripsin hücre çözümü ile Medyanın ve ilgili 15 ml konik tüpler içine tekrar bu karışımı yerleştirin.
  9. 4, 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüje hücreleri ° C, her bir tüpten kaldırmak ve PBS içinde Pastör pipetiyle hücreleri.
  10. 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüje hücreleri, her bir tüpten kaldırmak ve Annexin V bağlanma tampon maddesi 70 ila yaklaşık 50 uL etiketli mikrofüj tüpler Pastör pipetiyle hücreleri.
  11. 10 uM son konsantrasyon için Annexin V AlexaFluor-488 (1:50) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Kanada) ve Hoechst boyası ekleyin ve ışıktan koruyarak 15 dakika inkübe edin.
  12. Aşağıdaki İnkübasyon, mikrofüj tüpler vorteks biri, bir mikroskop ile kayar hücre karışım 7-10 uL ekleme, Mikroskop ile ilgili hücre karışımı bir coverslip üstünlük yerleştirmekfloresan mikroskop ters bir Leica DM IRB üzerine 400x büyütmede (Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya) her görünüm için e slayt ve floresan mikroskop fotoğrafları çekmek, Annexin V ve Hoechst hem görüntüleri. Geriye kalan mikrofüj tüpler her biri her bir deney örneği için tekrarlanır.

6. Hücre Canlılık için Suda Çözünür Tetrazolium Tuz (WST-1) Testi

  1. Bir konfluent T75 şişe veya sınıf II biyogüvenlik kabini içinde 10 MCF7 arasında cm doku kültürü çanak, SH-SY5Y veya NFF hücreleri Trypsinize.
  2. Hücreleri kaldırılmıştır sonra, tripsin ile ortam 5-10 mL ekleyin ve bir 15 mL konik bir tüp içinde ortam hücre süspansiyonu yerleştirin.
  3. 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüje hücreleri, biyogüvenlik dolabının içine geri tüp yeri, her bir tüpten kaldırmak ve hücre peleti boyutuna bağlı olarak, ortam 3-1 yaklaşık mL hücreleri tekrar süspansiyon.
  4. Bir mikrofüj tüpe hücre süspansiyonu yerde 10 uL, tripan mavi boyasıyla (S 10 ul ilave) ON, Kanada igma-Aldrich, Mississauga, ve mikropipet ile karıştırın.
  5. Bir haemocytometer (Hausser Scientific, USA) üzerine Tripan mavi süspanse hücre 10 uL yerleştirin, hücre sayımı, ve orijinal 15 mL konik tüpe hücre süspansiyonu hücrelerinin konsantrasyonu hesaplanır.
  6. MCF7 ve SH-SY5Y ve kaplama için gerekli NFF hücreleri için 5,0 x 10 4 1,5 x 10 5 hücre / ml konsantrasyonları ile seyreltilmiş hücre süspansiyonları oluşturmak için gerekli orijinal hücre süspansiyonu hacmi belirlemek için bu konsantrasyon kullanın.
  7. Plakası 15 ile seyreltilmiş hücre süspansiyonları kullanmak x 10 3 MCF7 veya SH-SY5Y hücre / veya 5,0 x 10 3 NFF hücre / çukur, bir 96 alt yanı berrak doku kültürü plakası, her sıra için seyreltik hücre süspansiyonları ve 100 uL ekleyerek. 37 ° C'de ve% 5 CO2 gece boyunca inkübe hücreleri.
  8. 72 saat için 1 uM JCTH-4 ve 10 uM TAM gerek tek başına ve bir sınıf II biyogüvenlik kabini içinde kombinasyonu ile hücrelerin davranınMCF7 ve NFF hücreleri için, SH ve-SY5Y hücrelerin 48 saat süreyle s.
  9. Tedavi ve ilaç inkübasyondan sonra, 10 uL eklemek WST-1, her kuyuya reaktif (Roche Applied Science, Indianapolis, ABD) ve 37 az 4 saat süreyle plak inkübe ° C ve% 5 CO 2.
  10. Bir Wallac Victor 3 1420 Multilabel Sayaç (Perkin Elmer, Woodbridge, ON, Kanada) 450 nm'de absorbans değerleri alın ve çözücü kontrol gruplarının yüzde olarak ifade eder.

7. Tetramethylrhodamine Metil Ester (TMRM) Boyama

  1. Bir 6 de açıkça alt doku kültürü plakası, bir sınıf ve II biyogüvenlik kabini içinde bir 6 sıra doku kültürü plakası, her sıra in plaka MCF7 hücreler her oyuğuna bir coverslip yerleştirin. Onları 37 ° C ve% 5 CO 2 büyümeye olanak sağlar.
  2. Hücreler% 60-70 birleştiği ulaştığında, DMSO içinde çözülmüş, bir 10 mM stok solüsyonu kullanılarak 1 mM DMSO içinde çözülmüş stok solüsyonu ve 10 uM TAM kullanılarak 1 uM JCTH-4 ile muamele,Bir sınıf II biyogüvenlik kabini tek başına ve kombine olarak hem de.
  3. 37 azından bahsedilen tedavileri ile birlikte inkübe hücreleri ° C ve 72 saat süreyle% 5 CO2.
  4. Ilaçlar ile arıtma ve hücrelerin inkübasyondan sonra, doğrudan çekirdekler gibi tetramethylrhodamine metil ester (TMRM leke 10 uM'lik bir son konsantrasyon muamele hücrelerinin ortam Hoechst 33.342 boya (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) ilave ) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Kanada) 200 nM son konsantrasyon azından.
  5. Işıktan korunan 45 dakika için% 5 CO2 ve 37 ° C'de boyalarla hücreleri inkübe.
  6. Pipet 8 bir mikroskop lamı üzerine medya veya PBS uL ve 6 sıra plaka bir coverslip almak ve cımbız ile aşağı bakacak şekilde hücreler mikroskop lamı üzerine ortam veya PBS üstüne yerleştirin.
  7. (Leica DM IRB ters floresan mikroskop ile floresan mikroskop fotoğrafları, Hoechst ve her görünüm için TMRM mikrograflarından hem alLeica Microsystems, 400x büyütmede Wetzlar, Almanya).

