Summary
אנו מציגים assay תפוקה גבוהה תזרים cytometric כדי לקבוע את פעילות phagocytic של אנטיגן ספציפי של נוגדנים דגימות קליניות, ניצול פלורסנט אנטיגן מצופים חרוזים קו תא monocytic לבטא קולטנים מרובים Fc-מתן השימוש הקולטן קביעות פעילות phagocytic בבית סטנדרטי אופנה לשחזור עבור כל אנטיגן של עניין.
Abstract
נוגדן מונחה phagocytosis מושרה באמצעות מעורבות של רצפטורים Fc על phagocytes מקצועי, יכולים לתרום גם אישור כמו גם הפתולוגיה של המחלה. בעוד את המאפיינים של תחומים משתנה של נוגדנים כבר מזמן נחשב קריטי בתפקוד vivo, את היכולת של הנוגדנים לגייס תאים חיסוניים מולדים דרך תחומים Fc שלהם הפך יותר ויותר מוערך כגורם מרכזי יעילותם, הן ההגדרה של רקומביננטי נוגדנים חד שבטיים לטיפול, כמו גם במהלך זיהום טבעי או חיסון 1-3.
חשוב לציין, למרות המינוח שלה מושלם מתמיד, את תחום הנוגדנים Fc אין פונקציה קבועה, והיא מווסתת במידה רבה על ידי תת IgG (IgG1-4) ו glycosylation ב Asparagine 297 4-6. לכן, שיטה זו ללמוד ההבדלים תפקודית של אנטיגן ספציפי הנוגדנים בדגימות קליניות יאפשר המתאם של הסיר phagocyticential של נוגדנים הרגישות המדינה, מחלת דלקת, התקדמות, או התוצאה הקלינית.
יתר על כן, פונקציה זו מפעיל חשוב במיוחד לאור היכולת מתועד של נוגדנים כדי לשפר את זיהום על ידי מתן גישה פתוגנים לתאי המארח דרך phagocytosis קולטן מונחה Fc 7. בנוסף, יש כמה עדויות לכך ספיגת phagocytic של קומפלקסים החיסונית יכול להשפיע על הקיטוב Th1/Th2 של התגובה החיסונית 8.
כאן, אנו מתארים assay נועד לזהות הבדלים phagocytosis-נוגדן המושרה, אשר עלולה להיגרם על ידי תת IgG ההפרש, מבנה glycan ב Asn297, כמו גם את היכולת החיסונית ליצירת קומפלקסים של אנטיגן ספציפי לערמונית נוגדנים באופן תפוקה גבוהה . לשם כך, חרוזים פלורסנט 1 מיקרומטר הם מצופים אנטיגן, אז מודגרות עם דגימות נוגדנים קליני, שהניבו פלורסנט אנטיגן ספציפי לערמונית מתחמי החיסונית. אלה antibody-opsonized חרוזים מודגרת אז עם קו התא monocytic להביע FcγRs מרובות, כולל הן מעכבות והפעלה. התפוקה Assay יכול לכלול פעילות phagocytic, הפרשת ציטוקינים, ודפוסי השימוש FcγRs, ו נקבעים באופן אחיד, מה שהופך את מערכת שימושי מאוד עבור ניתוח ההבדלים בתפקוד נוגדנים תלויי זה מפעיל זיהום והן החיסון בתיווך הגנה 9.
Protocol
1. התרבות תאים Phagocytic
- תרבות THP-1 תאים 10 ב RPMI 1640 בתוספת סרום 10% שור העובר כמו השעיה נייח בתוך צלוחיות טי. צפיפות התאים יש לשמור מתחת 0.5x10 6 / mL על מנת לשמור על רמות עקבי הביטוי FcγR וביצועים assay.
2. הכן Antigen Biotinylated
- לחשב את הסכום של ערכת sulfo-NHS ביוטין מגיב LC צורך biotinylate את אנטיגן המטרה של עניין על פי הוראות היצרן.
