Summary
Nós apresentamos um ensaio de fluxo de alto rendimento por citometria de determinar a atividade fagocítica de antígenos-anticorpos específicos a partir de amostras clínicas, utilizando antígenos fluorescentes revestido contas e uma linha celular monocítica expressar múltiplos receptores Fc-proporcionando o uso do receptor e determinações atividade fagocitária em um padronizados e forma reproduzível para qualquer antígeno de interesse.
Abstract
Anticorpo-driven fagocitose é induzida através do envolvimento de receptores Fc em fagócitos profissionais, e pode contribuir tanto para a depuração, bem como a patologia da doença. Enquanto as propriedades dos domínios variáveis de anticorpos têm sido considerados cruciais para função in vivo, a capacidade de anticorpos para recrutar células do sistema imunológico inato via seus domínios Fc tornou-se cada vez mais apreciada como um fator importante para sua eficácia, tanto no cenário de recombinante terapia com anticorpos monoclonais, bem como no curso da infecção natural ou vacinação 1-3.
Importante, apesar de sua nomenclatura como um domínio constante, o anticorpo de domínio Fc não tem função constante, e é fortemente modulada por subclasse IgG (IgG1-4) e glicosilação de asparagina 297 4-6. Assim, este método para estudar as diferenças funcionais de antígeno-anticorpos específicos em amostras clínicas facilitará correlação do pote fagocíticaspreferencial de anticorpos para a susceptibilidade à doença do Estado, à infecção, a progressão ou evolução clínica.
Além disso, esta função efetora é particularmente importante à luz da capacidade documentado de anticorpos para aumentar a infecção através do acesso patógenos em células hospedeiras através de fagocitose receptor Fc-driven 7. Além disso, há algumas evidências de que a captação fagocitária de complexos imunes podem afetar a polarização Th1/Th2 da resposta imune 8.
Aqui, descrevemos um teste desenvolvido para detectar diferenças de anticorpos induzida pela fagocitose, que pode ser causada pelo diferencial de subclasse IgG, estrutura de glicano de Asn297, bem como a capacidade de formar complexos imunes de antígeno-anticorpos específicos de uma forma de alto rendimento . Para este fim, 1 mícron partículas fluorescentes são revestidas com antígeno, em seguida, incubadas com amostras clínicas de anticorpos, gerando fluorescente antígeno específico complexos imunes. Estes Antibody-opsonizadas grânulos são então incubadas com uma linha celular monocítica expressar FcγRs múltiplas, incluindo tanto inibitórios e ativar. Saída de ensaio pode incluir atividade fagocítica, secreção de citoquinas e padrões de uso FcγRs, e são determinados de forma padronizada, tornando este um sistema altamente útil para a análise de diferenças nesta função dependente de anticorpos efetoras em ambas as infecções e vacinas mediada protecção 9.
Protocol
1. As células fagocíticas cultura
- Cultura de células THP-1 10 em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino como uma suspensão estacionária em frascos T. Densidade celular deve ser mantida abaixo de 0.5x10 6 mL / a fim de manter níveis consistentes de expressão FcγR e desempenho do ensaio.
2. Prepare antígeno biotinilado
- Calcular a quantidade de sulfo-NHS kit reagente LC biotina necessário biotinylate o antígeno alvo de interesse de acordo com as instruções do fabricante.
- Dissolver o reagente Biotinilação em água e imediatamente adicionar o montante calculado ao antígeno em um buffer que não contém aminas primárias. Permitir que a reação continue por 1 hora em temperatura ambiente, mexendo ocasionalmente.
- Remover biotina, o excesso não conjugada por troca de buffer em uma unidade de concentração Amicon centrífuga de um corte de peso molecular apropriada para reter o targeantígeno t. Adicione a amostra para a câmara superior da unidade de concentração e adicione PBS para levar o volume total de até 15 mL linha de enchimento. Centrifugar a 4.000 xg para trazer volume para cerca de 1,5 mls. Repetindo este processo duas vezes irá remover 99% da biotina livre para garantir a cobertura máxima de antígeno para contas.
3. Prepare Beads Antígeno Saturada
- Lavar 100 l de 1 mm contas neutravidin fluorescentes duas vezes em 1 ml de 0,1% PBS-BSA após girar para baixo em uma microcentrífuga em alta velocidade. Ressuspender lavados contas em 100 l PBS-BSA, e alíquota em 10 tubos.
- Para determinar as condições de antígeno revestimento que saturam as contas, combine 10 ul da suspensão lavados talão com concentrações variando de antígeno biotinilado em duas vezes passos. Incubar overnight a 4 ° C em um tubo de microcentrífuga em um rotador.
NOTA: Saturação de contas devem ser determinadas experimentalmente. Isso pode ser feitoidentificando-revestimento talão condições que produzem fagocitose máximo quando contas são posteriormente opsonizadas com um anticorpo monoclonal controle.