8. Mitokondriyal İzolasyon

  1. 10 mL hipotonik tamponu (1 mM EDTA, 5 mM Tris-HCl, 210 mM mannitol, 70 mM sukroz, 10 uM Leu-pep, 10 uM Pep-A ve 100 uM PMSF) ve reaksiyon tamponu ile ilgili hazırlamak ve bu solüsyonlar tutmak Buzlu.
  2. SH-SY5Y hücrelerinin 10-8 ile ilgili konfluent T75 doku kültür şişeleri ile, hücreler trypsinize tripsin nötralize ortam eklemek 50 mL konik bir tüp içerisinde hücre süspansiyonları toplamak, ve 4, 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj tüpü ° C.
  3. Soğuk PBS ile yaklaşık 10 ila 20 mL süpernatan ve Pastör pipetiyle hücre pelletleri kaldır, 4 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj tüpü ve bir kez Bu yıkama işlemi tekrarlanır.
  4. Süpernatantı ve soğuk hipotonik tampon hücreleri tekrar süspansiyon. Bir cam doku öğütücü ile homojenize elle hücreleri ve 4, 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj hücre lizatı ° C.

9. Amplex Kırmızı Assay

  1. Hücrelerinden izole mitokondri sonra, BioRad protein denemesi (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA USA) ile 1mg/ml BSA bilinen konsantrasyonları (Bovine Serum Albumin) bir standart eğri kullanılarak izole mitokondrinin numunenin protein konsantrasyonu tahmin .
  2. İzole mitokondri çözelti protein konsantrasyonu kullanılarak tahmin edilen, proteinin 20 mg vermek üzere bu çözeltinin hacmi hesaplayabilir. Protein / kuyu 20 ug yüklemek için bir opak 96-kuyulu plakanın her oyuğuna bu hacim Pipeti.
  3. Reaksiyon tampon, ilaç tedavisi (1 uM JCTH-4, ve / veya 10 uM TAM veya 250 uM PQ (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON bir son konsantrasyon sahip olan 100 uL, toplam hacme plakası her bir yanı doldurmak , C6 U/200 uL oranında bir pozitif kontrol olarak kullanılan şehirlerinde girebilirsiniz)), 50 uM'lik bir son konsantrasyon Amplex Red reaktifi, ve yabanturpu peroksidaz (HRP) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Kanada).
  4. 2 saatlik bir inkübasyondan sonra, Ex floresans ölçümler yapın. 560 nm ve Em. 590 bir spectrofluorometer (SpectraMax İkizler XPS, Moleküler Aygıtlar, Sunnyvale, CA, USA) nm.

10. Hücresel Lysate Hazırlık

  1. 10 cm doku kültürü plakaları 60% 70 birleştiği MCF7 hücreler büyür.
  2. 1 uM JCTH-4 ve 10 uM TAM tek başına ve tedavi grubu başına yaklaşık 10 ila 15 plakaları ile 72 saat boyunca kombinasyonu ile muamele hücreleri.
  3. 10 uM Leu-pep, 10 uM Pep-A ve 100 uM PMSF; (pH 7.2 'da 10 mM Tris HCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA,% 1 Triton X-100-hücresi lizis tamponu hazırlamak 4 at) ve mağaza ° C'de kullanılıncaya kadar.
  4. Mekanik bir hücre kazıyıcı ile plaka yüzeylerinde hücreleri çıkarmak ve etiketli 50 hücreleri toplamakml konik tüpler.
  5. 4 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüje tüpler, 4 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca soğuk PBS, santrifüj 600 x g'de tüplerin 10 ila 20 mL süpernatan ve Pastör pipetiyle hücre pelletleri kaldırmak ve bu yıkama işlemi tekrar bir kere.
  6. Süpernatantı ve soğuk hücre lizis tamponunda hücreleri tekrar süspansiyon. Bir cam doku öğütücü ile homojenize elle hücreleri ve 4, 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj hücre lizatı ° C.
  7. Peletler atmak ve kullanılana kadar -20 ° C'de hücre lizatları depolamak.

