Summary
Vi presenterer en high-throughput flowcytometrisk assay å bestemme phagocytic aktiviteten av antigen-spesifikke antistoffer fra kliniske prøver, utnytte fluorescerende antigen-belagt perler og en monocyttisk cellelinje som uttrykker flere Fc reseptorer, gir reseptor bruk og phagocytic aktivitet bestemmelser i et standardisert og reproduserbar mote for enhver antigen av interesse.
Abstract
Antistoff-drevet fagocytose er indusert via engasjement av Fc-reseptorer på profesjonelle fagocytter, og kan bidra til både klaring samt patologi sykdom. Mens egenskaper variable domener av antistoffer har lenge vært ansett avgjørende for in vivo funksjon, har evnen av antistoffer til å rekruttere medfødte immunceller via deres Fc domener blitt stadig mer verdsatt som en viktig faktor i effekt sine, både i innstillingen av rekombinant monoklonalt antistoff terapi, så vel som i løpet av naturlig infeksjon eller vaksinasjon 1-3.
Viktigere, til tross for sin nomenklatur som en konstant domene, gjør antistoff Fc domenet ikke har konstant funksjon, og er sterkt modulert av IgG subklasser (IgG1-4) og glykosylering på aspargin 297 4-6. Dermed til denne metoden studere funksjonelle forskjeller av antigen-spesifikke antistoffer i kliniske prøver vil lette korrelasjon av fagocytisk pottenential av antistoffer mot sykdommen tilstand, mottakelighet for infeksjon, progresjon, eller klinisk utfall.
Videre er denne effektor funksjon spesielt viktig i lys av de dokumenterte evne antistoffer til å forbedre infeksjon ved å gi patogener tilgang til vertsceller via Fc reseptor-drevet fagocytose 7. I tillegg er det noen bevis på at phagocytic opptak av immunkomplekser kan påvirke Th1/Th2 polarisering av immunrespons 8.
Her beskriver vi en analyse designet for å oppdage forskjeller i antistoff-indusert fagocytose, som kan være forårsaket av differensial IgG subklasse, glycan struktur på Asn297, samt evnen til å danne immunkomplekser av antigen-spesifikke antistoffer i en high-throughput fashion . For dette formål er 1 mikrometer fluoriserende perler belagt med antigen, deretter inkubert med kliniske antistoff prøver, genererer fluorescerende antigen spesifikke immunkomplekser. Disse antibody-opsonized perler blir deretter inkubert med en monocyttisk cellelinje som uttrykker flere FcγRs, inkludert både hemmende og aktivisering. Assay utgang kan omfatte phagocytic aktivitet, cytokiner sekresjon, og mønstre av FcγRs bruk, og er fast bestemt på en standardisert måte, gjør dette til et svært nyttig system for parsing forskjeller i denne antistoff-avhengig effektor funksjon i både smitte og vaksine-mediert beskyttelse 9.
Protocol
1. Kultur fagocytisk Cells
- Kultur THP-1 celler 10 i RPMI 1640 supplert med 10% føtal bovint serum som en stasjonær suspensjon i T kolber. Cell tetthet bør opprettholdes under 0.5x10 6 / ml for å opprettholde konsistente nivåer av FcγR uttrykk og analyseytelsen.
2. Forbered biotinylert Antigen
- Beregn mengden av sulfo-NHS LC biotin reagenssett nødvendig å biotinylate målet antigen av interesse i henhold til produsentens anvisninger.
- Oppløs biotinylation reagens i vann og umiddelbart legge beregnet beløpet til antigen i en buffer som ikke inneholder primære aminer. La reaksjonen å gå videre i 1 time ved romtemperatur, miksing og til.
- Fjern overflødig, ukonjugert biotin ved buffer utveksling i en Amicon sentrifugal konsentrasjon enhet av en passende molekylvekt cutoff å beholde target antigen. Legg til prøven til den øverste kammer av konsentrasjonen enheten og legge PBS å bringe det totale volum opp til 15 ml fylle linje. Sentrifuger ved 4000 xg å få volum ned til ca 1,5 MLS. Gjenta denne prosessen to ganger vil fjerne 99% av de gratis biotin for å sikre maksimal belegg av antigen til perler.
