Summary
Vi præsenterer en high-throughput flowcytometrisk analyse for at bestemme fagocyterende aktivitet af antigen-specifikke antistoffer fra kliniske prøver, at udnytte fluorescerende antigen-belagt perler og en monocytic cellelinie udtrykker flere Fc receptorer-leverandører receptor brug og fagocyterende aktivitet bestemmelser på en standardiseret og reproducerbare mode for enhver antigen af interesse.
Abstract
Antistof-drevet fagocytose er induceret via ansættelse af Fc receptorer på professionelle fagocytter, og kan bidrage til både clearance samt patologi af sygdom. Mens egenskaberne for den variable domæner af antistoffer længe har været betragtet kritisk til in vivo-funktionen, har evnen af antistoffer til at rekruttere medfødte immunceller via deres Fc domæner bliver mere og mere værdsat som en vigtig faktor for deres effektivitet, både i etableringen af rekombinant monoklonalt antistof terapi, såvel som i løbet af naturlig infektion eller vaccination 1-3.
Vigtigere er det, på trods af sin nomenklatur som en konstant domæne, gør antistof-Fc-domæne ikke er konstant funktion, og er stærkt moduleres af IgG subklasser (IgG1-4) og glykosylering på asparagin 297 4-6. Således at denne metode undersøge funktionelle forskelle i antigen-specifikke antistoffer i kliniske prøver vil lette korrelation af fagocyterende puljenential af antistoffer mod sygdommen tilstand, modtagelighed for infektion, progression, eller det kliniske resultat.
Desuden er dette effektor funktion er særlig vigtig i lyset af den dokumenterede evne til antistoffer til at øge smitte ved at give patogener adgang til værtsceller via Fc receptor-drevet fagocytose 7. Desuden er der tegn på, at fagocyterende optagelsen af immunkomplekser kan påvirke Th1/Th2 polarisering af immunresponset 8.
Her beskriver vi en assay designet til at detektere forskelle i antistof-induceret fagocytose, som kan være forårsaget af forskellen IgG subklasse, glycan struktur på Asn297, samt evnen til at danne immunkomplekser af antigen-specifikke antistoffer i en high-throughput fashion . Til dette formål er 1 μm fluorescerende perler belagt med antigen, inkuberes derefter med kliniske antistof prøver, genererer fluorescerende antigen specifikke immunkomplekser. Disse antibody-opsonized perler inkuberes derefter med et monocytic cellelinie udtrykker flere FcγRs, herunder både hæmmende og aktiverende. Assay udgang kan omfatte fagocyterende aktivitet, cytokin sekretion, og mønstre for FcγRs brug, og fastsættes på en standardiseret måde, hvilket gør dette til et særdeles nyttigt system til parsing forskelle i dette antistof-afhængige effektor funktion i både infektion og vaccine-medieret beskyttelse 9.
Protocol
1. Kultur fagocyterende celler
- Kultur THP-1 celler 10 i RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum som en stationær suspension i T kolber. Celletæthed bør vedligeholdes under 0.5x10 6 / mL for at opretholde ensartede niveauer for FcγR udtryk og analysepræstation.
2. Forbered Biotinyleret Antigen
- Beregn mængden af sulfo-NHS LC biotin reagenskit nødvendigt at biotinylate målet antigen af interesse i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Opløs biotinylation reagens i vand og straks tilføje det beregnede beløb til antigen i en buffer, der ikke indeholder primære aminer. Lad reaktionen fortsætte i 1 time ved stuetemperatur, blandes lejlighedsvis.
- Fjern overskydende, ukonjugeret biotin ved buffer udveksling i en Amicon centrifugal koncentration enhed i et passende molekylevægt cutoff at bevare Target antigen. Tilføj prøve til den øverste kammer i koncentrationen enheden og tilføje PBS til at bringe den samlede mængde på op til 15 ml udfylde linje. Centrifuger ved 4000 xg at bringe mængden ned til cirka 1,5 MLS. Gentage denne proces to gange vil fjerne 99% af den frie biotin for at sikre maksimal belægning af antigen, perler.
3. Forbered Antigen Mættet perler
- Vask 100 μl 1 mm fluorescerende neutravidin perler to gange i 1 ml 0,1% PBS-BSA, efter spinning ned i en mikrocentrifuge ved høj hastighed. Resuspender vasket perler i 100 μl PBS-BSA, og alikvot i 10 rør.
