Summary
我们目前的高通量流式细胞仪检测，以确定从临床标本中的抗原特异性抗体的吞噬活性，利用荧光抗原包被的磁珠和单核细胞表达多个Fc受体提供一个标准化的受体的使用和吞噬活性测定重现时尚任何利益抗原。
Abstract
通过聘请专业吞噬细胞的Fc受体诱导抗体驱动的吞噬功能，并可以促进两个间隙以及疾病的病理。抗体的可变区的属性一直被认为关键在体内的功能，抗体，通过他们的Fc域招聘先天免疫细胞的能力已成为越来越受欢迎，作为其疗效的主要因素，无论是在重组的设置单克隆抗体治疗，以及在自然感染或疫苗接种1-3。
重要的是，尽管它作为一个常量域的命名，抗体Fc域不具有恒定 功能，是强烈的IgG亚类（IgG1的- 4）和天冬酰胺糖基化297 4-6调制。因此，这种方法，研究在临床标本中的抗原特异性抗体的功能上的差异，将促进相关吞噬锅疾病状态下，容易受到感染，恶化，或临床结果抗体的差分。
此外，这种效应功能抗体的记录，以加强提供宿主细胞通过Fc受体驱动的吞噬功能 7病原体访问的感染能力，显得尤为重要。此外，还有一些证据表明，免疫复合物的吞噬吸收，可以影响免疫反应8的Th1/Th2细胞极化。
在这里，我们描述了旨在检测抗体诱导细胞的吞噬功能的差异，这可能是造成微分IgG亚类，聚糖结构在Asn297，以及抗原特异性抗体的免疫复合物的能力，形成一个高吞吐量的方式检测。为此，1微米的荧光珠涂有抗原，然后培养与临床的抗体样本，产生荧光抗原特异性免疫复合物。这些antiboDY -调理珠，然后培养与单核细胞表达多个FcγRs，包括抑制和激活的行。含量输出可以包括细胞的吞噬活性，细胞因子的分泌，和使用的FcγRs模式，并确定在一个标准化的方式，使之成为一个非常有用的系统，在此抗体依赖的效应功能解析差异，在感染和疫苗介导的保护9。
Protocol
1。培养吞噬细胞
- 文化的THP - 1细胞的RPMI 1640 10补充10％胎牛血清作为一个在T烧瓶固定悬挂。细胞密度应保持0.5x10 6 /毫升以下，以保持一致FcγR表达和检测性能水平。
2。准备生物素标记的抗原
- 磺酸基NHS LC生物素试剂盒，根据制造商的指示，要biotinylate利益的目标抗原的计算量。
- 溶解在水中的生物素化试剂，并立即加在缓冲区不包含伯胺抗原的计算量。允许进行反应在室温下1小时，偶尔搅拌。
- 删除在一个合适的截留分子量的离心浓缩装置Amicon的缓冲交换多余的，未结合的生物素保留的轻盾T抗原。样品室顶部的浓度单位，并添加PBS，使总体积达15毫升填充线。在4000 XG离心机把音量降低到约1.5毫升。两次重复此过程将删除99％的免费素的抗原，以确保最大的涂料珠。
3。准备抗原饱和珠
- 100μL1毫米的荧光neutravidin珠洗净两次在1毫升0.1％PBS - BSA后在高速离心旋转。悬浮洗涤100μLPBS - BSA和分装成10管珠。
- 为了确定抗原涂层饱和珠的条件，结合两方面的步骤，在不同浓度的生物素标记的抗原10洗珠悬浮UL。在4 ° C孵育过夜在一个转子的离心管。
注：珠饱和度，必须确定实验。这是可以实现的确定珠涂层的条件下，产量最大的吞噬功能，当珠子随后与控制单克隆抗体的调理。
- 取出1毫升PBS - BSA和高速离心洗涤，直到珠颗粒未结合的抗原。取出PBS - BSA和重复。
- 在最后1毫升的PBS - BSA量的悬浮抗原包被的磁珠。珠，可存储长达一个星期，在4℃，使用前。
4。准备抗体样品
- 临床抗体样品可从血浆中根据制造商的说明使用瓜胶抗体纯化试剂盒纯化。纯化的IgG可以储存在4 ° C，直到准备使用。
注：关于处理人体标本适当的预防措施，必须始终采取了。
- 确定在A280吸光度纯化抗体的浓度，并以1毫克/毫升的PBS稀释样品。
- 准备断定Ive和负的单克隆控制抗体稀释至1 mg / ml的PBS中。
5。电镀实验
- 重悬洗净，抗原饱和珠溶液的制备涡旋以上，并转移到每一个圆底96孔板以及10μL。必须小心，不断搅动珠悬浮，以确保数目相等的荧光珠，每孔加入。
- 添加不同的利益，以每口井的抗体浓度，创造了每个抗体的剂量反应曲线。根据目前的抗体滴度样品之间的最佳浓度会有所不同，但0.01 - 100微克/毫升终浓度范围将提供良好的覆盖，并允许感兴趣的浓度范围内的鉴定。确保抗体被添加在容量不超过20μL。
- 孵育珠和抗体样品为2小时37 ° C至使抗体opsonize的珠子。</ LI>
- 准备在2.5 × 10 5细胞/ ml的THP - 1细胞的悬浮液，添加200μL这种悬挂，每孔共5 × 10 4 THP - 1细胞，每孔。
- 在37孵育过夜℃，5％CO 2，在一个固定的孵化器，使细胞和珠通过重力颗粒。
注：信噪比可确定最佳珠的改进：抗体：THP - 1细胞比例，对于一个给定的抗原和抗体的来源。
6。流式细胞仪分析
- 取出100μL上清液，每孔小心，不要打扰细胞沉淀。上清可以保存，如果分泌细胞因子的确定或其他分析所需。
- 固定，每口井和吸管添加的4％多聚甲醛100μL重悬和混合细胞。
- 可以使用一个BD LSR II配备HTS酶标仪高通量流式细胞仪分析。
- 程序软件组合，每孔三次（100μL混合体积）和分析30μL，每个样品或至少2000细胞活动。