3. Forbered Antigen Mettet Perler
- Vask 100 mL av 1 mm fluorescerende neutravidin perler to ganger i 1 ml 0,1% PBS-BSA etter å spinne ned i en mikrosentrifuge i høy hastighet. Resuspender vasket perler i 100 mL PBS-BSA, og alikvoter i 10 rør.
- Å bestemme antigen belegg forhold som metter perler, kombinerer 10 ul av vasket perle oppheng med varierende konsentrasjoner av biotinylert antigen i to-fold trinn. Inkuber over natten ved 4 ° C i en mikrosentrifuge tube på en rotator.
MERK: Metning av perler må bestemmes eksperimentelt. Dette kan gjøresved å identifisere bead-coating forhold som gir maksimal fagocytose når perler er senere opsonized med en kontroll monoklonalt antistoff.
- Fjern ubundet antigen ved å vaske med 1 mL PBS-BSA og sentrifuger ved høy hastighet inntil perlene er pelleterte. Fjern PBS-BSA og gjenta.
- Resuspender antigen-belagt perler i en endelig volum på 1 ml i PBS-BSA. Perler kan lagres i opptil en uke ved 4 ° C før bruk.
Fire. Forbered Antistoff Prøver
- Kliniske antistoff prøver kan bli renset fra plasma ved hjelp av en Melon gel IgG renselse kit henhold til produsentens instruksjoner. Renset IgG kan lagres ved 4 ° C til alt er klart til bruk.
MERK: Riktig forholdsregler vedrørende håndtering av humane prøver må alltid blitt tatt.
- Bestem konsentrasjonen av renset antistoff av absorbans ved A280, og fortynn prøvene til 1 mg / ml i PBS.
- Forbered positive og negative monoklonale kontroll antistoffer ved fortynning til 1 mg / ml i PBS.
5. Plating av Experiment
- Resuspender vasket, antigen mettet perle løsning tilberedes over av virvling, og overføre 10 mL i hver brønn av en rund-bottom 96 bra plate. Hensyn må tas til kontinuerlig agitere perlen suspensjon for å sikre lik antall fluoriserende perler blir lagt til hver brønn.
- Legg varierende konsentrasjoner av antistoffer av interesse for hver brønn, skaper en dose-respons-kurve for hvert antistoff. Optimal konsentrasjon vil variere mellom prøver avhengig titer av antistoffer til stede, men en rekke 0,01 til 100 mikrogram / ml endelig konsentrasjon vil gi god dekning og tillate identifisering av konsentrasjonen spekter av interesse. Sørg for antistoffer er lagt i volumer ikke større enn 20 mL.
- Inkuber perler og antistoff prøver for 2 timer ved 37 ° C slik at antistoffer mot opsonize perlene. </ Li>
- Utarbeide en suspensjon av THP-1 celler på 2,5 x 10 5 celler / ml, og tilsett 200 mL av denne suspensjonen til hver brønn, for totalt 5 x 10 4 THP-1 celler i hver brønn.
- Inkuber over natten ved 37 ° C, 5% CO 2, i en stasjonær inkubator, slik at celler og perler til pellet via tyngdekraften.
MERK: Signal til støy kan bli bedre ved å bestemme den optimale perle: antistoff: THP-1 celler forholdstall for et gitt antigen og antistoff kilde.
Seks. Flowcytometrisk analyse
- Fjern 100 mL av supernatant fra hver brønn være forsiktig for ikke å forstyrre cellen pellet. Supernatant kan reddes hvis cytokin sekresjon bestemmelser eller andre analyser er ønsket.
- For fiksering, tilsett 100 mL 4% Paraformaldehyde til hver brønn og pipettér til resuspender og bland cellene.
- Høy gjennomstrømning flowcytometrisk analyse kan utføres ved hjelp av en BD LSR II er utstyrt med en HTS plateavleseren.
- Program programvare for å blande hver brønn tre ganger (100 mL mix volum) og analysere 30 mL, eller minst 2000 celle hendelser, for hver prøve.
- Innsamlede data kan analyseres i FlowJo eller tilsvarende programvare. Nyttige beregninger omfatter prosent av bead +, eller fluorescerende celler, som gir et mål på antall phagocytic celler til stede, samt fluorescens intensiteten av phagocytic cellene, som gir et mål på antall phagocytosed perler. Multiplisere disse verdiene genererer en integrert bety fluoriserende intensitet eller iMFI.
