Summary
Nous présentons une analyse des flux à haut débit par cytométrie de déterminer l'activité phagocytaire de l'antigène-anticorps spécifiques à partir d'échantillons cliniques, en utilisant fluorescentes recouvertes d'antigène perles et une lignée cellulaire monocytaire exprimer plusieurs récepteurs Fc-récepteur et d'utilisation fournissant des déterminations de l'activité phagocytaire dans un standardisés et façon reproductible pour tout antigène d'intérêt.
Abstract
Anticorps axée phagocytose est induite par l'engagement des récepteurs Fc sur les phagocytes professionnels, et peuvent contribuer à la fois jeu ainsi que la pathologie de la maladie. Bien que les propriétés des domaines variables des anticorps ont été longtemps considérés comme critiques pour la fonction in vivo, la capacité des anticorps à recruter les cellules immunitaires innées via leur domaines Fc est devenu de plus en plus apprécié comme un facteur important dans leur efficacité, tant dans le cadre de la recombinaison thérapie par anticorps monoclonaux, ainsi que dans le cours de l'infection naturelle ou vaccination 1-3.
Surtout, en dépit de sa nomenclature comme un domaine constant, le domaine Fc d'anticorps n'a pas de fonction constante, et est fortement modulé par sous-classe IgG (IgG1-4) et la glycosylation au asparagine 297 4-6. Ainsi, cette méthode pour étudier les différences fonctionnelles des anticorps spécifiques d'antigène dans les échantillons cliniques facilitera la corrélation de la marmite phagocytairesdifférentiel d'anticorps au stade de la maladie, la susceptibilité à l'infection, la progression, ou le résultat clinique.
Par ailleurs, cette fonction effectrice est particulièrement important compte tenu de la capacité documentée d'anticorps afin d'améliorer l'infection en fournissant un accès pathogènes dans les cellules hôtes par l'intermédiaire des récepteurs Fc axée phagocytose 7. En outre, il existe certaines preuves que l'absorption phagocytaire des complexes immuns peut influer sur la polarisation Th1/Th2 de la réponse immunitaire 8.
Ici, nous décrivons un test conçu pour détecter des différences dans les anticorps induits par la phagocytose, qui peuvent être causés par le différentiel d'IgG sous-classe, structure du glycane au Asn297, ainsi que la capacité à former des complexes immuns de l'antigène-anticorps spécifiques à un mode haut-débit . À cette fin, une um billes fluorescentes sont recouvertes d'antigène, puis incubé avec des échantillons cliniques d'anticorps, générant fluorescentes spécifiques de l'antigène des complexes immuns. Ces Antibody-opsonisées billes sont ensuite incubés avec une lignée cellulaire monocytaire exprimer FcγRs multiples, y compris les inhibiteurs et activateurs. Sortie de dosage peuvent inclure l'activité phagocytaire, la sécrétion de cytokines, et les habitudes d'utilisation FcγRs, et sont déterminés de manière standardisée, ce qui en fait un système très utile pour l'analyse des différences dans cette fonction dépendante des anticorps effecteur dans l'infection et le vaccin protection médiée par 9.
Protocol
1. Cellules phagocytaires Culture
- Culture cellules THP-1 10 dans du RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal comme une suspension stationnaire dans des flacons T. Densité cellulaire doit être maintenue au-dessous 0.5x10 6 / ml afin de maintenir un niveau constant de l'expression FcyR et performance du test.
2. Préparer l'antigène biotinylé
- Calculer la quantité de sulfo-NHS kit LC réactifs nécessaires à la biotine biotinyler l'antigène cible d'intérêt selon les instructions du fabricant.
- Dissoudre le réactif de biotinylation dans l'eau et ajouter immédiatement le montant calculé à l'antigène dans un tampon qui ne contient pas les amines primaires. Laisser la réaction se dérouler pendant 1 heure à température ambiante, en mélangeant de temps en temps.