- For at afgøre antigen belægning betingelser, som mætte perlerne, kombinerer 10 ul af vasket perle affjedring med varierende koncentrationer af biotinyleret antigen i to gange trin. Inkuberes natten over ved 4 ° C i et mikrocentrifugerør på en rotator.
BEMÆRK: Mætning af perler skal bestemmes eksperimentelt. Dette kan opnåsved at identificere perle-belægning betingelser, der giver maksimal fagocytose, når perlerne er efterfølgende opsonized med en kontrolgruppe monoklonalt antistof.
- Fjern ubundet antigen ved vask med 1 mL PBS-BSA og centrifuger ved høj hastighed, indtil perlerne er pelleteret. Fjern PBS-BSA og gentag.
- Resuspender antigen-belagt perler i en endelig volumen på 1 ml i PBS-BSA. Perler kan opbevares i op til en uge ved 4 ° C før brug.
4. Forbered Antistof Prøver
- Klinisk antistof prøver kan renses fra plasma ved hjælp af en Melon gel IgG rensning kit i henhold til fabrikantens anvisninger. Renset IgG kan opbevares ved 4 ° C, indtil klar til brug.
BEMÆRK: Korrekt forholdsregler vedrørende håndtering af humane prøver skal altid blevet taget.
- Bestem koncentrationen af renset antistoffer ved absorbans ved A280, og fortynd prøverne til 1 mg / ml i PBS.
- Forbered postulereive og negative monoklonale kontrol antistoffer ved fortynding til 1 mg / ml i PBS.
5. Belægning på Experiment
- Resuspender vasket, antigen mættet perle klargjort ovenstående ved hvirvelblanding, og overføre 10 μl til hver brønd i en rundbundet 96 brønds plade. Care skal træffes foranstaltninger til løbende agitere perlen suspension for at sikre lige mange fluorescerende perler tilsættes til hver brønd.
- Tilføj varierende koncentrationer af antistoffer af interesse for hver brønd, hvilket skaber en dosis-respons kurve for hver antistof. Optimale koncentrationer vil variere mellem prøverne afhængig af titer af antistoffer til stede, men en række 0,01 til 100 mg / ml endelig koncentration vil give en god dækning og tillade identifikation af koncentrationsområde af interesse. Sørg for antistoffer er tilsat i mængder ikke større end 20 μl.
- Inkuber perler og antistof prøver i 2 timer ved 37 ° C for at gøre det muligt for antistoffer mod opsonize perlerne. </ Li>
- Forbered en suspension af THP-1 celler på 2,5 x 10 5 celler / ml, og der tilsættes 200 μl af denne suspension til hver brønd, i alt 5 x 10 4 THP-1 celler i hver brønd.
- Inkuberes natten over ved 37 ° C, 5% CO 2 i en stationær inkubator, så celler og perler til pellet via tyngdekraften.
BEMÆRK: Signal til støj kan forbedres ved at bestemme den optimale perle: antistof: THP-1 celle nøgletal for et givent antigen og antistof kilde.
6. Flowcytometrisk analyse
- Fjern 100 μl af supernatanten fra hver brønd være omhyggelig med ikke at forstyrre cellepelleten. Supernatanten kan reddes, hvis cytokin sekretion bestemmelser eller andre analyser er ønsket.
- For fiksering, tilsættes 100 μl på 4% paraformaldehyd til hver brønd og pipette til resuspender og blande celler.
- High throughput flowcytometrisk analyse kan udføres ved hjælp af en BD LSR II er udstyret med en HTS pladelæser.
- Program software til at blande hver brønd tre gange (100 μl mix volumen) og analysere 30 μl, eller mindst 2000 celler begivenheder, for hver prøve.
- Indsamlede data kan analyseres i FlowJo eller tilsvarende software. Nyttige målinger omfatter procent af perle +, eller fluorescerende celler, der giver et mål for antallet af fagocyterende celler til stede, samt fluorescensintensitet af fagocyterende celler, der giver et mål for antallet af fagocyteret perler. Ganger du disse værdier genererer en integreret betyder fluorescensintensitet, eller iMFI.
- Det gennemsnitlige antal af perler fagocyteret hver fagocyterende celle kan beregnes ved at dividere iMFI af den gennemsnitlige fluorescens af 1 perle.