- FlowJo或相同的软件，收集的数据进行分析。有用的指标包括珠+％，或荧光的细胞，它提供了一个衡量目前的吞噬细胞的数量，以及荧光强度的吞噬细胞，它提供了一个吞噬珠数量的措施。这些值相乘，产生一个综合的平均荧光强度，或iMFI。
- 除以平均荧光珠1 iMFI，可以计算出平均每个吞噬细胞吞噬珠。
7。代表性的成果
受影响和不受影响的科目应的抗体样本有明显的差异。图1A呈现艾滋病毒抗体的样本负的流式细胞仪直方图tive（黑色曲线）和艾滋病毒阳性（灰色跟踪）的问题，并示范带动增加的吞噬抗原特异性抗体的存在。
最佳灵敏度检测的是依赖于饱和与生物素抗原的珠子。图1B提出观察时，涂有不同数量的抗原珠3单克隆抗体（包括非约束性的抗体，三角形）调理吞噬作用，并确立作为这种抗原的饱和浓度2μg的抗原/μL珠。
剂量反应曲线图2中，并演示受到抗体样本的差的能力，以诱使超过0.05-5微克/毫升的抗体浓度范围内的吞噬功能。这个差的吞噬功能，可驱动滴度或FC域的属性，如IgG亚类和糖基化状态或者差异。
当THP - 1细胞的我马吉德阿卜荧光显微镜，珠的吞噬功能有明显的证据。图3给出了两个63X抗体调理（绿色）和非调理（红色）珠孵化后的THP - 1细胞的图像，显示出在缺乏抗体的情况下吞噬吸收。当时间的推移显微镜，特定抗体的荧光珠的吞噬吸收更为显着（电影1，20倍放大倍率）。
以前的研究工作已经证实与细胞相关的珠子内部，原发性单核细胞的实验已同意与吞噬分数（iMFI值），以及在这种高通量检测（数据未显示）。
图1。含量的质量控制。 1A，从HIV阴性的主题（黑色跟踪）和艾滋病毒呈阳性的主体（灰色跟踪）抗体样本吞噬流式细胞仪直方图。1B：实验测定的最优样本抗原珠涂层条件。抗原特异性单克隆抗体（圆形，方形）> 2微克抗原/μL珠涂珠展示最大的吞噬功能，同时控制抗体（三角形）演示没有吞噬活性。
图2。吞噬功能的剂量反应曲线。从HIV阳性（处理，未经处理的，并表现出抗逆转录病毒治疗的情况下，控制病毒复制）和HIV阴性科目gp120的驱动器的吞噬功能（艾滋病毒信封）涂珠差异的临床抗体样品。
图3。高效的内部化。显微镜证实了抗体调理珠（绿色）的内化，而非调理珠留在溶胶ution（63X放大倍率）。
电影1。时间推移抗体驱动的吞噬功能的显微镜超过14个小时的过程中进行，并允许利用高通量的检测THP - 1细胞的吞噬活性的可视化。绿色荧光珠抗体的调理，红色荧光珠提供了一个阴性对照。 点击这里观看影片。
Discussion
这里所描述的检测可以利用一个长期利用研究吞噬过程10板的自动流式细胞仪的单核细胞株的吞噬活性的临床抗体样本的高通量分析。在其能够精确地刻画抗原特异性抗体的子集，这是对他人有利的检测，不仅为来自不同学科的驱动，在特定疾病的抗体细胞的吞噬功能差异的研究，也多抗原特异性内同一主题的研究。由于先天的效应细胞，包括单核细胞和其他抗原提呈细胞的抗体招聘强烈影响疾病的结果11-13，是根据 FC域14-16 Asparagine297抗体几何，IgG亚类和糖基化，生物变量，这种方法提供评价一个采取行动的关键抗体机制。此外，因为抗体的Mediated细胞的吞噬功能是利用一些病原体在感染的7,17,18过程中，这个实验认为在评估过程中抗体依赖性增强的承诺，并突出吞噬的双重性质，作为一个潜在的保护，以及潜在的有害抗体的活性。
描述该试剂盒可用于分析从临床样本的患者人群抗体，而且疫苗接种，并可能进行调整利用，而不是纯化IgG的血清。此外，细胞因子分泌到细胞的吞噬功能，可以从培养上清进行分析，并可以通过FCR -阻断抗体，使吞噬效力不仅要确定差异决定的具体FCR影响，但下游信号事件与洞察力，机制，可能有助于解决和完善这种免疫机制的理解。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者要感谢从NIH 3R01AI080289 - 02S1，并根据NIH / NIAID的2P30AI060354 - 07哈佛大学艾滋病研究中心学者联谊会的资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21935 |
|
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-50 membrane | EMD Millipore | UFC905024 | Filter unit size may vary according to antigen size |
| FluoSpheres NeutrAvidin labeled microspheres, 1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8776 | Manufacturers produce this product in various colors |
| Melon Gel IgG Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 45212 | Care should be taken to verify the purity of Ab samples by SDS-page. |
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