- Enlever l'excès, de la biotine non conjuguée par un échange de tampon dans une unité de concentration Amicon centrifuge d'un poids moléculaire limite opportun de conserver la targeantigène T. Ajouter l'échantillon à la chambre supérieure de l'unité de concentration et d'ajouter du PBS pour porter le volume total pouvant aller jusqu'à 15 ml ligne de remplissage. Centrifuger à 4000 xg pour apporter du volume jusqu'à environ 1,5 ml. Répétition ce processus deux fois va supprimer 99% de la biotine libre pour assurer revêtement maximale de l'antigène à des billes.
3. Préparer Perles Antigène saturés
- Lavez 100 pl de billes 1 mm neutravidine fluorescentes à deux reprises dans 1 ml de PBS à 0,1%-BSA après le filage dans une microcentrifugeuse à vitesse élevée. Resuspendre lavés perles dans 100 ul de PBS-BSA, et aliquot en 10 tubes.
- Afin de déterminer les conditions de revêtement d'antigène qui saturent les perles, mélanger 10 ul de la suspension lavée perles avec des concentrations variables d'antigènes biotinylés en deux volets étapes. Incuber une nuit à 4 ° C dans un tube à centrifuger sur un rotateur.
REMARQUE: La saturation des perles doit être déterminée expérimentalement. Ceci peut être accomplien identifiant les perles de revêtement des conditions que le rendement maximal lorsque la phagocytose perles sont ensuite opsonisées avec un anticorps monoclonal témoin.
- Retirer antigènes non liés par un lavage avec 1 ml de PBS-BSA et centrifuger à vitesse élevée jusqu'à perles sont culottées. Retirer du PBS-BSA et répéter.
- Resuspendre recouvertes d'antigène perles dans un volume final de 1 ml dans PBS-BSA. Perles peuvent être stockées pendant une semaine à 4 ° C avant utilisation.
4. Préparer les échantillons d'anticorps
- Échantillons cliniques d'anticorps peuvent être purifiés à partir de plasma en utilisant un gel de purification Melon IgG kit selon les instructions du fabricant. IgG purifiées peuvent être conservés à 4 ° C jusqu'à utilisation.
REMARQUE: précautions adéquates concernant la manipulation des échantillons humains doivent toujours été prises.
- Déterminer la concentration de anticorps purifiés par absorbance à A280, et de diluer les échantillons à 1 mg / ml dans du PBS.
- Préparer poserive et négatifs anticorps monoclonal témoin par dilution à 1 mg / ml dans du PBS.
5. Placage de l'Expérience
- Reprendre le laver, de l'antigène solution saturée perles préparé ci-dessus par vortex, et le transfert 10 ul dans chaque puits d'un fond rond plaque de 96 puits. Des précautions doivent être prises pour constamment agiter la suspension de billes pour assurer un nombre égal de billes fluorescentes sont ajoutés à chaque puits.
- Ajouter des concentrations variables d'anticorps d'intérêt pour chaque puits, la création d'une courbe dose-réponse pour chaque anticorps. Concentrations optimales diffèrent entre les échantillons en fonction du titre d'anticorps présents, mais une gamme de 0,01 à 100 pg / ml concentration finale offrira une bonne couverture et de permettre l'identification de la gamme de concentration de l'intérêt. Assurez-anticorps sont ajoutés dans des volumes ne dépassant pas 20 pl.
- Incuber perles et des échantillons d'anticorps pendant 2 heures à 37 ° C pour permettre à l'anticorps à opsoniser les perles. </ Li>
- Préparer une suspension de cellules THP-1 à 2,5 x 10 5 cellules / ml, et ajouter 200 ul de cette suspension à chaque puits, pour un total de 5 x 10 4 cellules THP-1 dans chaque puits.
- Incuber une nuit à 37 ° C, 5% de CO 2, dans un arrêt incubateur, cellules, permettant aux pellets et des perles par gravité.
