Summary
3D системы культивирования человеческих хондроцитов суставного к высоким уровням синовиальной жидкости описывается. Синовиальная жидкость отражает наиболее естественный микросреду для суставного хряща, и может быть легко получена и сохранена. Эта система при этом может быть использована для изучения регенерации хряща и для скрининга терапии для лечения артрита.
Protocol
3D системы для культивирования человеческих хондроцитов суставного в синовиальной жидкости
В этой работе мы инкапсулированные человеческих хондроцитов суставного в альгинат бисера с использованием модифицированного производства, предложил протокол инкапсуляции (Lonza, и 31). Используя эти 3D конструкции, мы разработали системы для культивирования клеток в культуральной среде, содержащей разнообразные проценты человека синовиальной жидкости и оценили эти 3D-конструкции для экспрессии генов хряща.
1. Подготовка человека суставные хондроциты (HAC) для трехмерных (3D) инкапсуляции
- Оттепель флакон (1 мл) человеческих хондроцитов суставного (HAC) (Lonza) (Прохождение 2) в 37 ° С водяной бане в течение 1 мин.
- Смешайте с 1 мл питательной среды хондроцитов (Lonza) и центрифуге при 3000 оборотов в минуту в течение 3-5 мин для сбора клеток. Удалите супернатант.
- Ресуспендируют осадок клеток в хондроцитов питательной среды (Lonza).
- Пластина клеток в 10 см тканикультуры пластины (BD Biosciences), и культуры в средствах массовой информации хондроцитов роста (Lonza), пока клетки вырожденная. HACs должны быть использованы на пассаж не выше, чем 3 или 4 (P3 или P4).
- Вымойте HACs на 155 мм пластины с NaCl вместо стандартных PBS, после чего trypsinzation собирать клетки для альгината бусинка инкапсуляции. Как только клетки отделяются, спин вниз клеток на 3000rpm за 5 мин. Клетки готов к 3D инкапсуляции.
2. Инкапсуляция HACs в 3D бисером
Ресуспендируют HACs в 1,2% раствор альгината (Sigma) с плотностью 8x10 5 клеток / мл. Сотовые номера были определены до инкапсуляции, используя стандартный счетчик клеток. Это очень важно, чтобы хорошо перемешать, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток в бисер.
- Внесите HAC / смесь альгината раствора в 12 мл шприц прилагается к 22-иглы (Tyco Healthcare, Inc.)
- Между тем, готовить 50 мл стакан с 102 мМ CaCl 2 в объеме 5 раз больше, HAC / aginate решение. Место мешалкой внутри стакана и размешать 102 мМ CaCl 2 раствор медленно (примерно 150 оборотов в минуту).
- Держите шприц наконечником около 6 дюймов над поверхностью CaCl 2 раствора и добавить HAC / альгинат смесь в CaCl 2 решение по каплям. В общем, в результате бисером альгината 2 мм в диаметре с инкапсуляцией плотности приблизительно 10 4 клеток / гранулы. Примечание: высота шприц над CaCl 2 решение имеет важное значение. Более короткие расстояния приведет к слезоточивый падение форме, а не сферическую форму шариков, вызывая неравномерное механической целостности и клеточной инкапсуляции.
- Пусть бисером переполох в CaCl 2 решения в течение 20-25 мин. Хотя другие протоколы инкапсуляции альгинат указывают гораздо короче инкубационный период от 10 минут, мы обнаружили, что более длительное время инкубации с CaCl 2 решения расширенной целостности бытьобъявлений.
- Удалить CaCl 2 решения, мыть бусин 2-3 раза в 2-3 объемах NaCl, а затем один раз в хондроцитов среду дифференцирования (Lonza). Хотя другие альгинат бусинка протоколы инкапсуляции связаны с использованием фильтра для стиральных выше процедур, мы обнаружили, что альгинат бисером часто попасть в ловушку фильтр и высыхания, тем самым снижая эффективность инкапсуляции. Мы обнаружили, что наиболее эффективным, чтобы бусы оседают на дно стакана, прежде чем выбросить решение.