11. Western Blot Analizleri

  1. BioRad protein testi (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA USA) kullanılarak hücre lizatları protein konsantrasyonu tayin edilir. Bir nitroselüloz zarına SDS-PAGE ve transfer proteine ​​protein maruz örnekleri.
  2. Sonra transfer, bir% 5 w / v süt TBST (Tween-20-tamponlu salin Tris) 1 saat boyunca çözeltisi ile blok membranları.
  3. Bir karınca Prob membranlartavşan büyüdü i-LC3 antikor (1:500) (Novus Biyolojik, Kat. NB100-2220, Littleton, ABD), ya da bir anti-β-aktin antikor fare (1:1000) (Santa Cruz kaldırdı Biyoteknoloji, Inc, Cat. 4 gece No sc-81.178, Paso Robles, CA, USA) ° C
  4. Bir anti-fare (1:2000) veya bir anti-tavşan (1:2000) yaban turpu peroksidaz-konjuge sekonder antikor (Abcam, ve Cat No. Ab6728 ile bir 15 dakika ve TBST ile inkübe iki 5 dakikalık bir yıkamaya tabi zarlar 4 de 1 saat boyunca ab6802, Cambridge, MA, USA) ° C.
  5. Konu membranlar TBST üç ardışık 5 dakikalık yıkama ve gelişmiş kemilüminesans reaktifi (Sigma-Aldrich, CPS160, Mississauga, ON, Kanada) ile protein bantları görselleştirmek.
  6. ImageJ yazılımı kullanarak dansitometrisi analiz yapılmıştır.

12. Monodansylcadaverine (MDC) Boyama

  1. Bir 6, her bir yanı sıra 6 açık alt doku kültürü plakası ve plakanın her MCF7 hücreleri içine yerleştirin coverslipBir sınıf II biyogüvenlik kabini iyi açık alt doku kültürü plakası. Onları 37 ° C ve% 5 CO 2 büyümeye olanak sağlar.
  2. Hücreler% 60-70 birleştiği ulaştığında, bir sınıf II biyogüvenlik DMSO içinde çözülmüş, bir 10 mM stok çözeltisi, her ikisi de tek başına veya kombinasyon halinde kullanan bir 1 mM DMSO içinde çözülmüş stok solüsyonu ve 10 uM TAM kullanılarak 1 uM JCTH-4 ile muamele dolap.
  3. 37 azından bahsedilen tedavileri ile birlikte inkübe hücreleri ° C ve 72 saat süreyle% 5 CO2.
  4. Ilaçlar ile hücre tedavisi ve inkübasyondan sonra, doğrudan 15 dakika süre ile, her sıra için 0.1 mM nihai bir konsantrasyona Monodansylcadaverine (MDC) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Kanada) ilave edilir.
  5. Işıktan korunan 15 dakika için% 5 CO2 ve 37 ° C'de boya ile hücreleri inkübe.
  6. Pipet 30 bir mikroskop lamı üzerine medya veya PBS uL ve 6 sıra plaka bir coverslip alıp hücreleri li mikroskop lamı üzerine ortam veya PBS üstüne yerleştirincımbızla ng aşağı.
  7. Leica DM IRB 400x büyütmede (Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya) floresan mikroskop ters olan, her görünüm için, floresan MDC ve faz mikrografikleri atın.

13. Temsilcisi Sonuçlar

JCTH-4 tarafından İnsan Meme Adenokarsinom ve Nöroblastom Hücrelerinde Apoptozis seçici İndüksiyon: TAM Faaliyet Geliştirme

Apoptoz Seçici indüksiyon doğal EET (Şekil 1a) 11-13 ile çeşitli kanser hücrelerinde gösterilmiştir. Çünkü PST düşük durumu, bu 7-deoxypancratistatin (JCTH-4, Şek. 1b) analogları sentezlenmiş ve bunların insan göğüs adenokarsinoma (MCF7) ve nöroblastoma hücreleri (SH-SY5Y) içindeki, anti-kanser aktivitesi için bunları taranmıştır. Deneylerinin ilk aşamasında, biz MCF7 hücre JCTH-4 ve TAM tek başına tedavi sonrası zamanla morfolojik değişiklikleri izlemek ve kombine istedims. MCF7 hücrelerin 48 saat süreyle solvent tedavisi (kontrol) ile olarak tersine faz resimlerle zaman ayarlı mikroskopi ile üretilen video 1 'de görüldüğü gibi, 18 saat boyunca takip edildi; bu hücreler morfolojisinde büyük bir değişiklik sergiledi. Bunun aksine, 1 uM JCTH-4 tedavi 48 saat sonra, bu hücrelerin, örneğin büzülme olarak apoptoz ile ilişkili morfolojik değişikliklerin sergilenen video 2 'de görüldüğü gibi blebbing, apoptotik gövdesi oluşumu. Öte yandan tek başına MCF7 hücrelerinde TAM tedavisi otofaji (Video 3) ile ilişkili autophagosomes göstergesidir noktalı inklüzyon dahil olmak üzere bir çok farklı morfolojisi üretilir. Çok az apoptotik morfoloji gözlenir ve hücreleri genellikle MCF7 hücreleri tedavi çözücü kontrol karşılaştırılabilir sağlıklı morfolojisi sergilendi. Illustrat olarak 48 saat sonra hücreler MCF7 artan apoptotik morfolojisi ile gösterildiği gibi İlginç bir şekilde, TAM varlığında, JCTH-4 tarafından apoptotik indüksiyon ölçüde arttırdıVideo 4 ed.