NOTE: Signal to Noise peut être améliorée par la détermination de la perle optimale: anticorps: THP-1 ratios de cellules pour une source donnée d'antigène et anticorps.
6. Cytométrie en flux
- Retirer 100 pi de surnageant de chaque puits en faisant attention de ne pas perturber le culot cellulaire. Le surnageant peut être sauvé si les déterminations sécrétion de cytokines ou d'autres analyses sont souhaitées.
- Pour la fixation, ajouter 100 l de paraformaldéhyde à 4% dans chaque puits et une pipette pour resuspendre et mélanger des cellules.
- Haute analyse des flux de débit cytométrie peut être effectuée en utilisant une BD LSR II équipé d'un lecteur de plaque HTS.
- Programme logiciel pour mélanger chaque puits à trois reprises (un volume de 100 ul mélange) et d'analyser les 30 ul, ou au moins 2000 événements cellulaires, de chaque échantillon.
- Les données recueillies peuvent être analysées en FlowJo ou un logiciel équivalent. Métriques utiles comprennent les billes pour cent de + ou cellules fluorescentes, ce qui donne une mesure du nombre de cellules phagocytaires présentes, ainsi que l'intensité de fluorescence des cellules phagocytaires, qui fournit une mesure du nombre de perles phagocytés. En multipliant ces valeurs génère une intensité moyenne intégrée de fluorescence, ou iMFI.
- Le nombre moyen de billes de phagocytées par chaque cellule phagocytaire peut être calculé en divisant le iMFI par la fluorescence moyenne de 1 perle.
7. Les résultats représentatifs
Il devrait y avoir une différenciation claire des échantillons d'anticorps chez les sujets atteints et non atteints. La figure 1A présente les histogrammes FACS d'un échantillon d'anticorps à partir d'une néga VIHtive (trace noire) et un sujet VIH positif (traces grises), et démontre la phagocytose accrue tirée par la présence d'anticorps spécifiques d'antigène.
Une sensibilité optimale du dosage est dépendant de la saturation des perles avec l'antigène biotinylé. Figure 1B présente la phagocytose observée lorsque billes revêtues avec différentes quantités d'antigène ont été opsonisées avec 3 anticorps monoclonal témoin (y compris un anticorps non contraignant, triangles), et établit 2μg antigène / ul perles comme une concentration saturante pour cet antigène.
Une courbe dose-réponse est présentée dans la figure 2, et démontre la capacité différentielle des échantillons d'anticorps soumis à induire la phagocytose sur une plage de concentration d'anticorps de 0,05 à 5 pg / ml. Cette phagocytose différentielles peuvent être conduits soit par des différences dans les propriétés titre ou domaine Fc comme la sous-classe d'IgG et de l'état de glycosylation.
Lorsque cellules THP-1 sont iMaged par microscopie fluorescente, il ya des preuves claires de la phagocytose de billes. La figure 3 présente deux 63x images fixes des cellules THP-1 après incubation avec l'anticorps opsonisées (vert) et non opsonisées (rouge) perles, démontrant l'absence d'absorption phagocytaire en l'absence d'anticorps. Lorsque la microscopie laps de temps est effectuée, l'absorption des anticorps spécifiques phagocytaire des perles fluorescentes est encore plus frappante (Film 1, un grossissement de 20x).
Des travaux antérieurs ont confirmé l'internalisation des perles associées aux cellules, et les expériences avec les monocytes primaires ont convenu ainsi avec des scores de phagocytose (valeurs iMFI) dans ce dosage à haut débit (données non présentées).