- Используйте стандартные лопаточку, чтобы передача бусин в культуру блюд. Мы обычно культуры 12 бусин на 3 см и в течение 2 дней в хондроцитов среднего роста, чтобы хондроциты, чтобы приспособиться к инкапсуляции процесса в среде они были выращены в перед переключением на хондроцитов среду дифференцирования (Lonza) с синовиальной жидкости.
3. Культура хондроцитов в синовиальной жидкости культуральной среде
- Свежий синовиальной жидкости может быть получен из оutpatient клинике (Мы получили синовиальной жидкости из Медицинского центра Тафтс). Синовиальной жидкости могут быть переданы в 15 мл пробирки сокола в лабораторию, и сразу же центрифугировали при 3000 оборотов в минуту для 15 минут, чтобы удалить ячейку мусора. Алиготе бесклеточной синовиальной жидкости в пробирки на 1,5 мл микроцентрифужных, чтобы избежать повторного замораживания-оттаивания. Супернатант можно хранить при температуре -80 ° C до использования.
- До культивирования, смешать синовиальной жидкости с хондроцитов среду дифференцирования (МЧР, Lonza) при различных соотношениях объемные, с постоянной концентрации 100 мМ аскорбиновой кислоты и 9 мм CaCl 2 (это малое количество CaCl 2 является обеспечение целостности альгинат бусы).
- Держите пластинку на качалке платформе в 37 ° С инкубатор (частота качания: около 75 раз / мин), чтобы помочь питательных распределения внутри альгинат бисером, и уменьшить стук бисером. Это особенно важно, поскольку мы эти культуре хондроцитов в течение длительного периода времени (до 4 недель). Примечание: В то время хондроцитов роста и дифференциации средств массовой информации (Lonza) содержат два широко используемых антибиотиков гентамицин и амфотерицин, мы не дополнением любого антибиотики, когда мы использовали различные процент синовиальной жидкости для культивирования хондроцитов. Отсутствие загрязнения был когда-либо наблюдавшихся.
- Изменение СМИ смеси каждые 2-3 дня. Вязкость синовиальной жидкости является основным препятствием на культивирование хондроцитов инкапсулированных в альгинат бисером при длительном культур. Мы обнаружили, что наиболее эффективным для разбавления синовиальной жидкости-добавляемой среде с 102 мм CaCl 2 (50% V / V), который также укрепляет целостность альгинат бисером. Таким образом, среда может медленно удаляются при помощи пипетки, не повреждая бисером.
4. Урожай HACs в альгинат шарики для анализа экспрессии генов
Особое внимание должно быть принято при сборе HACs из альгината шарики для анализа экспрессии генов.
- Вымойте альгинат бисером 3 TiМЧС в 102 мМ CaCl 2 в течение приблизительно 5 минут каждый раз.
- Получить хондроциты, добавив 55 мм NaCitrate в объеме в 4-5 раз, что из бисера. Важно, что альгинат бисером полностью погружены в NaCitrate решение. Встряхните или рок в течение 20-30 мин.
- Спином вниз клетки и отбрасывать супернатант.
- Для ПЦР-анализа, ресуспендируют осадок клеток в ячейке буфера для лизиса (Qiagen РНК изоляции комплект), и приступить к очистке РНК.
5. Fix HACs в альгинат шарики для гистологического анализа
Особое внимание должны быть приняты для урожая HACs от 3D шарики для гистологического анализа.
- Вымойте альгинат бисером 3 раза в 102 мМ CaCl 2 в течение приблизительно 5 минут каждый раз. Чтобы полностью смыть вязкой синовиальной жидкости, мы обнаружили, что наиболее эффективным для умывания хондроцитов среду дифференцирования (Lonza) в течение ночи, покачиваясь в 37 ° С инкубатор (частота качания: около 75 разс / мин). Хондроцитов средний рост был использован для обеспечения хондроцитов выживания в этой длительной стирки и для обеспечения максимального проникновения закрепитель.