- Gjennomsnittlig antall perler phagocytosed av hver phagocytic celle kan beregnes ved å dividere iMFI ved midlere fluorescens av en perle.
7. Representant Resultater
Det bør være tydelig differensiering av antistoff prøver fra påvirket og upåvirket fag. Figur 1A viser FACS histogrammer av et antistoff prøve fra en HIV negative (svart spor) og en HIV-positive (grå spore) emne, og demonstrerer økt fagocytose drevet av tilstedeværelsen av antigen-spesifikke antistoffer.
Optimal sensitiviteten av analysen er avhengig metning av perler med biotinylert antigen. Figur 1B viser fagocytose observert når perler belagt med ulike mengder antigen var opsonized med 3 kontroll monoklonale antistoffer (inkludert en ikke-bindende antistoff, triangler), og etablerer 2μg antigen / mikroliter perler som en saturating konsentrasjon for dette antigen.
En dose-respons-kurven er presentert i figur 2, og demonstrerer differensial kapasitet underlagt antistoff prøver å indusere fagocytose over en antistoff konsentrasjon utvalg av 0,05 til 5 mikrogram / ml. Denne forskjellen fagocytose kan være drevet av enten forskjeller i titer eller Fc domenenavn egenskaper som IgG subklasse og glykosylering tilstand.
Når THP-1 celler er imaged med fluoriserende mikroskopi, er det klare bevis for perle fagocytose. Figur 3 presenterer to 63x stillbilder av THP-1 celler etter inkubering med antistoff opsonized (grønn) og ikke-opsonized (rød) perler, viser mangel på fagocytisk opptak i fravær av antistoff. Når tiden lapse mikroskopi utføres, er antistoff-spesifikke phagocytic opptak av fluoriserende perler enda mer slående (Movie 1, 20x forstørrelse).
Tidligere arbeid har bekreftet internalisering av perlene knyttet til cellene, og eksperimenter med primær monocytter har passet godt med phagocytic score (iMFI verdier) i denne high throughput analysen (data ikke vist).
Figur 1. Assay Quality Control. 1A, Flow cytometri histogrammer av fagocytose for et antistoff prøve fra en HIV-negative emne (svart spor) og en hivpositiv emne (grå spor).1B: Eksperimentell bestemmelse av den optimale perle belegg forhold for en prøve antigen. Antigen-spesifikke monoklonale antistoffer (sirkel, firkant) viser maksimal fagocytose av perler belagt med> 2 mikrogram antigen / mikroliter av perler, mens en kontroll antistoff (trekant) demonstrerer ingen fagocytisk aktivitet.
Figur 2. Fagocytose dose-respons kurve. Kliniske antistoff prøver fra HIV-positive (behandlet, ubehandlet, og viser kontroll av viral replikasjon i fravær av antiretroviral terapi) og HIV-negative personer drive fagocytose av gp120 (HIV konvolutt) belagt perler ulikt.
Figur 3. Effektiv internalisering. Mikroskopi bekrefter internalisering av antistoff-opsonized perler (grønn), mens ikke-opsonized perler forbli i solution (63x forstørrelse).
Movie 1. Time-lapse mikroskopi av antistoff-drevet fagocytose ble utført i løpet av 14 timer og tillater visualisering av fagocytisk aktiviteten av THP-1 celler benyttes i high-throughput analysen. Er grønne fluorescerende perler antistoff opsonized, rød fluoriserende perler gi en negativ kontroll. Klikk her for å se filmen.
Discussion
Analysen beskrives her gjør high-throughput analyse av fagocytisk aktiviteten til klinisk antistoff prøver ved å benytte en monocyttisk cellelinje lang benyttes til å studere phagocytic prosessene 10 og plate basert automatisert flow cytometri. Denne analysen er en fordel over andre i sin evne til nettopp karakterisere antigen-spesifikt antistoff undergrupper, slik at ikke bare for studier av forskjeller i fagocytose drevet av sykdom-spesifikke antistoffer fra forskjellige fag, men også studier av flere antigen særegenheter innenfor samme emne. Fordi antistoff rekruttering av medfødte effektorceller, inkludert monocytter og andre antigenpresenterende celler sterkt påvirker sykdommen resultatet 11-13, og er biologisk variabel avhengig antistoff geometri, IgG subklasse, og glykosylering ved Asparagine297 av Fc domenenavn 14-16, gir denne metoden for evaluering av en kritisk antistoff virkningsmekanisme. Videre, fordi antistoff-medirerte fagocytose blir utnyttet av enkelte patogener i løpet av infeksjonen 7,17,18, holder denne analysen løftet i evaluering av prosessen med antistoff-avhengige ekstrautstyr, og fremhever den doble natur fagocytose som et potensielt beskyttende, samt potensielt skadelige antistoff aktivitet.