- Remover antígeno não ligado por lavagem com 1 mL de PBS-BSA e centrifugar em alta velocidade até contas são peletizadas. Remover PBS-BSA e repita.
- Ressuspender antígeno revestido contas em um volume final de 1 ml em PBS-BSA. Contas pode ser armazenado por até uma semana a 4 ° C antes do uso.
4. Prepare amostras de anticorpos
- Amostras clínicas de anticorpos pode ser purificado a partir do plasma usando um gel Melon kit de purificação de IgG de acordo com as instruções dos fabricantes. IgG purificada pode ser armazenado a 4 ° C até que esteja pronto para uso.
NOTA: as devidas precauções ao manusear amostras humanas devem sempre foram tomadas.
- Determinar a concentração de anticorpos purificados por absorvência a A280, e diluir as amostras a 1 mg / ml em PBS.
- Prepare positive e negativos anticorpos monoclonais controle por diluição de 1 mg / ml em PBS.
5. Chapeamento do Experimento
- Ressuspender o lavado, o antígeno solução saturada talão preparada acima em vortex, e transferir 10 ml em cada poço de um de fundo redondo de 96 placa também. Cuidados devem ser tomados para melhorar continuamente a agitar a suspensão de esferas para assegurar igual número de partículas fluorescentes são adicionados a cada poço.
- Adicionar diferentes concentrações dos anticorpos de interesse de cada bem, criando uma curva dose-resposta para cada anticorpo. Concentrações ideais será diferente entre as amostras, dependendo da titulação de anticorpos presente, mas uma gama de 0,01-100 mcg / ml concentração final irá proporcionar uma boa cobertura e permitir a identificação da faixa de concentração de interesse. Garantir anticorpos são adicionados em volumes não maior do que 20 l.
- Contas de incubar e amostras de anticorpos para 2 horas a 37 ° C para permitir que os anticorpos para opsonize as contas. </ Li>
- Prepare uma suspensão de células THP-1 a 2,5 x 10 5 células / ml, e adicionar 200 mL da suspensão a cada poço, para um total de 5 x 10 4 células THP-1 em cada poço.
- Incubar durante a 37 ° C, 5% CO 2, em uma incubadora estacionária, permitindo que as células e os grânulos de pellet através da gravidade.
NOTA: Sinal de ruído pode ser melhorada através da determinação do talão ideal: anticorpo: THP-1 índices de células para uma fonte de antígeno-anticorpo dado.
6. Análise por citometria de fluxo
- Remova 100 ul de sobrenadante de cada poço com cuidado para não perturbar o pellet celular. Sobrenadante podem ser salvas se as determinações de citocinas secreção ou outras análises são desejados.
- Para fixação, adicione 100 ml de paraformaldeído 4% a cada poço e pipeta para ressuspender as células e misture.
- Análise de fluxo de alta vazão citometria pode ser realizada utilizando uma BD LSR II equipado com um leitor de placas HTS.
- Software programa para misturar todos os poços três vezes (100 mL de volume mix) e analisar 30 mL, ou pelo menos 2.000 eventos de células, de cada amostra.
- Os dados coletados podem ser analisados no programa FlowJo ou software equivalente. Métricas úteis incluem o percentual de + talão, ou células fluorescentes, que fornece uma medida do número de células fagocíticas presentes, bem como a intensidade de fluorescência das células fagocíticas, que fornece uma medida do número de contas fagocitados. Multiplicando esses valores gera uma intensidade média integrada fluorescentes ou iMFI.
- O número médio de grânulos fagocitados por cada célula fagocítica pode ser calculado dividindo o iMFI pela fluorescência média de um talão.
7. Resultados representante
Deve haver uma diferenciação clara de amostras de anticorpos de indivíduos afetados e não afetados. Figura 1A apresenta os histogramas FACS de uma amostra de um anticorpo nega HIVtiva (traço preto) e um sujeito HIV positivo (traço cinza), e demonstra a fagocitose aumentou impulsionada pela presença de antígeno-anticorpos específicos.
Ótima sensibilidade do ensaio é dependente de saturação das contas com o antígeno biotinilado. Figura 1B apresenta a fagocitose observado quando grânulos revestidos com diferentes quantidades de antígeno foram opsonizadas com 3 anticorpos monoclonais controle (incluindo um anticorpo não vinculativo, triângulos), e estabelece 2μg antígeno / mL contas como uma concentração de saturação para este antígeno.
A curva dose-resposta é apresentada na Figura 2, e demonstra a capacidade diferencial de amostras de anticorpos assunto para induzir fagocitose em uma faixa de concentração de anticorpos de 0,05-5 mcg / ml. Este fagocitose diferencial pode ser movida por qualquer diferença no título ou propriedades de domínio Fc como subclasse IgG e estadual de glicosilação.