- Fix бисером в 70% этанола в одночасье, и приступить к гистологического анализа. Для выполнения DAPI окрашивания, инкубировать альгинат бусины с DAPI решение (500ng/ml) за 1 час при легком качалки и промыть 3 раза с 102 мм CaCl 2 в течение 15 минут каждый раз. DAPI изображения затем можно смотреть под флуоресцентным микроскопом. Бусины могут быть также секционные для Альциановый синий и H & E окрашивания.
6. Представитель Результаты
Наши 3D метод культивирования для человека хондроцитов в высокий процент синовиальной жидкости изображен на схеме показана на рис.1. После человеческих хондроцитов была представлена в альгинат бусы, им было позволено расти в среде с различной отношения синовиальной жидкости. Из-за вязкости синовиальной жидкости, важно, чтобыкультуре хондроцитов при постоянных условиях качалка для предотвращения слипания хряща конструкций и обеспечить равномерное распределение питательных веществ. Важно также, чтобы вымыть альгинат бисером широко, прежде чем извлекать хондроцитов, так что фиксация или лизис буфера может проникнуть шариков (рис. 1). Светлые поля (BF) изображения хондроцитов в альгинат бисер показано на рис.2. DAPI окрашивание проводилось для подтверждения usniform распределение клеток в шарики (рис. 2). В конце 21-дневного периода культивирования, анализа экспрессии генов была выполнена QRT-PCR. Ссылка гена GAPDH была использована для нормализации для всех ПЦР, так как он был определен как один из самых надежных генов ведения КПЦР анализ на хондроциты 32. Пример показан на рис. 3, где мы проанализировали результаты от человеческих хондроцитов суставного культивировали в синовиальной жидкости объединения с шести пациентов с остеоартритом. В соответствии с тем, что из хондроцитовLonza были расширены в 2D культур, которое неизбежно приведет к де-дифференциация 33, мы обнаружили, что День 0 хондроцитов выразил минимальных уровней хрящей генов матрицы (рис. 3). 3D культивирование хондроцитов с хондроцитов среду дифференцирования (Lonza) или среде, дополненной синовиальной жидкости значительно увеличили хряща экспрессии генов коллагена, агрекана и MMP13, что указывает на хондроцитов повторно дифференциация по 21-й день (рис. 3) 34. Увеличение доли синовиальной жидкости в средствах массовой информации привели к сопоставимым уровнем хрящевой ткани маркеров коллагена II и агрекана экспрессию мРНК (рис.3а и 3B). Кроме того, хондроциты культивируют в 100% синовиальной жидкости даже выставлялись снижение хряща разрушающего фермента MMP13 экспрессию мРНК по сравнению с теми, культивировали в среду в одиночку (Fig.3C). Интересно, что уровень экспрессии гибели клеток индикатор каспазы 3 постепенно уменьшается с увеличением отношения синовиальной жидкости, предполагая, что сynovial культивирования жидкости привело к снижению апоптоза уровней (рис. 3D). Таким образом, наши результаты показывают, что культивирование человеческих хондроцитов суставного к высоким уровням синовиальной жидкости в 3D настройка возможности технологии.
Таблицы и рисунки
Рисунок 1. Принципиальная схема метода к культуре человеческих хондроцитов суставного в высокий процент синовиальной жидкости в 3D бисером альгината. Во-первых, хондроциты и альгинат решения носят смешанный характер. При применении каплям, чтобы раствор CaCl 2, хондроциты закреплены в сшитый Са-альгината бисером гидрогеля. Эти 3D-конструкций, затем культивировали в среде хондроцитов дифференциации (Lonza) при изменении отношения человека синовиальной жидкости. После 21 дней культивирования в качалке состоянии, альгинат бисером содержащие клетки промывают широко после чего клетки извлекаются для геннойвыражение анализа.