- ממיסים את מגיב biotinylation במים ומיד להוסיף את הסכום מחושב אנטיגן ב חיץ שאינו מכיל אמינים ראשוניים. אפשר התגובה להמשיך במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר, ערבוב מדי פעם.
- הסרת עודפי ביוטין, unconjugated על ידי חילופי חיץ יחידת Amicon צנטריפוגלי ריכוז של הפסקת המשקל הראוי מולקולרית כדי לשמר את targeאנטיגן לא. הוסף מדגם לתא העליון של יחידת ריכוז להוסיף PBS להביא את הנפח הכולל עד לקו 15 מ"ל למלא. צנטריפוגה XG ב 4000 להביא את עוצמת הקול של כ 1.5-MLS. חוזרים על תהליך זה פעמיים תסיר 99% ביוטין החופשי כדי להבטיח ציפוי מקסימלי של אנטיגן כדי חרוזים.
3. הכינו חרוזים Antigen רווי
- שטפי 100 μl של 1 מ"מ חרוזי ניאון neutravidin פעמיים 1 מ"ל 0.1% PBS-BSA לאחר שצנח ב microcentrifuge במהירות גבוהה. Resuspend שטף חרוזים ב μl 100 PBS-BSA, ו 10 aliquot לתוך צינורות.
- כדי לקבוע ציפוי אנטיגן התנאים להרוות את החרוזים, לשלב 10 ul של ההשעיה חרוז נשטף עם ריכוזים שונים של אנטיגן biotinylated בשני פי שלבים. דגירה לילה ב 4 ° C בצינור microcentrifuge על הכתף.
הערה: הרוויה של חרוזים צריכה להיקבע באופן ניסיוני. ניתן להשיגעל ידי זיהוי ציפוי חרוז התנאים phagocytosis תשואה מקסימאלית כאשר החרוזים הם opsonized לאחר מכן עם נוגדנים חד שבטיים שליטה.
- הסר אנטיגן מאוגד על ידי שטיפה עם 1 מ"ל PBS-BSA ו צנטריפוגה במהירות גבוהה עד חרוזים הם pelleted. הסר PBS-BSA וחזור.
- Resuspend אנטיגן מצופים חרוזים בנפח סופי של 1 מ"ל PBS ב-BSA. חרוזים ניתן לאחסן עד שבוע ב 4 ° C לפני השימוש.
4. הכן דוגמאות נוגדן
- דגימות נוגדנים קלינית יכולה להיות מטוהרים מן הפלזמה באמצעות ג'ל מלון ערכת IgG טיהור בהתאם להוראות היצרנים. מטוהרים IgG ניתן לאחסן 4 ° C עד מוכן לשימוש.
הערה: אמצעי זהירות נאות בדבר הטיפול דגימות האדם חייב תמיד נלקח.
- קבע את הריכוז של נוגדנים מטוהרים על ידי ספיגת ב A280, ו לדלל דגימות 1 מ"ג / מ"ל ב PBS.
- הכן להניחive ושליליות נוגדנים חד שבטיים לשלוט על ידי דילול עד 1 מ"ג / מ"ל ב PBS.
5. ציפוי הניסוי
- Resuspend שטף, רווי אנטיגן פתרון חרוז מוכן ידי vortexing לעיל, והעברת 10 μl היטב לתוך כל צלחת 96 מסביב לתחתית היטב. יש להקפיד להמשיך להתסיס את ההשעיה חרוז על מנת להבטיח מספר שווה של חרוזים פלורסנט מתווספים גם כל אחד.
- הוספת ריכוזים שונים של נוגדנים עניין גם כל יצירת עקומת מנה תגובה עבור כל נוגדן. ריכוז אופטימלי יהיה שונה בין דגימות בהתאם כייל נוגדנים של ההווה, אלא מגוון של 0.01-100 מיקרוגרם / מ"ל בריכוז הסופי תספק כיסוי טוב לאפשר זיהוי של טווח הריכוז של עניין. ודא נוגדנים מתווספים בכמויות לא יותר μl 20.