Quando células THP-1 são imaged por microscopia fluorescente, há clara evidência de fagocitose talão. A Figura 3 apresenta duas imagens estáticas 63x de células THP-1 após a incubação com o anticorpo opsonizadas (verde) e não-opsonizadas (vermelho) contas, demonstrando a falta de absorção fagocíticas na ausência de anticorpos. Quando a microscopia de lapso de tempo é realizada, a absorção de anticorpos específicos fagocítica de partículas fluorescentes é ainda mais impressionante (Movie 1, ampliação de 20x).
Trabalho anterior confirmou interiorização das contas associadas com as células, e experimentos com monócitos primários concordaram bem com os índices de fagocitose (valores iMFI) neste ensaio alta taxa de transferência (dados não mostrados).
Figura 1. Controle de Qualidade de Ensaio. 1A, histogramas citometria de fluxo de fagocitose de uma amostra de anticorpos a partir de um tema HIV negativo (traço preto) e um sujeito HIV positivo (traço cinza).1B: determinação experimental do óptimas condições de revestimento talão para um antígeno da amostra. Antígeno-anticorpos monoclonais específicos (círculo, quadrado) demonstram fagocitose máxima de contas revestidas com> 2 mg de antígeno / mL de contas, enquanto um anticorpo de controle (triângulo) demonstra nenhuma atividade fagocítica.
Figura 2. Fagocitose curva dose-resposta. Clínica amostras de anticorpos HIV positivo (tratado, tratado, e exibindo controle da replicação viral na ausência de anti-retrovirais) e fagocitose disco HIV negativo assuntos da gp120 (envelope HIV) grânulos revestido de forma diferenciada.
Figura 3. Internalização eficiente. Microscopia confirma a internalização de anticorpos opsonizadas contas (verde), enquanto os não-opsonizadas contas permanecer no solution (63x ampliação).
Movie 1. Time-lapse de microscopia de anticorpos dirigidos a fagocitose foi realizado ao longo de 14 horas e permite a visualização da atividade das células fagocíticas THP-1 utilizados no ensaio de alto rendimento. Verde partículas fluorescentes são o anticorpo opsonizadas, vermelho partículas fluorescentes fornecer um controle negativo. Clique aqui para assistir o filme.
Discussion
O ensaio aqui descrito permite high-throughput análise da atividade fagocítica de amostras clínicas de anticorpos, utilizando uma linha celular monocítica muito utilizada para estudar os processos fagocíticas 10 e placa de citometria de fluxo baseado automatizado. Este ensaio é vantajoso sobre os outros em sua capacidade de caracterizar precisamente subconjuntos antígeno-anticorpo específico, permitindo não só para o estudo das diferenças de fagocitose impulsionado pela doença de anticorpos específicos de diferentes disciplinas, mas também estudar as especificidades de antígenos múltiplos dentro do mesmo assunto. Porque o recrutamento de anticorpos de células efetoras inata, como monócitos e células antígeno apresentando outros impactos fortemente a evolução da doença 11-13, e é biologicamente variável, dependendo da geometria de anticorpos, subclasse IgG, e glicosilação em Asparagine297 do domínio Fc 14-16, este método prevê avaliação de um mecanismo de anticorpos críticos da ação. Além disso, como medi-anticorpofagocitose ated é explorada por alguns patógenos durante o curso da infecção 7,17,18, este ensaio é uma promessa na avaliação do processo de dependente de anticorpos acessório, e destaca a natureza dual da fagocitose como potencialmente protetor, bem como potencialmente prejudiciais atividade de anticorpos.
O ensaio descrito pode ser utilizado para analisar os anticorpos a partir de amostras clínicas de populações de pacientes, mas também dos vacinados e podem ser adaptadas para utilizar soro em vez de IgG purificada. Além disso, a secreção de citocinas em resposta a fagocitose pode ser analisado a partir do sobrenadante da cultura, ea influência de FcR específico pode ser determinado usando FcR-anticorpos bloqueadores, permitindo não só as diferenças de potência fagocíticas a ser determinado, mas a jusante de sinalização de eventos, com uma visão em mecanismo, e pode ajudar a resolver e aperfeiçoar a compreensão deste mecanismo imunológico.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer financiamento do NIH 3R01AI080289-02S1, e Harvard University Center for AIDS Research Scholar Fellowship sob NIH / NIAID 2P30AI060354-07.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21935 |
|
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-50 membrane | EMD Millipore | UFC905024 | Filter unit size may vary according to antigen size |
| FluoSpheres NeutrAvidin labeled microspheres, 1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8776 | Manufacturers produce this product in various colors |
| Melon Gel IgG Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 45212 | Care should be taken to verify the purity of Ab samples by SDS-page. |
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