Рисунок 2. Светлого поля (BF) и DAPI изображения человеческих хондроцитов суставного инкапсулированные культур с 0%, 30%, 50%, 70% и 100% синовиальной жидкости. Хондроциты были сферическую форму во всех условий культивирования. Изображения светлого поля (BF) и DAPI были наложены, чтобы подтвердить местоположение и распределение хондроцитов. Вставки, увеличенных изображений. Стрелки, колокализации хондроцитов в BF и изображения DAPI окрашивания.
Рисунок 3. QRT-PCR анализ инкапсулированных человеческих хондроцитов суставного днем 0 (D0) после 21 дней культивирования (D21) в среде с различной отношения синовиальной жидкости (SF) (0%, 30%, 50%, 70 % и 100%). Результаты четырех независимых выборок показаны здесь. GAPDH был использован в качестве внутреннего отсчета для всех PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом докладе, мы разработали метод, который позволяет культуре человеческих хондроцитов суставного в 3D среде в среде, содержащей высокие концентрации человеческого синовиальной жидкости. Синовиальная жидкость является одним из основных компонентов, составляющих природной среды в полость сустава, где суставных хондроцитов проживают. Тем не менее, вязкость синовиальной жидкости была одной из основных задач трехмерного длительного культивирования хондроцитов. Для преодоления проблемы поддержания даже питательных распределения в 3D агрегации построить в вязкой среде и не допустить, мы поставили хряща конструкций при постоянном движении с нежным качалки. Для повышения структурной целостности хряща конструкции, мы изменили традиционную процедуру посева хондроцитов в альгинат гидрогеля в том числе оптимизация времени для бортовых образование и средства массовой информации меняющейся процедуре 31. Такие процедуры необходимы, когдахряща конструкций обрабатываются в вязкой синовиальной жидкости при длительном культур.
Мы считаем, что этот метод позволит нам изучать биологию человека суставные хондроциты в их естественной milleu, синовиальной жидкости. Одним из потенциальных беспокоит то, что реагент диффузия не может быть идеальным для хондроцитов инкапсулированных в альгинат бисером и выращенные в вязкой среде. Таким образом, для изучения действия некоторых реагентов на инженерии хрящей, лучше диффузии может быть достигнуто за счет уменьшения размера альгинат бисером, и с помощью перфузионной системы для облегчения распределения реагента в синовиальной жидкости. Хотя наш представитель результат был получен от культивирования нормальных человеческих хондроцитов в синовиальной жидкости производным от пациентов с остеоартритом, мы считаем, этот метод может быть экстраполированы на использование синовиальной жидкости из иного здорового человека или других здоровых животных позвоночных. Потому что синовиальной жидкости деятельность может быть соотнесена с комбинаторной activiсвязей многих биохимических факторов, присутствующих в жидкости, чистый эффект синовиальной жидкости на хондроцитов экспрессии генов в нашей системе может быть связано с тяжестью заболевания и в конечном итоге поможет нам понять, внутрисуставного среды до и после лечения. Кроме того, наш метод может также привести к возможности использования собственных синовиальной жидкости пациентов для культивирования аутологичных хондроцитов для восстановления суставного хряща, которое индивидуально. Для этого, эта система может дать ответ на изучении биомеханических сил, действующих через синовиальной жидкости по инженерии хрящей, а 35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Робина Най (Тафтс Медицинский центр), Tomoya Uchimura и Дана Кэрнс (Университет Тафта) за оказание помощи в синовиальной жидкости хранения и центрифугирования. Эта работа финансировалась NIH (1R01AR059106-01A1) для LZ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table of specific reagents and equipment: | |||
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Alginate (Alginic Acid sodium salt) | Sigma-Aldrich | A2158-250G | 2.4% solution stored at 40°C |