7. Repræsentative resultater
Der bør være klar differentiering af antistof-prøver fra ramte og upåvirket fag. Figur 1A præsenterer FACS histogrammer af et antistof prøve fra en HIV-negativedirektiv (sort trace) og en hiv-positiv (grå trace) med forbehold, og viser den øgede fagocytose drevet af tilstedeværelsen af antigen-specifikke antistoffer.
Optimal følsomhed for analysen er afhængig af mætning af perlerne med biotinyleret antigen. Figur 1B præsenterer fagocytose observeret, når perler belagt med forskellige mængder af antigen blev opsonized med 3 kontrol monoklonale antistoffer (herunder en ikke-bindende antistof, trekanter), og fastlægger 2μg antigen / mikroliter perler som en mætte koncentration for dette antigen.
En dosis-respons kurven er præsenteret i figur 2, og viser forskellen kapacitet af emne antistof prøver at fremkalde fagocytose over et antistof koncentrationsinterval på 0,05 til 5 mg / ml. Dette forskellen fagocytose kan være drevet af enten forskelle i titer eller Fc domainet egenskaber såsom IgG subklasse og glykosylering tilstand.
Når THP-1 celler er imaged af fluorescerende mikroskopi, er der klare beviser for perle fagocytose. Figur 3 præsenterer to 63x stadig billeder af THP-1 celler efter inkubation med antistof opsonized (grøn) og ikke-opsonized (rød) perler, viser den manglende fagocyterende optagelse i fravær af antistof. Når tiden bortfalder mikroskopi udføres, antistof-specifikke fagocyterende optagelse af fluorescerende perler er endnu mere slående (Movie 1, 20x forstørrelse).
Tidligere arbejde har bekræftet internalisering af perlerne er forbundet med celler, og eksperimenter med primær monocytter har aftalt godt med fagocyterende scores (iMFI værdier) i denne high throughput analyse (data ikke vist).
Figur 1. Assay Kvalitetskontrol. 1A, Flowcytometri histogrammer af fagocytose for et antistof prøve fra en HIV-negativ emne (sort trace) og en HIV-positiv emne (grå trace).1B: eksperimentel bestemmelse af de optimale perle belægning betingelser for en prøve antigen. Antigen-specifikke monoklonale antistoffer (cirkel, firkant) viser maksimal fagocytose af perler belagt med> 2 mg antigen / mikroliter af perler, mens en kontrol antistof (trekant) viser ingen fagocyterende aktivitet.
Figur 2. Fagocytose dosis-respons kurve. Klinisk antistof prøver fra hiv-positive (behandlet, ubehandlet, og udstille kontrol af virusreplikation i mangel af anti-retroviral terapi) og HIV-negative emner drev fagocytose af gp120 (HIV kuvert) belagt perler varierende.
Figur 3. Effektiv Internalisering. Mikroskopi bekræfter internalisering af antistof-opsonized perler (grøn), mens ikke-opsonized perler forblive i Solution (63x forstørrelse).
Movie 1. Time-lapse mikroskopi af antistof-drevet fagocytose blev udført i løbet af 14 timer og giver mulighed for visualisering af fagocyterende aktivitet THP-1 celler brugt i high-throughput analyse. Grønne fluorescerende perler er antistof opsonized, rød fluorescerende perler giver en negativ kontrol. Klik her for at se filmen.
Discussion
Analysen, der er beskrevet her, giver high-throughput analyse af fagocyterende aktivitet af kliniske antistof prøver ved hjælp af et monocytic cellelinie længe udnyttet til at studere fagocyterende processer 10 og plade baseret automatiseret flowcytometri. Denne analyse er en fordel over andre i sin evne til præcist at karakterisere antigen-specifikt antistof delmængder, så ikke kun for Undersøgelse af forskelle i fagocytose drevet af sygdoms-specifikke antistoffer fra forskellige fag, men også undersøgelse af flere antigen særlige forhold inden for samme emne. Fordi antistof rekruttering af medfødte effektor celler, herunder monocytter og andre antigen-præsenterende celler kraftigt konsekvenser sygdommen resultatet 11-13, og er biologisk variabel afhængig antistof geometri, IgG subklasse, og glykosylering på Asparagine297 af Fc domainet 14-16, denne metode giver evaluering af en kritisk antistof virkningsmekanisme. Hertil kommer, fordi antistof-medicinated fagocytose bliver udnyttet af nogle patogener i løbet af infektion 7,17,18, denne analyse holder løfte i evaluering af forløbet af antistof-afhængige ekstraudstyr, og fremhæver den dobbelte karakter af fagocytose som et potentielt beskyttende, samt potentielt skadelige antistof aktivitet.