- חרוזים דגירה דגימות נוגדנים עבור 2 שעות 37 ° C כדי לאפשר נוגדנים כדי opsonize את החרוזים. </ Li>
- הכן השעיית THP-1 תאים ב 2.5 x 10 5 תאים / מ"ל, ולהוסיף 200 μl של השעיה זו אחד טוב, עבור סכום כולל של 5 x 10 4 THP-1 תאים בכל טוב.
- דגירה לילה בשעה 37 ° C, 5% CO 2, חממה נייח, תאים המאפשר וחרוזים על גלולה באמצעות כוח הכבידה.
הערה: אות לרעש יכול להיות משופרת על ידי קביעת חרוז אופטימלי: נוגדן: THP-1 יחס התא מקור אנטיגן לבין נוגדנים נתון.
6. תזרים Cytometric ניתוח
- הסרה של 100 μl של supernatant מכל טוב נזהר לא להפריע תא גלולה. Supernatant ניתן לשמור אם הפרשת ציטוקינים קביעות או ניתוחים אחרים הרצוי.
- עבור קיבעון, להוסיף 100 μl של paraformaldehyde 4% טוב כל pipet כדי resuspend ומערבבים תאים.
- תפוקה גבוהה ניתוח תזרים cytometric יכול להתבצע באמצעות LSR BD II מצויד בקורא צלחת HTS.
- תוכנה תוכנית לערבב היטב כל שלוש פעמים (100 נפח לערבב μl) ולנתח 30 μl, או לפחות 2000 אירועי תא, של כל דגימה.
- נתונים שנאספו ניתן לנתח FlowJo או תוכנה דומה. מדדים שימושי כוללים את אחוז + חרוז, או תאים פלורסנט, אשר מספק מדד של מספר תאים phagocytic הנוכחי, כמו גם את עוצמת הקרינה של תאים phagocytic, אשר מספק מדד של מספר חרוזים phagocytosed. הכפלה של ערכים אלה יוצרת אינטנסיביות משולב ניאון מתכוון, או iMFI.
- המספר הממוצע של חרוזים phagocytosed על ידי כל תא phagocytic יכול להיות מחושב על ידי חלוקת iMFI על ידי הקרינה ממוצע של 1 חרוז.
7. נציג תוצאות
צריכה להיות הבחנה ברורה של דגימות נוגדנים מן הנבדקים מושפעים מעושה. איור 1 א מציג את היסטוגרמות FACS המדגם נוגדן של נגה-HIVtive (זכר שחור) נושא HIV חיובי (זכר אפור), מדגים את phagocytosis גדל מונע על ידי נוכחות של אנטיגן ספציפי נוגדנים.
רגישות אופטימלית של assay תלויה הרוויה של חרוזים עם אנטיגן biotinylated. איור 1B מציגה את phagocytosis נצפתה כאשר חרוזים מצופים עם כמויות שונות של אנטיגן היו opsonized עם 3 נוגדנים חד שבטיים מלאה (כולל נוגדנים בלתי מחייב, משולשים), וקובע 2μg אנטיגן / μl חרוזים כמו ריכוז להרוות עבור אנטיגן זה.
עקומת מנה תגובה מוצגת באיור 2, מדגים את קיבולת ההפרש של דגימות נוגדנים הנושא לגרום phagocytosis על פני טווח נוגדן ריכוז של 0.05-5 מיקרוגרם / מ"ל. Phagocytosis זה ההפרש עשוי להיות מונע על ידי אחד ההבדלים titer או נכסים Fc תחום כגון תת IgG המדינה glycosylation.
כאשר THP-1 התאים לימאגד ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, יש עדות ברורה phagocytosis חרוז. איור 3 מציג שתי 63x עדיין תמונות של THP-1 תאים לאחר הדגרה עם נוגדן opsonized (ירוק) ולא opsonized (אדום) חרוזים, מפגין את חוסר ספיגת phagocytic בהעדר נוגדנים. כאשר לשגות מיקרוסקופיה זמן מתבצע, את ספיגת נוגדנים ספציפיים phagocytic של חרוזי ניאון מדהימה יותר (סרט 1, הגדלה 20x).