Figure 1. Contrôle de qualité du dosage. 1A, histogrammes de cytométrie en flux de la phagocytose pour un échantillon d'anticorps à partir d'un sujet VIH négatif (noir trace) et une réserve VIH positif (traces grises).1B: Détermination expérimentale des conditions optimales revêtement de perles pour un antigène de l'échantillon. Antigène spécifique des anticorps monoclonaux (cercle, carré) démontrent phagocytose maximal de billes recouvertes de> 2 ug d'antigène / ul de billes, tandis que d'un anticorps de contrôle (triangle) ne démontre aucune activité phagocytaire.
Figure 2. Phagocytose courbe dose-réponse. Échantillons cliniques provenant d'anticorps VIH positif (traitées, non traitées, et présentant le contrôle de la réplication virale en l'absence de thérapie anti-rétrovirale) et le VIH phagocytose négatifs d'entraînement des sujets de la gp120 (enveloppe du VIH) billes revêtues différemment.
Figure 3. Internalisation efficace. Microscopie confirme l'internalisation des anticorps opsonisées perles (vert), tandis que les non-opsonisées billes restent en solution (63x de grossissement).
Vidéo 1. Time-lapse de microscopie de l'anticorps axée phagocytose a été réalisée au cours de 14 heures et permet la visualisation de l'activité phagocytaire des cellules THP-1 utilisés dans le dosage à haut débit. Vert billes fluorescentes sont des anticorps opsonisées, rouge billes fluorescentes offrent un contrôle négatif. Cliquez ici pour regarder le film.
Discussion
L'essai décrit ici permet analyse à haut débit de l'activité phagocytaire des échantillons cliniques d'anticorps en utilisant une lignée cellulaire monocytaire longtemps utilisée pour étudier les processus de phagocytose et la plaque 10 par cytométrie de flux basée automatisés. Ce dosage est plus avantageux que d'autres dans sa capacité à caractériser précisément des sous-ensembles spécifiques de l'antigène des anticorps, permettant non seulement pour l'étude des différences dans la phagocytose tirée par la maladie des anticorps spécifiques de différents sujets, mais également l'étude des spécificités antigéniques multiples dans le même sujet. Parce que le recrutement d'anticorps d'Innate cellules effectrices, y compris les monocytes et les cellules présentant l'antigène d'autres impacts fortement 11-13 évolution de la maladie, et est biologiquement géométrie variable en fonction des anticorps, sous-classe d'IgG, et la glycosylation au Asparagine297 du domaine Fc 14-16, cette méthode fournit des l'évaluation d'un mécanisme d'anticorps critique de l'action. Par ailleurs, en raison des anticorps Mediphagocytose ATED est exploitée par certains agents pathogènes au cours de l'infection 7,17,18, ce test est très prometteuse dans l'évaluation du processus de mise en valeur dépendante des anticorps, et met en évidence la double nature de la phagocytose comme potentiellement protecteurs, ainsi que potentiellement préjudiciable l'activité des anticorps.
L'essai décrit peut être utilisé pour analyser les anticorps à partir d'échantillons cliniques des populations de patients, mais aussi des sujets vaccinés, et peut être adapté à base de sérum plutôt que IgG purifiées. De plus, la sécrétion de cytokines en réponse à la phagocytose peut être analysé à partir du surnageant de culture, et l'influence des FcR spécifiques peuvent être déterminées en utilisant FcR anticorps bloquant, permettant non seulement des différences dans la puissance phagocytaire à déterminer, mais de signalisation en aval des événements, avec perspicacité dans le mécanisme, et peut aider à résoudre et d'affiner la compréhension de ce mécanisme immunitaire.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le financement du NIH 3R01AI080289-02S1, et une université de Harvard Center for AIDS Research Fellowship Scholar sous NIH / NIAID 2P30AI060354-07.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21935 |
|
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-50 membrane | EMD Millipore | UFC905024 | Filter unit size may vary according to antigen size |
| FluoSpheres NeutrAvidin labeled microspheres, 1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8776 | Manufacturers produce this product in various colors |
| Melon Gel IgG Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 45212 | Care should be taken to verify the purity of Ab samples by SDS-page. |
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