Deneylerin ikinci aşamasında biz apopitozis indüksiyon değerlendirmek için floresan boyalar kullanılmaktadır. 72 saat ve sırasıyla MCF7 ve SH-SY5Y hücrelerinde 1 uM JCTH-4 muamele 48 saat sonra, Hoechst boya kullanıldı ve nükleer morfolojisi izlemek için. Sonuçlar MCF7 ve apoptotik indüksiyon göstergesidir SH-SY5Y hücreleri (Şekil 2a, b) apoptotik cisimlerin eşlik özet, parlak boyalı çekirdek belirtti. Yalnız TAM tedavi MCF7 ve SH-SY5Y hücrelerinde minimal apoptotik nükleer morfoloji üremiştir; çekirdeklerin çözücü kontrol grubu (Şekil 2a, b) karşılaştırılabilir Hoechst ile, büyük yuvarlak ve loş boyandı idi. Video 4, MCF7 çekirdeklerinde ve SH-SY5Y hücreleri ile uyumlu olarak, 72 saat sonra kombinasyon tedavisi (Şekil 2a, b) apoptotik morfoloji belirgin bir artış göstermiştir.

Apoptotik indüksiyon doğrulamak için, hücreleri p değerlendirildiBir Annexin V bağlanma analizi 17 üzerinden hosphatidylserine dışsallaştırma, apoptozis için bir belirteç. MCF7 ve SH-SY5Y hücreleri 1 uM yalnız JCTH-4 ile birlikte 10 uM TAM ile apopitozis indüksiyon (Şekil 3a, b doğrulayan, yeşil floresan ile gösterilir, Annexin V bağlayıcı pozitif sırasıyla 72 ve 48 saat için tedavi ). Fosfatidilserin arasında belirgin bir dışa MCF7 gözlendi ve SH-SY5Y hücrelerinin tek başına Tam ile muamele edilmiş ve 72 saat sonra, tüm bahsedilen tedavi grupları (Şekil 3c) ile muamele NFF hücreleri gibi edildi. Bu nedenle, tek başına Tam ile kombinasyon halinde JCTH-4 seçici MCF7 ve SH-SY5Y hücrelerde apoptoza yol açar.

Tek başına JCTH-4 etkisini miktarını ve Tam ile kombinasyon halinde, bir WST-1 hücre canlılığı, aktif hücre metabolizmasının bir göstergesi, esaslı kolorimetrik assay 72 saat ve SH-SY5Y hücreleri için MCF7 gerçekleştirilir ve NFF hücreleri muamele edilmiş, tedavi etmek için 48 saat boyunca.Tek başına 10 uM TAM MCF7 ve SH-SY5Y hücreleri (Şekil 4a, b) hem de anlamlı bir fark sergilenen ise çözücü kontrol grupları ile karşılaştırıldığında, 1 uM JCTH-4,% 50'den fazla aktif hücre metabolizması düşmüştür. İlginç bir şekilde MCF7 ve SH-SY5Y hücrelerinde, JCTH-4 hasara TAM ilavesiyle hücre metabolizmasında sinerjistik bir azalma ile sonuçlanmıştır. NFF hücreleri TAM (Şekil 4c) ile JCTH-4 yalnız ve JCTH-4 hem de önemli ölçüde daha az duyarlı idi. Bu nedenle, JCTH-4 MCF7 ve SH-SY5Y hücrelerinde Tam ile seçici bir sinerjistik etki gösterir.

Mitokondriyal JCTH-4 Hedefleme

JCTH-4 izole mitokondride bütün hücreleri ve ROS üretimi apoptoz mitokondrial zar potansiyelini teşvik etmek için mitokondri hedef olup olmadığını görmek için takip edildi. MCF7 hücreler 72 saat tedavi ve TMRM ile boyandı. 1 uM JCTH-4 kırmızı floresans (Şekil 5a) kaybı gösterdiği MMP, azalmıştır. Bununla birlikte thtek başına 10 uM TAM MMP üzerinde belirgin bir etkisi olduğu süre 10 uM TAM e ek olarak, MMP daha büyük bir dağılımı, gözlenmiştir.

Arttıkça ROS üretimi mitokondriyal membran geçirgenliği ve apoptozis indüksiyonu ile ilişkili olan, ROS üretimi 1 uM yalnız JCTH-4 ve 10 uM TAM, tedavi SH-SY5Y hücrelerden izole mitokondride Amplex Kırmızı boya ile ve kombinasyon 18 değerlendirilmiştir -20. Floresans okumaları göreceli floresans birimleri (RFU) olarak ifade edildi. ROS kuşak artışlar JCTH-4 ve tek başına TAM (Şekil 5B) ile saptandı. İlginç bir şekilde, kombinasyon tedavisi ROS üretiminde daha büyük bir artış elde edilmiştir. Mitokondride ROS üretiminin tanınmış bir indükleyici, PQ, pozitif kontrol olarak kullanılmıştır.

Tarafından otofaji indüksiyonu JCTH-4 ve TAM

Otofajik indüksiyon birçok farklı bileşikler tarafından kemoterapötik hasara ilişkili olduğu gösterilmiştir (Şekil 6a) ile tedavi MCF7 hücreleri mevcuttu. Özellikle, MDC ve yoğunluğuna kombinasyonu tek başına TAM takip tedavisi ve tek başına JCTH-4 ile büyük oldu.