עבודות קודמות אישרה הפנמה של חרוזים הקשורים התאים, וניסויים עם מונוציטים העיקרי הסכימו היטב assay זה תפוקה גבוהה (מידע לא מוצג) עם עשרות phagocytic (ערכי iMFI).
באיור 1. בקרת איכות Assay. 1A, cytometry זרימה היסטוגרמות של phagocytosis למדגם נוגדן מהנושא HIV שלילי (זכר שחור) נושא HIV חיובי (זכר אפור).1B: קביעה ניסויית של תנאים אופטימליים ציפוי חרוז עבור אנטיגן מדגם. Antigen ספציפית נוגדנים חד שבטיים (עיגול, מרובע) להפגין phagocytosis מקסימלי של חרוזים מצופים מיקרוגרם> 2 אנטיגן / μl של חרוזים, ואילו נוגדן שליטה (משולש) מדגים שום פעילות phagocytic.
באיור 2. מנה תגובה phagocytosis Curve. נוגדן דגימות קליניות מ-HIV חיובי (מטופל, מטופלים, ו מפגין שליטה שכפול נגיפי בהעדר טיפול אנטי retroviral) ו-HIV phagocytosis נושאים שלילי הכונן של gp120 (המעטפה HIV) חרוזים מצופים דיפרנציאלי.
באיור 3. הפנמה יעילה. מיקרוסקופית מאשרת את ההפנמה של נוגדנים opsonized חרוזים (ירוק), ואילו אי - opsonized חרוזים להישאר סולution (63x הגדלה).
סרט 1. זמן לשגות מיקרוסקופיה של phagocytosis נוגדן מונחה בוצעה במשך 14 שעות, מאפשרת הדמיה של פעילות phagocytic של THP-1 תאים מנוצל assay תפוקה גבוהה. חרוזים הניאון הירוק נוגדן opsonized, חרוזי ניאון אדום לספק שליטה שלילית. לחץ כאן כדי לראות את הסרט.
Discussion
Assay המתואר כאן מאפשר תפוקה גבוהה ניתוח של הפעילות phagocytic של דגימות נוגדנים קליני על ידי ניצול קו תא monocytic מנוצל זמן ללמוד תהליכים phagocytic 10 ועל סמך הצלחת לזרום אוטומטית cytometry. Assay זה יתרון על פני אחרים ביכולתה בדיוק לאפיין אנטיגן ספציפי לערמונית תת נוגדנים, מה שמאפשר לא רק למחקר הבדלים phagocytosis מונע על ידי נוגדנים ספציפיים למחלה של נושאים שונים, אלא גם מחקר ספציפיות אנטיגן מרובים בתוך אותו נושא. בגלל גיוס נוגדן של תאים מפעיל מולדת, כולל מונוציטים ותאים אחרים מציגים אנטיגן חזק משפיע על התוצאה 11-13 מחלה, והוא משתנה בהתאם לגיאומטריה נוגדן ביולוגי, תת IgG ו glycosylation ב Asparagine297 של תחום Fc 14-16, שיטה זו מספקת עבור הערכה של מנגנון נוגדן קריטי פעולה. יתר על כן, בגלל נוגדנים Mediphagocytosis ated מנוצלת על ידי פתוגנים מסוימים במהלך זיהום 7,17,18, assay זה טומן בחובו הבטחה בהערכת תהליך של שיפור נוגדנים תלויי, מדגיש את האופי הכפול של phagocytosis כמו מגן בפוטנציה, כמו גם פוטנציאל מזיק פעילות הנוגדנים.