| Calcium Chloride Dihydrate, Granular | JT Baker | A19339 | |
| Chondrogenic Growth media | Lonza Inc. | CC-3156 (base media) | |
| CC-4409 (supplement) | |||
| Chondrogenic Differentiation Media | Lonza Inc. | CC-3226 (base media) | |
| CC-4408 (supplement) | |||
| Human articular chondrocytes | Lonza Inc. | CC-2550 | |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RNeasy mini kit (for RNA extraction) | Qiagen | 74104 | |
| PCR reagents: SYBR-green | Quanta Biosciences | 95053-500 | |
| 12 ml syringe | Tyco Healthcare, Covidien | 512852 | |
| 22-Gague Hypodermic Needle | Tyco Healthcare, Covidien | 8881 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Platform rocker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Vari-mix | |
| Collagen IIa-forward | 5’-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3’ | ||
| Collagen IIa-reverse | 5’-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3’ | ||
| MMP13-forward | 5’-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3’ | ||
| MMP13-reverse | 5’-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3’ | ||
| Caspase 3-forward | 5’-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3’ | ||
| Caspase 3-reverse | 5’-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3’ | ||
References
- Centers for Disease Control and P. Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations--United States, 2005-2030. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).
- Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E. Prevalence and correlates of arthritis-attributable work limitation in the US population among persons ages 18-64: 2002 National Health Interview Survey Data. Arthritis Rheum. 57, 355-363 (2007).
- Chung, C., Burdick, J. A. Engineering cartilage tissue. Adv. Drug. Deliv. Rev. 60, 243-262 (2008).
- Glowacki, J. In vitro engineering of cartilage. J. Rehabil. Res. Dev. 37, 171-177 (2000).
- Chokalingam, K., Hunter, S. A., Gooch, C. 3D-In vitro Effects of Compression and Time in Culture on Aggregate Modulus and on Gene Expression and Protein content of Collagen Type II in Murine Chondrocytes. Tissue Eng. Part A. , (2009).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Goldring, M. B., Goldring, S. R. Osteoarthritis. J. Cell. Physiol. 213, 626-634 (2007).
- Zvaifler, N. J., Firestein, G. S. Cytokines in chronic inflammatory synovitis. Scand. J. Rheumatol. Suppl. 76, 203-210 (1988).
- Rhee, D. K., Marcelino, J., Baker, M. The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth. J. Clin. Invest. 115, 622-631 (2005).
- Campo, G. M., Avenoso, A., Nastasi, G. Hyaluronan reduces inflammation in experimental arthritis by modulating TLR-2 and TLR-4 cartilage expression. Biochim. Biophys. Acta. , (2011).
- van de Lest, C. H., van den Hoogen, B. M., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Biorheology. 37, 45-55 (2000).
- Saxne, T., Heinegard, D., Wollheim, F. A. Human arthritic synovial fluid influences proteoglycan biosynthesis and degradation in organ culture of bovine nasal cartilage. Coll. Relat. Res. 8, 233-247 (1988).
- Lee, D. A., Salih, V., Stockton, E. F., Stanton, J. S., Bentley, G. Effect of normal synovial fluid on the metabolism of articular chondrocytes in vitro. Clin. Orthop. Relat. Res. , 228-238 (1997).
- Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte nonresponsiveness to insulin-like growth factor 1 in experimental arthritis. Arthritis Rheum. 32, 894-900 (1989).
- Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van Wyk, J. J., van de Putte, L. B. Insulin-like growth factor stimulation of chondrocyte proteoglycan synthesis by human synovial fluid. Arthritis Rheum. 32, 66-71 (1989).
- Joosten, L. A., Schalkwijk, J., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte unresponsiveness to insulin-like growth factor-1. A novel pathogenetic mechanisms for cartilage destruction in experimental arthritis. Agents Actions. 26, 193-195 (1989).