Boyunca otofaji, normal sitozolüne (LC3-I) yer mikrotübül ilişkili protein 1 hafif zincir 3 (LC3), fosfatidiletanolamin ile lipidlenmiş ve autophagosomal membranlar (LC3-II) 2, müteakiben lokalize. Otofaji indüksiyonu doğrulamak için LC3-II düzeyleri western blot analizleri ile 72 saat tedavi MCF7 hücrelerinde değerlendirildi. 10 uM TAM daha büyük müdahale otofajik üretilen ise 1 uM JCTH-4 biraz (Şekil LC3-II LC3-I dönüşüm uyarılan6b). İlginç bir şekilde, kombinasyon tedavisi 3 'den daha büyük LC3-I oranı için bir LC3-II veren, otofaji en büyük indüksiyon ile sonuçlanmıştır. Bu nedenle, bu sonuçlar kombinasyon tedavi ile hücrelerde büyük müdahale ile JCTH-4 ve TAM tek başına ve kombinasyon halinde tarafından MCF7 hücrelerinde otofajik indüksiyon göstermektedir.

Ek Video 1. Çözücü kontrol ile tedavi MCF7 hücrelerin hücresel morfoloji. MCF7 hücreleri 48 ila 66 saat faz kontrast resimleri ile time-lapse mikroskopi kullanılarak yazılan çözücü kontrol tedavisi (DMSO) monitorize edildi. Hücreler 37 ° C'de muhafaza edildi ve% 5 CO2. Görüntüler 400x büyütmede ele geçirildi. video izlemek için tıklayın .

Ek Video 2. JCTH-4 ile tedavi MCF7 hücrelerde apoptotik hücre morfolojisinin Endüksiyon. MCF7 hücreleri 48 ve 66 saat tedavi sonrası zekâ arasında takip edildih 1 uM JCTH-4 faz kontrast resimleri ile time-lapse mikroskobu kullanarak. Hücreler 37 ° C'de muhafaza edildi ve% 5 CO2. Görüntüler 400x büyütmede ele geçirildi. video izlemek için tıklayın .

Ek Video 3. TAM ile tedavi MCF7 hücrelerde otofajik hücresel morfoloji indüksiyonu. MCF7 hücreleri 48 ve faz kontrast resimleri ile time-lapse mikroskobu ile 10 uM TAM ile 66 saat tedavi sonrası arasında takip edildi. Hücreler 37 ° C'de muhafaza edildi ve% 5 CO2. Görüntüler 400x büyütmede ele geçirildi. video izlemek için tıklayın .

Ek Video 4. MCF7 hücrelerinde TAM ile JCTH-4 tarafından Gelişmiş apoptotik morfoloji. MCF7 hücreleri 48 ila 66 saat hem 1 uM JCTH-4 ve faz cont ile time-lapse mikroskobu ile 10 uM TAM ile tedavi sonrası takip edildirast resimleri. Hücreler 37 ° C'de muhafaza edildi ve% 5 CO2. Görüntüler 400x büyütmede ele geçirildi. video izlemek için tıklayın .

Şekil 1
Şekil 1. Sentetik bir 7-deoksi analog PST Yapısal karşılaştırması. Pancratistatin (a) kimyasal yapı (PST). H.-TH-4-asetat (JCTH-4), (b) Kimyasal yapı.

Şekil 2
Şekil 2. JCTH-4 TAM gelişmiş aktivite ile nükleer apoptotik morfoloji indükler. Nükleer morfolojisi (a) Hoechst boya ile belirtilen TAM konsantrasyonu ve JCTH-4 lekeli ile, sırasıyla 72 ve 48 saat boyunca muamele MCF7 ve (b)-SH hücrelerine SY5Y. Kontrol grubu çözücü (D ile tedavi edildiMSO). Görüntüler bir floresan mikroskop 400x büyütmede alındı. Ölçek çubuğu = 15 mikron.

Şekil 3
Şekil 3. JCTH-4 nedenleri dışsallaştırma fosfatidilserin tek başına ve kombine olarak kanser hücrelerinde seçici TAM ile. Dış kaynaklardan fosfatidilserin bağlama Annexin V (a) MCF7 (72 saat), (b)-SH SY5Y (48 saat), ve (c) NFF (72 saat) hücreleri JCTH-4 ile muamele apoptosisi indüksiyon indüksiyonu doğrulamak için değerlendirildi Belirtilen konsantrasyonlarda ve TAM. Kontrol grubu çözücü (DMSO) ile muamele edildi. Görüntüler bir floresan mikroskop 400x büyütmede alındı. Ölçek çubuğu = 15 mikron.

Şekil 4
Şekil 4. TAM JCTH-4 seçici olarak kanser hücrelerinde tarafından canlılığı azalma arttırır. 96-plaka numaralı seribaşı wi edildith (a) MCF7, (b)-SH SY5Y, ve (c) NFF hücreleri ve JCTH-4 ve belirtilen konsantrasyonlarda TAM ile muamele edilmiştir. MCF7 ve NFF hücreler 72 saat boyunca tedavi edildi ve SH-SY5Y 48 saat süreyle tedavi edildi. Ilaç tedavisine ve inkübasyon sonrası, WST-1 reaktifi, her oyuğa ilave edildi ve 450 nm'de absorbans değerleri çekildi ve bir kontrol oranı (DMSO) olarak ifade edilir. İstatistik GraphPad Prism 5.0 sürümü ile yapıldı. Değerler ortalama ± SD 3 bağımsız deneyin quadruplicates itibaren ifade edilir. MCF7: * p <0.001, ** p <0.0001 kontrolü karşı; # p <0.05 karşı 1 uM JCTH-4; † p <0.0001 karşılık 10 uM TAM. SH-SY5Y: * p <0.0005 kontrolü karşı; # p <0.005 karşılık 1 uM JCTH-4; † p <0.005 karşılık 10 uM TAM. NFF: * p <0.005 karşılık 10 uM TAM + MCF7 hücrelerinde 1 uM JCTH-4; # p <0.01 karşı 10 uM TAM + 1 uM JCTH-SH-SY5Y hücrelerinde 4.