Assay המתואר יכול להיות מנוצל כדי לנתח נוגדנים דגימות קליניות של אוכלוסיות חולים, אלא גם של vaccinees, וניתן להתאים לנצל בסרום ולא מטוהרים IgG. בנוסף, הפרשת ציטוקינים בתגובה phagocytosis ניתן לנתח מן supernatant התרבות, את ההשפעה של FCR מסוים ניתן לקבוע באמצעות FCR-חסימת נוגדנים, מה שמאפשר לא רק הבדלי העוצמה phagocytic שייקבע, אך הזרם איתות אירועים, עם תובנה לתוך מנגנון, ועשויים לסייע לפתור ולשפר הבנה של מנגנון זה החיסונית.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות במימון NIH 3R01AI080289-02S1, וכן אוניברסיטת הרווארד מרכז האיידס מחקר מלומד אחוות תחת NIH / NIAID 2P30AI060354-07.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21935 |
|
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-50 membrane | EMD Millipore | UFC905024 | Filter unit size may vary according to antigen size |
| FluoSpheres NeutrAvidin labeled microspheres, 1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8776 | Manufacturers produce this product in various colors |
| Melon Gel IgG Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 45212 | Care should be taken to verify the purity of Ab samples by SDS-page. |
References
- Cartron, G. Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene. Blood. 99, 754-758 (2002).
- Ahmad, R. Evidence for a correlation between antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediating anti-HIV-1 antibodies and prognostic predictors of HIV infection. J. Clin. Immunol. 21, 227-233 (2001).
- Hashimoto, G., Wright, P. F., Karzon, D. T. Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza virus-infected cells. J. Infect Dis. 148, 785-794 (1983).
- Anthony, R. M., Nimmerjahn, F. Th . Curr. Opin. Organ Transplant. , (2010).
- Takai, T. Fc receptors and their role in immune regulation and autoimmunity. J. Clin. Immunol. 25, 1-18 (2005).
- Jefferis, R. Antibody therapeutics: isotype and glycoform selection. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 1401-1413 (2007).
- Halstead, S. B., O'Rourke, E. J. Dengue viruses and mononuclear phagocytes. I. Infection enhancement by non-neutralizing antibody. J. Exp. Med. 146, 201-217 (1977).
- Subramaniam, K. S. The absence of serum IgM enhances the susceptibility of mice to pulmonary challenge with Cryptococcus neoformans. J. Immunol. 184, 5755-5767 (2010).
- Ackerman, M. E. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. J. Immunol. Methods. 366, 8-19 (2011).
- Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1. Int. J. Cancer. 26, 171-176 (1980).
- Ward, E. S., Ghetie, V. The effector functions of immunoglobulins: implications for therapy. Ther. Immunol. 2, 77-94 (1995).
- Winiarska, M., Glodkowska-Mrowka, E., Bil, J., Golab, J. Molecular mechanisms of the antitumor effects of anti-CD20 antibodies. Front. Biosci. 16, 277-306 (2011).
- Takai, T. Fc receptors: their diverse functions in immunity and immune disorders. Springer Semin. Immunopathol. 28, 303-304 (2006).
- Yamaguchi, Y. Glycoform-dependent conformational alteration of the Fc region of human immunoglobulin G1 as revealed by NMR spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1760, 693-700 (2006).
- Anthony, R. M., Ravetch, J. V. A novel role for the IgG Fc glycan: the anti-inflammatory activity of sialylated IgG. Fcs. J. Clin. Immunol. 30, Suppl 1. S9-S14 (2010).
- Nimmerjahn, F., Anthony, R. M., Ravetch, J. V. Agalactosylated IgG antibodies depend on cellular Fc receptors for in vivo activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8433-8437 (2007).
- Marchette, N. J. Effect of immune status on dengue 2 virus replication in cultured leukocytes from infants and children. Infect. Immun. 24, 47-50 (1979).
- Fust, G. Neutralizing and enhancing antibodies measured in complement-restored serum samples from HIV-1-infected individuals correlate with immunosuppression and disease. AIDS. 8, 603-609 (1994).