De beskrevne test kan bruges til at analysere antistoffer fra kliniske prøver af patientgrupper, men også af de vaccinerede, og kan tilpasses til at bruge serum snarere end oprenset IgG. Derudover kan cytokin sekretion som reaktion på fagocytose kan analyseres ud fra den kultur supernatant, og indflydelsen af specifikke FCR kan bestemmes ved hjælp af FCR-blokerende antistoffer, så ikke blot forskelle i fagocyterende styrken, der skal fastlægges, men downstream signalering arrangementer, med indsigt ind i mekanismen, og kan bidrage til at løse og forbedre forståelsen af denne immunologiske reaktion.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke støtte fra NIH 3R01AI080289-02S1, og en Harvard University Center for AIDS Research Scholar Fellowship under NIH / NIAID 2P30AI060354-07.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21935 |
|
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-50 membrane | EMD Millipore | UFC905024 | Filter unit size may vary according to antigen size |
| FluoSpheres NeutrAvidin labeled microspheres, 1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8776 | Manufacturers produce this product in various colors |
| Melon Gel IgG Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 45212 | Care should be taken to verify the purity of Ab samples by SDS-page. |
References
- Cartron, G. Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene. Blood. 99, 754-758 (2002).
- Ahmad, R. Evidence for a correlation between antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediating anti-HIV-1 antibodies and prognostic predictors of HIV infection. J. Clin. Immunol. 21, 227-233 (2001).
- Hashimoto, G., Wright, P. F., Karzon, D. T. Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza virus-infected cells. J. Infect Dis. 148, 785-794 (1983).
- Anthony, R. M., Nimmerjahn, F. Th . Curr. Opin. Organ Transplant. , (2010).
- Takai, T. Fc receptors and their role in immune regulation and autoimmunity. J. Clin. Immunol. 25, 1-18 (2005).
- Jefferis, R. Antibody therapeutics: isotype and glycoform selection. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 1401-1413 (2007).
- Halstead, S. B., O'Rourke, E. J. Dengue viruses and mononuclear phagocytes. I. Infection enhancement by non-neutralizing antibody. J. Exp. Med. 146, 201-217 (1977).
- Subramaniam, K. S. The absence of serum IgM enhances the susceptibility of mice to pulmonary challenge with Cryptococcus neoformans. J. Immunol. 184, 5755-5767 (2010).
- Ackerman, M. E. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. J. Immunol. Methods. 366, 8-19 (2011).
- Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1. Int. J. Cancer. 26, 171-176 (1980).
- Ward, E. S., Ghetie, V. The effector functions of immunoglobulins: implications for therapy. Ther. Immunol. 2, 77-94 (1995).
- Winiarska, M., Glodkowska-Mrowka, E., Bil, J., Golab, J. Molecular mechanisms of the antitumor effects of anti-CD20 antibodies. Front. Biosci. 16, 277-306 (2011).
- Takai, T. Fc receptors: their diverse functions in immunity and immune disorders. Springer Semin. Immunopathol. 28, 303-304 (2006).
- Yamaguchi, Y. Glycoform-dependent conformational alteration of the Fc region of human immunoglobulin G1 as revealed by NMR spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1760, 693-700 (2006).
- Anthony, R. M., Ravetch, J. V. A novel role for the IgG Fc glycan: the anti-inflammatory activity of sialylated IgG. Fcs. J. Clin. Immunol. 30, Suppl 1. S9-S14 (2010).
- Nimmerjahn, F., Anthony, R. M., Ravetch, J. V. Agalactosylated IgG antibodies depend on cellular Fc receptors for in vivo activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8433-8437 (2007).
- Marchette, N. J. Effect of immune status on dengue 2 virus replication in cultured leukocytes from infants and children. Infect. Immun. 24, 47-50 (1979).
- Fust, G. Neutralizing and enhancing antibodies measured in complement-restored serum samples from HIV-1-infected individuals correlate with immunosuppression and disease. AIDS. 8, 603-609 (1994).