Şekil 5,
Şekil 5. JCTH-4 ve mitokondri üzerinde TAM hareket. (A) MCF7 hücreleri lamelleri yetişen ve uyuşturucu belirtilen konsantrasyonları ile tedavi edilen 72 saat ve MMP değerlendirmek TMRM ile boyandı. Kontrol grubu hücreleri çözücü (DMSO) ile muamele edildi. Görüntüler bir floresan mikroskop üzerinde 400x büyütmede ele geçirildi. Ölçek çubuğu = 15 mikron. (B) SH-SY5Y hücrelerin mitokondri İzole belirtilen konsantrasyonlarda JCTH-4 ve TAM ile tedavi edildi ve ROS üretimi horseradish peroksidaz (HRP) varlığında Amplex Kırmızı substrat ile değerlendirildi. Kontrol grubu hücreleri çözücü (DMSO) ile muamele edildi. Parakuatın (PQ) bir pozitif kontrol olarak 250 uM'lik bir konsantrasyonda kullanıldı. Floresans ölçümleri Ex azından muamele 2 saat sonra, elde edildi. 560 nm ve Em. 590 nm ve göreli olarak ifade fluorescence üniteleri (RFU). İstatistik GraphPad Prism 5.0 sürümü kullanılarak elde edilmiştir. Veri benzer eğilimleri ile 3 bağımsız deneyler temsilcisidir. Değerler 1 bağımsız deney quadruplicates arasında ortalama ± SD olarak ifade edilir. * P <0.05, ** p <0.005, *** p <0.001 kontrolü karşı; # p <0.05 karşı 1 uM JCTH-4; † p <0.05 karşı 10 uM TAM; @ p <0.05 karşı 250 uM PQ.

Şekil 6
Şekil 6. TAM JCTH-4 otofajik indüksiyonu arttırır. (A) MCF7 hücreleri lamelleri yetişen ve 72 saat boyunca belirtilen konsantrasyonlarda JCTH-4 ve TAM hakarettir tabi tutuldu. Kontrol grubu hücreleri çözücü (DMSO) ile muamele edildi. Tedavi sonrası, MCF7 hücreleri otofajik vakuol algılamak için MDC ile boyandı. Görüntüler bir floresan mikroskop üzerinde 400x büyütmede ele geçirildi. Ölçek çubuğu = 15 mikron. (b) Western blot analizi 72 saat boyunca ilaç belirtilen konsantrasyonları ile muamele MCF7 hücrelerin hücre lizatları üzerine LC3 ve β-aktin için gerçekleştirilmiştir. Dansitometrik analizler ImageJ yazılımı kullanılarak idam edildi. İstatistik GraphPad Prism 5.0 sürümü ile yapıldı. Değerler ortalama ± SD olarak ifade edildi. * P <0.05, ** p <0.005, *** p <0.0005 karşı kontrol; # p <0.001 karşılık 1 uM JCTH-4; † p <0.001 karşılık 10 uM TAM.

Kısaltmalar Listesi.

ER östrojen reseptörü
FMN flavin mononükleotid
JCTH-4 JC-TH-asetat-4
LC3 mikrotübül ilişkili protein 1 hafif zincir 3
MDC monodansylcadaverine
MMP mitochondrial membran potansiyeli
MRC mitokondriyal solunum zinciri
NFF Normal insan fetal fibroblast
PQ paraquat
PST pancratistatin
RFU göreceli floresans birimleri
ROS Reaktif oksijen türlerinin
TAM Tamoksifen
TMRM tetramethylrhodamine metil ester

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PST ve benzer bileşikler, anti-kanser özelliği 11-15,21 sahip olduğu gösterilmiştir. Biz daha önce böylece apoptogenic faktörler 12,14 salınımı ile apoptozis kanser hücreleri, seçici mitokondri istikrarsızlaştırmak için doğal PST bildirdin. Bu büyük olasılıkla aynı mekanizma yoluyla JCTH-4 eylemleri; JCTH-4 (TMRM boyama (Şekil 5a) ile birlikte görülen, ve SH-SY5Y hücreler izole edilen mitokondri ROS üretimi arttıkça MCF7 hücrelerinde MMP çökmesine neden oldu Şekil 5b), mitokondriyal disfonksiyon göstergesidir. Böylece, JCTH-4 tarafından apoptozis indüksiyonu kanser hücrelerinde mitokondriyal hedefleme ile en olasılıkla gerçek değildir.