Analysen beskrives kan benyttes til å analysere antistoffer fra kliniske prøver av pasientgrupper, men også av de vaksinerte, og kan tilpasses utnytte serum snarere enn renset IgG. I tillegg kan cytokin sekresjon i respons til fagocytose bli analysert fra kultur supernatanten, og påvirkning av spesifikke FCR kan bestemmes ved å bruke FCR-blokkerende antistoffer, slik at ikke bare forskjeller i phagocytic potens å være bestemt, men nedstrøms signalering hendelser, med innsikt inn i mekanismen, og kan bidra til å løse og forbedre forståelsen av denne immune mekanismen.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne støtte fra NIH 3R01AI080289-02S1, og Harvard University Center for AIDS Research Scholar Fellowship henhold til NIH / NIAID 2P30AI060354-07.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21935 |
|
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-50 membrane | EMD Millipore | UFC905024 | Filter unit size may vary according to antigen size |
| FluoSpheres NeutrAvidin labeled microspheres, 1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8776 | Manufacturers produce this product in various colors |
| Melon Gel IgG Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 45212 | Care should be taken to verify the purity of Ab samples by SDS-page. |
References
- Cartron, G. Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene. Blood. 99, 754-758 (2002).
- Ahmad, R. Evidence for a correlation between antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediating anti-HIV-1 antibodies and prognostic predictors of HIV infection. J. Clin. Immunol. 21, 227-233 (2001).
- Hashimoto, G., Wright, P. F., Karzon, D. T. Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza virus-infected cells. J. Infect Dis. 148, 785-794 (1983).
- Anthony, R. M., Nimmerjahn, F. Th . Curr. Opin. Organ Transplant. , (2010).
- Takai, T. Fc receptors and their role in immune regulation and autoimmunity. J. Clin. Immunol. 25, 1-18 (2005).
- Jefferis, R. Antibody therapeutics: isotype and glycoform selection. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 1401-1413 (2007).
- Halstead, S. B., O'Rourke, E. J. Dengue viruses and mononuclear phagocytes. I. Infection enhancement by non-neutralizing antibody. J. Exp. Med. 146, 201-217 (1977).
- Subramaniam, K. S. The absence of serum IgM enhances the susceptibility of mice to pulmonary challenge with Cryptococcus neoformans. J. Immunol. 184, 5755-5767 (2010).
- Ackerman, M. E. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. J. Immunol. Methods. 366, 8-19 (2011).
- Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1. Int. J. Cancer. 26, 171-176 (1980).
- Ward, E. S., Ghetie, V. The effector functions of immunoglobulins: implications for therapy. Ther. Immunol. 2, 77-94 (1995).
- Winiarska, M., Glodkowska-Mrowka, E., Bil, J., Golab, J. Molecular mechanisms of the antitumor effects of anti-CD20 antibodies. Front. Biosci. 16, 277-306 (2011).
- Takai, T. Fc receptors: their diverse functions in immunity and immune disorders. Springer Semin. Immunopathol. 28, 303-304 (2006).
- Yamaguchi, Y. Glycoform-dependent conformational alteration of the Fc region of human immunoglobulin G1 as revealed by NMR spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1760, 693-700 (2006).
- Anthony, R. M., Ravetch, J. V. A novel role for the IgG Fc glycan: the anti-inflammatory activity of sialylated IgG. Fcs. J. Clin. Immunol. 30, Suppl 1. S9-S14 (2010).
- Nimmerjahn, F., Anthony, R. M., Ravetch, J. V. Agalactosylated IgG antibodies depend on cellular Fc receptors for in vivo activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8433-8437 (2007).
- Marchette, N. J. Effect of immune status on dengue 2 virus replication in cultured leukocytes from infants and children. Infect. Immun. 24, 47-50 (1979).
- Fust, G. Neutralizing and enhancing antibodies measured in complement-restored serum samples from HIV-1-infected individuals correlate with immunosuppression and disease. AIDS. 8, 603-609 (1994).