- Schuerwegh, A. J., Dombrecht, E. J., Stevens, W. J. Synovial fluid and peripheral blood immune complexes of patients with rheumatoid arthritis induce apoptosis in cytokine-activated chondrocytes. Rheumatol. Int. 27, 901-909 (2007).
- Hegewald, A. A., Ringe, J., Bartel, J. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue Cell. 36, 431-438 (2004).
- Xu, Q. R., Dong, Y. H., Chen, S. L., Bao, C. D., Du, H. Degeneration of normal articular cartilage induced by late phase osteoarthritic synovial fluid in beagle dogs. Tissue Cell. 41, 13-22 (2009).
- Kruger, J. P., Endres, M., Neumann, K., Haupl, T., Erggelet, C., Kaps, C. Chondrogenic differentiation of human subchondral progenitor cells is impaired by rheumatoid arthritis synovial fluid. J. Orthop. Res. 28, 819-827 (2010).
- Steinhagen, J., Bruns, J., Niggemeyer, O. Perfusion culture system: Synovial fibroblasts modulate articular chondrocyte matrix synthesis in vitro. Tissue Cell. 42, 151-157 (2010).
- Yang, K. G., Saris, D. B., Verbout, A. J., Creemers, L. B., Dhert, W. J. The effect of synovial fluid from injured knee joints on in vitro chondrogenesis. Tissue Eng. 12, 2957-2964 (2006).
- Skoog, V., Widenfalk, B., Ohlsen, L., Wasteson, A. The effect of growth factors and synovial fluid on chondrogenesis in perichondrium. Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand. Surg.. 24, 89-95 (1990).
- Nuver-Zwart, I., Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Effects of synovial fluid and synovial fluid cells on chondrocyte metabolism in short term tissue culture. J. Rheumatol. 15, 210-216 (1988).
- Beekhuizen, M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Koevoet, W. Osteoarthritic synovial tissue inhibits proteoglycan production in human osteoarthritic cartilage; Establishment and characterisation of a long-term coculture. Arthritis Rheum. , (2011).
- Rodrigo, J. J., Steadman, J. R., Syftestad, G., Benton, H., Silliman, J. Effects of human knee synovial fluid on chondrogenesis in vitro. Am. J. Knee. Surg. 8, 124-129 (1995).
- van den Hoogen, B. M., van de Lest, C. H., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Br. J. Rheumatol. 37, 671-676 (1998).
- Webb, G. R., Westacott, C. I., Elson, C. J. Osteoarthritic synovial fluid and synovium supernatants up-regulate tumor necrosis factor receptors on human articular chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage. 6, 167-176 (1998).
- Kook, S. H., Son, Y. O., Lee, K. Y. Hypoxia affects positively the proliferation of bovine satellite cells and their myogenic differentiation through up-regulation of MyoD. Cell. Biol. Int. 32, 871-878 (2008).
- Knobloch, T. J., Madhavan, S., Nam, J., Agarwal, S., Agarwal, S. Regulation of chondrocytic gene expression by biomechanical signals. Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 18, 139-150 (2008).
- Guo, J. F., Jourdian, G. W., MacCallum, D. K. Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads. Connect. Tissue. Res. 19, 277-297 (1989).
- Toegel, S., Huang, W., Piana, C. Selection of reliable reference genes for qPCR studies on chondroprotective action. BMC. Mol. Biol. 8, 13-13 (2007).
- Lin, Z., Fitzgerald, J. B., Xu, J. Gene expression profiles of human chondrocytes during passaged monolayer cultivation. J. Orthop. Res. 26, 1230-1237 (2008).
- Goessler, U. R., Bieback, K., Bugert, P. Human chondrocytes differentially express matrix modulators during in vitro expansion for tissue engineering. Int. J. Mol. Med. 16, 509-515 (2005).
- Anat, J. 121, 107-118 (1976).