Sayısız farklılıklar JCTH-4 ile kanser seçicilik temeli olarak hizmet verebilir noncancerous ve kanser hücreleri arasında bulunmaktadır. Kanser hücreleri yüksek glikoliz bağımlı ve enerji üretimi için mitokondriye daha az vardır; bu olgu denirs Warburg etkisi 22. Kanser hücreleri gibi metabolik aktivite sitoplazmasında yüksek asit yol açar. Sonuç olarak, asidik ortamı sitozolik 23 apoptoz istila ve kaçmak için geliştirilmiş bir yetenek ile bağlantılı olduğunu kanser hücresi mitokondri hiperpolarizasyon katkıda bulunur. Mitokondri kanser hücresi Hyperpolariztion Bununla birlikte, JCTH-4 karşı zayıf kanser hücreleri hale getirebilir; kez hücreye alınması, JCTH-4 enzimatik işleme yoluyla bir pozitif şarj sahip olabilir ve bu seçmeli olarak hyperpolarized doğasından dolayı mitokondri kanser hücresi içine alınabilir. Dahası, mitokondri ilişkili antiapoptotik proteinleri bir dizi yüksek mitokondriyal membran geçirgenliği ve bu tür 24-26 protein Bcl-2 ailesinin antiapoptotik proteinleri gibi apoptoz sonraki yürütme engellemek kanser hücrelerinde eksprese edilmesi gösterilmiştir.

Hücresel stres çeşitli formları varlığında, otofaji olarak tetiklenirhücreleri elverişsiz koşullarda 2 hayatta izin yanlısı bir hayatta kalma tepkisi,. Bu yolun uyarılması fazla ancak, otofajik hücre ölümüne 3 'nün hayati hücre içi bileşenlerin kapsamlı bozulmasına yol açabilir. Yanlısı sağkalım ve yanlısı ölüm Hem otofajik yanıtları kemoterapötik hakaret 3 ilişkilendirilmiştir. Oksidatif strese yol açan JCTH-4 tarafından Mitokondriyal disfonksiyon otomatik varsayılan otofajik yanıtı tetikleyebilir. Gerçekten biz JCTH-4 tedavisi (Şekil 2a, b 3a, b 6a, b) apoptoz ile birlikte bazı otofajik indüksiyon gözlemlemek yaptı. TAM de ER pozitif meme kanseri hücrelerinin bir ER antagonisti olarak kabul edilmiş olmasına rağmen, son zamanlarda Kompleks I 10 FMN sitesine mitokondri, bağlayıcı ile etkileşim için gösterilmiştir. Ayrıca, TAM birçok kanser hücre tipleri 3 çapında otofaji bir tanınmış indükleyicisidir. Gerçekten de, TAM izole mitoch ROS üretimi artışa neden olduondria (Şekil 5B). Ancak, bu tür etkileşimi MMP çöküşü (Şekil 5a), ama tipik bir yanlısı yaşam otofajik tepki ikna etmek için yeterli neden yetersiz olduğunu kanıtladı. JCTH-4 ve TAM yanlısı bir ölüm otofajik yanıt düşündüren gelişmiş bir sitotoksik yanıt (Şekil 4a, b) eşlik ettiği, (Şekil 6a, b) birlikte kullanıldığında zaman Kapsamlı otofajik indüksiyon gözlenmiştir; yine de, mitokondriyal permeabilization ve apoptogenic faktörü yayın bir sonucu olarak, kanser hücrelerinin sonunda apoptosis ölmektedir. JCTH-4 hakaret TAM tarafından bu hassasiyete TAM ROS üretimi artışına bağlanabilir. TAM ve JCTH-4 her iki oksidatif stres üretmek mümkün olduğu için, her iki bileşik ile birlikte bu tür stresi kombinatoryal üretimi zararlı bir otofajik cevabı ve / veya geniş mitokondriyal permeabilization ve müteakip apoptoza yol açan geniş otofajik indüksiyon yol açabilir. Thbirleştirilmiştir tedavisi kanserli olmayan fibroblast (Şek. 4c) canlılığı etkilemez. Bu bulgular, tek başına Tam ile kombinasyon halinde JCTH-4 kanserli olmayan hücreleri üzerinde ters etkiye neden olmadan meme kanseri ve nöroblastoma tedavi etmek için etkili bir şekilde kullanılabilir göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma Columbus Bölüm 9671 (Windsor, Ontario), ve bir CIHR Frederick Banting ve Dennis Ma verilen Charles Best Kanada Yüksek Lisans Bursu Şövalyeleri tarafından desteklenmiştir. Time-lapse mikroskobu ile yardım için Robert Hodge ve Elizabeth Fidalgo da Silva için teşekkür ederiz. Hızlandırılmış mikroskopi düzenleme için videoları Katie Facecchia için teşekkür ederiz. Biz de bu yazının eleştiri için Sudipa Haziran Chatterjee ve Phillip Tremblay teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma 2010 yılında kansere karşı verdiği savaşı kaybetti Kevin Couvillon anısına adanmıştır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SH-SY5Y cell line ATCC CRL-2266
Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM Sigma-Aldrich 51448C
Fetal bovine serum GIBCO, by Life Technologies 16000-044
MCF7 cell line ATCC HTB-22
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R 0883
Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) Coriell Institute for Medical Research AG04431B
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30022.01
Tamoxifen citrate salt Sigma-Aldrich T9262
35 mm glass bottom culture dishes MatTek Corp. P35G-014-C
Leica DMI6000 B inverted microscope Leica Microsystems N/A
H–chst 33342 dye Molecular Probes, Life Technologies H3570
Leica DM IRB inverted fluorescence microscope Leica Microsystems N/A
Annexin V AlexaFluor-488 Invitrogen A13201
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154-20ML
Haemocytometer Fisher Scientific 267110
WST-1 reagent Roche Group 11644807001
Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter PerkinElmer, Inc. 1420-011
Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) GIBCO, by Life Technologies T-668
Glass tissue grinder Fisher Scientific K8885300-0002
BioRad protein assay Bio-Rad 500-0001Bottom of Form
Amplex Red Invitrogen A12222
Horseradish peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8125
SpectraMax Gemini XPS Molecular Devices 3126666
Anti-LC3 antibody raised in rabbit Novus Biologicals NB100-2220
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody Abcam ab6728
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody Abcam ab6802
Chemiluminescence peroxidase substrate Sigma-Aldrich CPS160
Monodansylcadaverine Sigma-Aldrich 30432

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Earnshaw, W. C. Apoptosis. A cellular poison cupboard. Nature. 397, 387-389 (1999).
  2. Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol. Cell. 40, 280-293 (2010).
  3. Dalby, K. N., Tekedereli, I., Lopez-Berestein, G., Ozpolat, B. Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeutic strategies in cancer. Autophagy. 6, 322-329 (2010).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Fearon, E. R. Human Cancer Syndromes: Clues to the Origin and Nature of Cancer. Science. 278, 1043-1050 (1997).
  6. Tsokos, M., Scarpa, S., Ross, R. A., Triche, T. J. Differentiation of human neuroblastoma recapitulates neural crest development. Study of morphology, neurotransmitter enzymes, and extracellular matrix proteins. The American Journal of Pathology. 128, 484-496 (1987).
  7. Schwab, M., Westermann, F., Hero, B., Berthold, F. Neuroblastoma: biology and molecular and chromosomal pathology. Lancet Oncol. 4, 472-480 (2003).
  8. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
  9. Howell, A. The endocrine prevention of breast cancer. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 22, 615-623 (2008).
  10. Moreira, P., Custodio, J., Morena, A., Oliveira, C., Santos, M. Tamoxifen and estradiol interact with the flavin mononucleotide site of complex I leading to mitochondrial failure. J. Biol. Chem. 281, 10143-10152 (2006).
  11. Kekre, N., Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin causes early activation of caspase-3 and the flipping of phosphatidyl serine followed by rapid apoptosis specifically in human lymphoma cells. Cancer Chemother. Pharmacol. 56, 29-38 (2005).
  12. McLachlan, A., Kekre, N., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin: a natural anti-cancer compound that targets mitochondria specifically in cancer cells to induce apoptosis. Apoptosis. 10, 619-630 (2005).
  13. Griffin, C., Hamm, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis in clinical leukemia samples with minimal effect on noncancerous peripheral blood mononuclear cells. Cancer Cell Int. 10, 6 (2010).
  14. Griffin, C., Karnik, A., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin selectively targets cancer cell mitochondria and reduces growth of human colon tumor xenografts. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 57-68 (2011).
  15. Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis and autophagy in metastatic prostate cancer cells. Int. J. Oncol. 38, 1549-1556 (2011).
  16. Collins, J., Rinner, U., Moser, M., Hudlicky, T., Ghiviriga, I., Romero, A. E., Kornienko, A., Ma, D., Griffin, C., Pandey, S. Chemoenzymatic synthesis of Amaryllidaceae constituents and biological evaluation of their C-1 analogues. The next generation synthesis of 7-deoxypancratistatin and trans-dihydrolycoricidine. J. Org. Chem. 75, 3069-3084 (2010).
  17. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. Biotechniques. 23, 525-531 (1997).
  18. Madesh, M., Hajnóczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
  19. Simon, H. U., Haj-Yehia, A., Levi-Schaffer, F. Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction. Apoptosis. 5, 415-418 (2000).
  20. Batandier, C., Leverve, X., Fontaine, E. Opening of the mitochondrial permeability transition pore induces reactive oxygen species production at the level of the respiratory chain complex I. J Biol Chem. 279, 17197-17204 (2004).
  21. Lefranc, F., Sauvage, S., Goietsenoven, G. V. an, Mégalizzi, V., Lamoral-Theys, D., Debeir, O., Spiegl-Kreinecker, S., Berger, W., Mathieu, V., Decaestecker, C., Kiss, R. Narciclasine, a plant growth modulator, activates Rho and stress fibers in glioblastoma cells. Mol. Cancer Ther. 8, 1739-1750 (2009).
  22. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
  23. Heerdt, B. G., Houston, M. A., Augenlicht, L. H. Growth properties of colonic tumor cells are a function of the intrinsic mitochondrial membrane potential. Cancer Res. 66, 1591-1596 (2006).
  24. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  25. Casellas, P., Galiegue, S., Basile, A. S. Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial function. Neurochem. Int. 40, 475-486 (2002).
  26. Mathupala, S. P., Rempel, A., Pedersen, P. L. Aberrant glycolytic metabolism of cancer cells: a remarkable coordination of genetic, transcriptional, post-translational, and mutational events that lead to a critical role for type II hexokinase. J. Bioenerg. Biomembr. 29, 339-343 (1997).
İnsan Meme Adenokarsinom ve Tamoksifen Nöroblastom Hücreleri 7-deoxypancratistatin bir Roman Sentetik C-1 Analog tarafından Apoptotik ve Otofajik İndüksiyon Geliştirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, D., Collins, J., Hudlicky, T., Pandey, S. Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen. J. Vis. Exp. (63), e3586, doi:10.3791/3586 (2012).More

Ma, D., Collins, J., Hudlicky, T., Pandey, S. Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen. J. Vis. Exp. (63), e3586, doi:10.3791/3586 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter