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Bioengineering

लाइव सेल प्रवास के लिए जाते एक तीन आयामी मैट्रिक्स में प्रोटीन fluorescently टैग व्यक्त कोशिकाओं की इमेजिंग

doi: 10.3791/3589 Published: December 22, 2011

Summary

सेल प्रवास जैसे सेलुलर प्रक्रियाओं को पारंपरिक रूप से दो आयामी, कठोर प्लास्टिक सतहों पर अध्ययन किया गया है. इस रिपोर्ट सीधे प्रोटीन स्थानीयकरण visualizing और अधिक physiologically प्रासंगिक, तीन आयामी मैट्रिक्स में पलायन कोशिकाओं में प्रोटीन गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है.

Protocol

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1. स्थिर सेल लाइन पीढ़ी (जैसे MDCK कोशिकाओं)

  1. एक P35 डिश में 80-90 confluency% प्लेट कोशिकाओं. दो कोशिकाओं 100% सहधारा monolayer, जो अभिकर्मक क्षमता कम हो जाएगा के रूप में मत करो.
  2. 2000 Lipofectamine का उपयोग ब्याज की प्लाज्मिड के साथ कोशिकाओं transfect. ऑप्टिमाइज़ अभिकर्मक शर्तों निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग.
  3. अगले दिन बीतने के दो P150 पेट्री डिश में कोशिकाओं. बड़े पकवान स्थिर कालोनियों के बीच काफी अंतर की अनुमति देने की सिफारिश की है.
  4. अगले दिन, मीडिया को बदलने के लिए और प्रत्येक पकवान 500 μg / G418 के मिलीलीटर जोड़ें. G418 एकाग्रता व्यक्तिगत सेल लाइनों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.
  5. मीडिया लगभग 2 सप्ताह के लिए हर दूसरे दिन बदलें. 2 सप्ताह के बाद, G418 - प्रतिरोधी कालोनियों फार्म शुरू, और नग्न आंखों से दिखाई देगा.
  6. एक औंधा फ्लोरोसेंट सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, GFP सकारात्मक कालोनियों की पहचान. एक sharpie कलम का उपयोग कर प्लेट पर इन कालोनियों को चिह्नित.
  7. एस के लिएटिशू कल्चर की थाली से कालोनियों electively trypsinize, बाहर मीडिया महाप्राण (व्यंजन), और कोशिकाओं पीबीएस या trypsin समाधान के साथ दो बार धोने. दूसरा धोने पर, बाहर सब समाधान नहीं महाप्राण (व्यंजन). थाली के तल पर एक तरल की पतली परत करने के लिए सुखाने से कोशिकाओं को रोकने के छोड़ दें.
  8. प्रत्येक चिह्नित कॉलोनी के लिए: एक निष्फल कपास झाड़ू का उपयोग करने के लिए कॉलोनी के किनारे के आसपास के रूप में संभव के रूप में में करीब पोंछ. यह गीला सेल कॉलोनी वाले क्षेत्र के एक द्वीप पैदा करेगा. पिपेट कॉलोनी पर 10 trypsin के μl. हर कॉलोनी के लिए दोहराएँ, और जल्दी से आगे बढ़ने के लिए सुखाने से बचने के. एक अनुभवी शोधकर्ता आम तौर पर प्रति P150 प्लेट ~ 12 कालोनियों को चुन सकते हैं.
  9. 37 पर थाली सेते ° सी 5-10 मिनट के लिए जब तक कोशिकाओं थाली से अलग और दौर दिखाई.
  10. प्रत्येक कॉलोनी के लिए: पिपेट कॉलोनी पर 10 trypsin μl, और ऊपर और नीचे एक दो बार विंदुक के लिए थाली से कोशिकाओं को अलग. फिर एक 24 अच्छी तरह से थाली में एक अच्छी तरह से एक में सभी कॉलोनी से कोशिकाओं विंदुक.
  11. <li> स्थिर कालोनियों के बाद बड़े हो गए हो, प्रत्येक कॉलोनी के प्रोटीन की अभिव्यक्ति मानक पश्चिमी धब्बा और immunofluorescence का उपयोग करने के लिए विश्लेषण किया है. आगे के विश्लेषण के लिए इन सेल लाइनों का विस्तार करें.

2. गिलास नीचे पकवान की इष्टतम कोलेजन बंधन (वैकल्पिक) के लिए भूतल संशोधन

  1. Silanize कांच, पिपेट 2% की 300 μl एक 10 मिमी खोलने के साथ प्रत्येक P35 डिश के कांच भाग पर 3-Aminopropyltrimethoxysilane समाधान. Silanization और पार से जोड़ने योजनाबद्ध के लिए चित्रा 1 देखें. 3-Aminopropyltrimethoxysilane फ़िल्टर्ड पानी में पतला है.
  2. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  3. Aminopropyltrimethoxysilane 3-समाधान महाप्राण (व्यंजन) और फ़िल्टर्ड पानी के साथ 10 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार धो लो.
  4. गर्म थाली पर पानी और जगह व्यंजन 50 से डिग्री सेल्सियस 1.5 घंटे के लिए सेट महाप्राण (व्यंजन). व्यंजन के पकवान से थोड़ा प्लेस में सबसे ऊपर है कि डिश में नमी से बच सकते हैं, तो.
  5. व्यंजन गर्मी से निकालें और सीओओ करने की अनुमति..
  6. पिपेट 2% प्रत्येक डिश के कांच भाग पर glutaraldehyde समाधान के 300 μl. glutaraldehyde पीबीएस में पतला है.
  7. 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  8. Glutaraldehyde समाधान महाप्राण (व्यंजन) और पीबीएस 10 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार के साथ बर्तन धोने.
  9. 1 घंटे के लिए यूवी प्रकाश के लिए जोखिम के व्यंजन जीवाणुरहित. silanized व्यंजन कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है.

3. ट्रेसर कणों के साथ 3 डी कोलेजन जेल की तैयार

  1. नीचे शेयर 5 मिनट के लिए 15,000 rpm पर एक अपकेंद्रित्र में ट्रेसर कण (10 10 कणों / मिलीलीटर) के 100 μl कताई द्वारा फ्लोरोसेंट ट्रेसर कणों धो, तरल महाप्राण (व्यंजन), और मीडिया के 500 μl जोड़ें. 5 बार दोहराएँ. पिछले धोने के बाद, मीडिया के 30 μl में resuspend कणों.
  2. सामान्य रूप से व्यक्त कोशिकाओं GFP Trypsinize.
  3. Resuspend सेल गोली लगभग 2 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल.
  4. पिपेट वृद्धि मीडिया के एक Eppendorf ट्यूब में 240 μl.
  5. 12.6 1M Hepes के μl, फ़िल्टर्ड पानी की 20 μl, सेल के समाधान के 50 μl, तो फ्लोरोसेंट कणों के 10 μl जोड़ें.
  6. अन्त में, गोजातीय dermis कोलेजन मैं समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल के एक काम एकाग्रता प्राप्त) के 167 μl जोड़ें.
  7. समाधान अच्छी तरह मिक्स, तो silanized गिलास नीचे पकवान के गिलास भाग पर समाधान का 80 μl विंदुक.
  8. इनक्यूबेटर में प्लेस पकवान और जेल 37 भाजन करना करने की अनुमति ° सी 30 मिनट के लिए. एक P35 गिलास नीचे डिश में ठेठ कोलेजन जेल के लिए चित्रा 1A देखें.
  9. विकास मीडिया के 2 मिलीलीटर ध्यान से प्रत्येक पकवान जोड़ें.

4. समय चूक की छवि अधिग्रहण के लिए प्रक्रिया

  1. बाड़े की खुर्दबीन तापमान नियंत्रण पर मुड़ें और 37 सी. सेंटीग्रेड गुंजाइश चैम्बर एक स्थिर राज्य के तापमान को संतुलित करना जीना सेल इमेजिंग प्रणाली का एक उदाहरण के लिए चित्र 2 देखें.
  2. नए 25 मिमी Hepes के साथ पूरक करने के लिए एक तटस्थ पीएच बनाए रखने मीडिया के लिए मीडिया बदलें. के लिएडीआईसी इमेजिंग, मुद्रा है कि एक गिलास के ऊपर है साथ पकवान की शीर्ष. Parafilm की एक पतली पट्टी का प्रयोग, पकवान के पक्ष को कवर करने के लिए मीडिया वाष्पीकरण को रोकने के.
  3. एक तेल विसर्जन उद्देश्य के लिए, उद्देश्य पर एक विसर्जन द्रव की बूंद जगह है.
  4. कोलेजन खुर्दबीन मंच पर पकवान युक्त जेल प्लेस, और सुनिश्चित करें कि पकवान विसर्जन तरल के साथ संपर्क बनाता है.
  5. नमूना और छवि के लिए ब्याज की कोशिकाओं के लिए खोज पर ध्यान दें. चरण बहाव को कम करने के लिए, पकवान के बारे में 45 मिनट के लिए एक लंबे समय पर कब्जा शुरू करने से पहले व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं.
  6. छवि अधिग्रहण के पैरामीटर निर्दिष्ट करें. छोटा लेजर जोखिम है, जो कोशिकाओं modulating लेसर शक्ति, एक्सपोज़र समय, आवृत्ति और कब्जा समय की अवधि द्वारा खराब कर सकती हैं. वास्तविक पैरामीटर खुर्दबीन प्रणाली और सेल प्रकार के साथ अलग अलग होंगे.
  7. समय चूक अधिग्रहण के दौरान, एक अवरोध करनेवाला जोड़ा जा सकता है. अवरोध करनेवाला के अलावा प्रयोग के लिए, parafilm के साथ पकवान नहीं मुहर नहीं है.
    1. प्रस्तुत करने काहैं Hepes एक वांछित काम कर रहे एकाग्रता में दवा के साथ मीडिया के पूरक हैं.
    2. तैयार जब दवा थामने छवि पर कब्जा, मीडिया, जोड़ने के लिए और ध्यान पकवान परेशान बिना पकवान शीर्ष निकालने.
    3. बाहर पकवान में मीडिया महाप्राण (व्यंजन), और डिश में मीडिया से युक्त दवा विंदुक. फिर, ध्यान से पकवान ऊपर की जगह.
    4. नमूना नए मीडिया के अलावा की वजह से हो सकता है बाहर के ध्यान, ध्यान रद्दोबदल.
    5. कब्जा पुनरारंभ करें, तो अगले 30 मिनट के लिए कब्जा की निगरानी, ​​और आवश्यक के रूप में ध्यान केंद्रित रद्दोबदल. नशीली दवाओं के अलावा प्रयोग के एक उदाहरण के लिए चित्रा 4 देखें.

5. FRAP प्रक्रिया और विश्लेषण

  1. FRAP सेटअप बदलता प्रणालियों के बीच, निर्माता के अनुदेश का पालन करें.
  2. जीना सेल इमेजिंग के लिए पैरामीटर सेट.
  3. Photobleaching के लिए पैरामीटर सेट. सेल को नुकसान पहुँचाए बिना फ्लोरोसेंट संकेत photobleach पर्याप्त लेजर शक्ति का प्रयोग करें. इन बराबर का परीक्षणअभ्यास कोशिकाओं पर ameters.
  4. छवि पर कब्जा प्रारंभ करें, और ब्याज के क्षेत्र photobleaching से पहले छवि पर कब्जा करने के कम से कम 5 फ्रेम की अनुमति.
  5. कब्जा जारी रखें, और वसूली समय पूर्ण प्रतिदीप्ति वसूली पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए. FRAP प्रयोग का एक उदाहरण के लिए 5 चित्रा देखें.
  6. Photobleached क्षेत्र की औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता (पहले और photobleaching के बाद) समय के साथ मापने के द्वारा प्रतिदीप्ति वसूली का विश्लेषण. एक सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे एक्सेल) का प्रयोग, घातीय समीकरण वसूली वक्र फिट: मैं मैं = च (1 ई - के.टी.), जहाँ मैं तीव्रता है, मैं च अंतिम तीव्रता है, टी समय है, और τ साढ़े समय यह तीव्रता के लिए लेता है आधा अंतिम मूल्य तक पहुँचने है: τ साढ़े = (2) एल.एन. / के.एच. आधे समय प्रोटीन की गतिशीलता की दर का एक उपाय है.
  7. पैरामीटर, आधे समय और घातीय फिट वक्र से अंतिम तीव्रता प्राप्त करते हैं. वें परिकलितई प्रारंभिक प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए अंतिम के अनुपात लेने के द्वारा मोबाइल अंश.

6. प्रतिनिधि परिणाम

मैट्रिक्स के भीतर स्वस्थ उपकला कोशिकाओं के रहने कक्ष इमेजिंग के एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया गया है. स्वस्थ कोशिकाओं एक्ज़िबिट एक चिकनी, सतत झिल्ली, और अलग नाभिक, जबकि अस्वस्थ कोशिकाओं अक्सर एक बाधित झिल्ली, और vacuoles का एक अत्यधिक संख्या है. एक 3 डी मैट्रिक्स में, एक उपकला कोशिकाओं 1 विस्थापित हो, और कई दिनों के पाठ्यक्रम पर, उपकला कोशिकाओं 2 मैट्रिक्स के भीतर तीन आयामी, गोलाकार, बहु सेलुलर अल्सर के रूप में. कोशिकाओं को भी अत्यधिक गतिशील हैं, और पुटी (चित्रा 3) के भीतर विस्थापित. कर्षण पलायन कोशिकाओं द्वारा exerted बलों का एक परिणाम के रूप में मैट्रिक्स विरूपण ट्रेसर आसपास के मैट्रिक्स (चित्रा 4) में एम्बेडेड कणों के विस्थापन के माध्यम से विश्लेषण किया है. ट्रेसर कण आंदोलनों अलग अधिकतम प्रक्षेपण छवि के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैंent समय अंक, और हर बार बिंदु छद्म रंग है समय (4B चित्रा) से संकेत मिलता है. वैकल्पिक रूप से, एक व्यक्ति ट्रेसर कण की छवियों को एक असेंबल समय पर ट्रेसर कण (चित्रा 4C) के आंदोलन को दिखाने के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं. सभी छवि विश्लेषण ImageJ का उपयोग किया गया था. मैट्रिक्स विरूपण के इन गुणात्मक मूल्यांकन, और इसलिए पलायन कोशिकाओं द्वारा exerted बलों, कर्षण बल वितरण की उपयोगी पहली सन्निकटन हैं. कर्षण 3 डी में पलायन कोशिकाओं द्वारा exerted बलों के आकलन मात्रात्मक इस प्रोटोकॉल के दायरे से परे है और 3,4 कहीं से वर्णित है.

प्रयोग photobleaching के बाद एक ठेठ प्रतिदीप्ति वसूली चित्रा 5 में दिखाया गया है. ब्याज के क्षेत्र अनुकूलित लेजर सेटिंग्स का उपयोग ताकि प्रतिदीप्ति तीव्रता दिख पृष्ठभूमि स्तर (संकेत करने वाली शोर अनुपात को अधिकतम करने के) के लिए है की तुलना में कम है, जबकि स्वस्थ और undamaged कोशिकाओं को बनाए रखने photobleached होना चाहिए. इष्टतम सेटिंग ख चाहिएई empirically निर्धारित के रूप में प्रत्येक FRAP सेटअप अलग है (जैसे, FRAP का उपयोग लेजर स्कैनिंग confocal प्रणाली).

और बाद FRAP छवि अधिग्रहण के समय अंतराल जोखिम को ध्यान से पृष्ठभूमि photobleaching से बचने के लिए नियंत्रित होना चाहिए. कम लेसर शक्ति, कम जोखिम के समय, और संवेदनशील कैमरे के उपयोग और उच्च कुशल प्रकाशिकी का उपयोग उच्च गुणवत्ता FRAP इमेजिंग के लिए आवश्यक हैं. यदि छवि अधिग्रहण के दौरान विरंजन प्रतिदीप्ति महत्वपूर्ण है, इस पृष्ठभूमि लुप्त होती और मात्रा निर्धारित किया जा चाहिए मनाया प्रतिदीप्ति तीव्रता वसूली से सामान्यीकृत. पर्यावरण के 3 डी प्रकृति के कारण, प्रतिदीप्ति तीव्रता वसूली के z घटक महत्वपूर्ण हो सकता है. इसलिए, यह महत्वपूर्ण है से पहले और बाद 3 डी photobleached क्षेत्र के ढेर छवियों को लेने के द्वारा एक photobleached मात्रा परिभाषित. प्रतिदीप्ति वसूली के आगे के विश्लेषण और मॉडलिंग 5,6 कहीं चर्चा की है .

जीना सेल इमेजिंग टी के अद्वितीय संयोजनechniques: GFP cytoskeletal प्रोटीन, लाल प्रतिदीप्ति ट्रेसर कणों की गतिशीलता का पालन करने के लिए मैट्रिक्स, विरूपण, और inhibitors के अलावा निगरानी के लिए, प्रोटीन गतिशीलता, कर्षण बल और आणविक रास्ते के विश्लेषण के लिए एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 कोलेजन जेल की तैयारी. गिलास नीचे के एक डिश पर एक) polymerized मैट्रिक्स कोलेजन. जेल के गुलाबी रंग एम्बेडेड फ्लोरोसेंट कणों की वजह से है. बी) प्रक्रिया गिलास नीचे व्यंजन के इलाज के लिए कांच की सतह कोलेजन जेल crosslink. सबसे पहले, गिलास नीचे पकवान 3 Aminopropyltrimethoxysilane समाधान, तो glutaraldehyde समाधान है कि गिलास मैट्रिक्स कोलेजन crosslinks के साथ व्यवहार किया जाता है.

चित्रा 2
चित्रा 2 / confocal FRAP खुर्दबीन सेटअप के Schematics. confocalखुर्दबीन CoolSnap मुख्यालय द्वितीय सीसीडी कैमरा के साथ एक Zeiss AxioObserver पर आधारित है और पूरी तरह से Slidebook सॉफ्टवेयर (इंटेलिजेंट इमेजिंग नवाचार) द्वारा स्वचालित. confocal इकाई कस्टम डिजाइन और Yokogawa कताई डिस्क CSU10 इकाई और दो acousto ऑप्टिकल Tunable फ़िल्टर (AOTF) के साथ ठोस राज्य पराबैंगनीकिरण (50 मेगावाट और 40 मेगावाट के साथ 561 एनएम के साथ 488 एनएम) के आधार पर दो लेज़रों के बीच स्विचन मिसे की अनुमति है. उत्सर्जन फिल्टर 525/50 एनएम और 620/60 एनएम (118,661 # और # 118085, Chroma प्रौद्योगिकी) कर रहे हैं और dichroic दर्पण 488-568 BrightLine दोहरी बैंड (Semrock) है. उद्देश्यों NA 1.1 और 0.62 मिमी की दूरी काम के साथ एक लंबी दूरी काम 40x उद्देश्य सी Apochromat, और योजना Apochromat उद्देश्य 1.4 एनए के साथ एक 63x और 0.19 मिमी की दूरी काम कर रहे हैं. माइक्रोस्कोप भी एक FRAP photoablation प्रणाली शामिल है कि एक फाइबर ऑप्टिकली डाई लेजर, एक कंप्यूटर नियंत्रित बीम की स्थिति और तीव्रता, और एक विवर्तन सीमित स्थान आकार पंप के होते है. इसके अलावा, माइक्रोस्कोप के साथ सुसज्जित हैएक xy motorized मंच है कि 0.1 प्रत्येक अक्ष पर माइक्रोन रैखिक encoders शामिल हैं. समय चूक इमेजिंग के दौरान, पर्यावरण तापमान एक कस्टम डिजाइन खुर्दबीन कक्ष और एक प्रतिक्रिया तापमान नियंत्रण के साथ एक हीटर द्वारा बनाए रखा है. किसी भी शोर और कंपन को अलग करने के लिए, पूरे खुर्दबीन प्रणाली एक कंपन से मुक्त मेज पर है.

चित्रा 3
चित्रा 3. GFP-actin व्यक्त उपकला कोशिकाओं के सेल इमेजिंग जीते. इन कोशिकाओं को संस्कृति के दिनों के बाद एक 3 डी मैट्रिक्स कोलेजन में 4 एक पुटी गठन. कुछ कक्षों पुटी (पीले arrowhead) की सतह के साथ ले जाते हैं, जबकि दूसरों को पुटी (लाल arrowhead) के इंटीरियर के भीतर विस्थापित. स्केल 10 बार सुक्ष्ममापी, घंटों में समय.

चित्रा 4
चित्रा 4 कर्षण बल पर रो - kinase के प्रभाव निषेध. ए) एक पलायन MDCK जी व्यक्त सेल की डीआईसी छविएफपी परमाणु मार्कर टैग. छवि तुरंत रो - kinase अवरोध करनेवाला वाई 27,632 के उपचार से पहले लिया गया था. स्केल बार 10 सुक्ष्ममापी. बी) कण विस्थापन वाई २७,६३२ के अलावा से जिसके परिणामस्वरूप. विभिन्न समय अंक (0 - 52 मिनट) पर कण पदों तीव्रता पैमाने के अनुसार छद्म रंग थे, तो एक एकल छवि पर पेश. सफेद क्षेत्र पलायन कोशिकाओं में GFP सकारात्मक नाभिक है. स्केल बार 10 सुक्ष्ममापी. मिनटों में समय. सी) सेल के अनुगामी किनारे पर कण आंदोलन (बी में तीर देखें). Asterisk पिछले वाई 27,632 अलावा पहले कब्जा कर लिया फ्रेम अर्थ. ट्रेसर कण की ओर और दूर से पलायन सेल के अनुगामी पहले बढ़त और वाई 27,632 के अलावा के बाद क्रमश: चले गए. स्केल बार सुक्ष्ममापी 1.

चित्रा 5
चित्रा 5 GFP-actin की FRAP विश्लेषण एक तीन आयामी मैट्रिक्स में सेल पलायन व्यक्त. ए) के timelapse छवियों GFPactin के पहले और बाद photobleaching व्यक्त करने के सेल. सेल रियर में संचित GFP-actin के एक छोटे से क्षेत्र photobleached 0 timepoint पर (लाल arrowhead) था. सेकंड में समय पैमाने पर पट्टी 5 सुक्ष्ममापी. बी) photobleached क्षेत्र (ठोस लाइन), और प्रतिदीप्ति वसूली (हलकों) के घातीय फिट की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता समय पर प्लॉट किए जाते हैं. प्रतिदीप्ति तीव्रता photobleaching पहले प्रारंभिक मान को सामान्यीकृत था.

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Discussion

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हम यहाँ रहने कक्ष इमेजिंग का उपयोग करने के लिए एक तीन आयामी मैट्रिक्स में सेल प्रवास के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन. इस तकनीक की सफलता "अच्छा" stably GFP टैग प्रोटीन व्यक्त क्लोन प्राप्त करने पर निर्भर करता है. GFP प्रोटीन का स्तर कम एक अतिरिक्त उत्तेजना जोखिम है कि सेल के स्वास्थ्य समझौता, जबकि GFP बहुत उच्च स्तर सेल पर अवांछनीय दुष्प्रभावों होगा की आवश्यकता होगी. इस प्रकार, सदिश करने के लिए कोशिकाओं में जीन transfect पसंद महत्वपूर्ण है (उदाहरण के लिए, प्रमोटर, प्रतिदीप्ति टैग, आदि). वहाँ कई फ्लोरोसेंट GFP लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन 7,8 (आरएफपी) सहित, के अलावा अन्य टैग कर रहे हैं . इन प्रोटीन टैग विशिष्ट उत्तेजना प्रकाश तरंगदैर्ध्य, और इसलिए प्रतिदीप्ति फिल्टर के विभिन्न सेट की आवश्यकता होती है. इसके अलावा, विभिन्न एंटीबायोटिक प्रतिरोधी जीन (उदाहरण के लिए, G418, hygromycin, puromycin आदि) भी उपलब्ध हैं और स्थिर क्लोन उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

जीना सेल इमेजिंग के लिए, transiently कोशिकाओं ग ट्रांसफ़ेक्टएक भी इस्तेमाल किया जा. हालांकि यह समय और प्रयास करने के लिए एक स्थिर सेल लाइन विकसित करने की आवश्यकता कम से कम, transiently ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं आम तौर पर कर रहे हैं अस्वस्थ है, और इसलिए कम प्रयोगों में उपयोग के लिए विश्वसनीय है. इसके अलावा, transiently ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की आबादी व्यक्त और गैर व्यक्त कोशिकाओं की एक विषम मिश्रण है, और समय के साथ व्यक्त कोशिकाओं फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति खो देंगे. इसकी तुलना में, stably व्यक्त कोशिकाओं आम तौर पर कोशिकाओं और प्रोटीन अभिव्यक्ति स्थिर और सजातीय होना चाहिए की एक कॉलोनी से क्लोन कर रहे हैं, हालांकि अभिव्यक्ति के स्तर transiently व्यक्त कोशिकाओं की तुलना में कम हो जाएगा. चूंकि स्थिर कोशिकाओं की कॉलोनी के लिए एक एकल कोशिका से उत्पन्न है की संभावना है, यह महत्वपूर्ण है कि morphology और सामान्य, untransfected कोशिकाओं के लिए समान व्यवहार है, phenotypes कि केवल कि क्लोन के लिए विशिष्ट हैं (से बचने कालोनियों लेने जब तक ट्रांसफ़ेक्ट प्लाज्मिड है सेल आकारिकी उपद्रव) डिजाइन. एकाधिक कालोनियों पूर्व के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिएperiments clonal भिन्नता के कारण phenotypes से बचने के लिए. वैकल्पिक रूप से, वायरल अभिकर्मक या electroporation ब्याज की जीन परिचय करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस वायरल अभिकर्मक विशेष रूप से उपयोगी है के लिए मुश्किल कक्षों या प्राथमिक कोशिकाओं transfect (अन्य अभिकर्मक तकनीकों का विस्तृत प्रोटोकॉल इस पत्रिका में कहीं वर्णित).

इस प्रक्रिया के trickiest हिस्सा subcloning है. स्थिर क्लोन कपास झाड़ू विधि यहाँ वर्णित या वैकल्पिक रूप से, एक क्लोनिंग अंगूठी का उपयोग का उपयोग उठाया जा सकता है है. FACS GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के चयन के लिए एक अन्य विधि का उपयोग कर रहा है. FACS प्रतिदीप्ति तीव्रता की भयावहता पर आधारित कक्षों का चयन. इसकी तुलना में, क्लोनिंग विधि यहाँ वर्णित का उपयोग कर, उपयोगकर्ता नेत्रहीन न केवल GFP अभिव्यक्ति के स्तर और लेकिन यह भी अपने सेलुलर एक खुर्दबीन का उपयोग स्थानीयकरण की पहचान कर सकते हैं. इसके अलावा, FACS का उपयोग क्लोनिंग आम तौर पर कोशिकाओं के एक अधिक विषम जनसंख्या में परिणाम है. इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए, FACS हल कोशिकाओं किया जा सकता है96 अच्छी तरह से बर्तन में सीधे चढ़ाया है, इतना है कि एक अच्छी तरह से केवल एक कक्ष शामिल है. एकल कक्षों से उद्भव कालोनियों एक सजातीय जनसंख्या होना चाहिए.

गिलास नीचे पकवान (चित्रा 1) मैट्रिक्स कोलेजन संलग्न किया विधि रहने कक्ष और समय की एक विस्तारित अवधि के लिए एक जेल में इमेजिंग संवर्धन कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है. कांच को मैट्रिक्स संलग्न करने के लिए प्रारंभिक कदम एक silane monolayer के गठन है. Silane की विफलता के लिए एक monolayer में जमा अक्सर ग्लास से कोलेजन मैट्रिक्स टुकड़ी में परिणाम देगा. यह है क्योंकि मैट्रिक्स के भीतर एम्बेडेड कोशिकाओं सिकुड़ा कर्षण बल लागू, और मैट्रिक्स हटना करने के लिए कारण है, इस प्रकार पकवान से मैट्रिक्स टुकड़ी की संभावना बढ़ रही है. इसलिए, पकवान की silane / glutaraldehyde उपचार पकवान जेल लगाव को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. ध्यान दें कि कोलेजन विधानसभा शर्तों (एकाग्रता, समय, और पीएच) के लिए अलग कोलेजन टाइप और बैच के लिए अनुकूलित किया जा आवश्यकता हो सकती है. मेंइसके अलावा, प्रोटोकॉल कोलेजन या Matrigel या 9 मैट्रिक्स को व्युत्पन्न fibroblast जैसे अन्य 3D जैल के विभिन्न प्रकार के के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.

हालांकि कई कोशिकाओं HEPES बफर के जवाब में प्रतिकूल प्रभाव नहीं दिखा, कुछ कोशिकाओं को और अधिक नकचढ़ा हैं. समय चूक के अधिग्रहण के दौरान सेल स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए, सीओ 2 इनक्यूबेटर खुर्दबीन बाड़े के भीतर पीएच को नियंत्रित करने के लिए जोड़ा जा सकता है है. इसके अलावा, लेजर कोशिकाओं के लिए जोखिम कम से कम किया जाना चाहिए. यदि कोशिकाओं द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति भी मंद है, प्रतिदीप्ति और अधिक प्रभावी ढंग से एकत्र किया जा सकता है एक और अधिक संवेदनशील कैमरा, या एक बेहतर उद्देश्य, या एक अधिक कुशल फिल्टर सेट का उपयोग, आदि खुर्दबीन बाड़े के भीतर सेल आकारिकी अपने आकारिकी के साथ तुलना की जानी चाहिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में यकीन है कि कोशिकाओं को स्वस्थ और सामान्य रूप से बर्ताव कर रहे हैं बनाने के लिए. चूंकि इस पद्धति एकल कोशिका आधारित assays का वर्णन है, सेल करने वाली कोशिका कुछ बदलाव की उम्मीद है. इसलिए, प्रयोगों और योग्यता के रूप में डेटा को दोहराntification आवश्यक है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ. अनुदान Sumida धन्यवाद. यह काम एक Beckman युवा अन्वेषक पुरस्कार (SY), एक हेलमैन परिवार नई संकाय पुरस्कार (SY), एक NIH यूरेका, कैलिफोर्निया कैंसर रिसर्च समन्वय समिति के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen, bovine, Type I BD Biosciences 354231 Stock is about 3 mg/ml
3-aminopropyltrimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778 Dilute in water
glutaraldehyde Sigma-Aldrich 340855 Dilute in PBS
1M Hepes Invitrogen 15630-080
Fluospheres polystyrene microspheres 1 μm, red fluorescence (580/605) Invitrogen F13083
Geneticin (G418) Invitrogen 11811-031
DMEM Invitrogen 31600-034
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S115500
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
Kanamycin Invitrogen 15160-054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shih, W., Yamada, S., Myosin, A dependent retrograde flow drives 3D cell migration. Biophys. J. 98, (8), L29-L31 (2010).
  2. O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures. Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).
  3. Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat. Methods. 7, (12), 969-971 (2010).
  4. Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, (33), 13343-13348 (2007).
  5. Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, (6), 444-456 (2001).
  6. Phair, R. D., Misteli, T. Kinetic modeling approaches to in vivo imaging. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, (12), 898-907 (2001).
  7. Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. Fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, (5771), 217-224 (2006).
  8. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).
  9. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, (5547), 1708-1712 (2001).
लाइव सेल प्रवास के लिए जाते एक तीन आयामी मैट्रिक्स में प्रोटीन fluorescently टैग व्यक्त कोशिकाओं की इमेजिंग
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Shih, W., Yamada, S. Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix. J. Vis. Exp. (58), e3589, doi:10.3791/3589 (2011).More

Shih, W., Yamada, S. Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix. J. Vis. Exp. (58), e3589, doi:10.3791/3589 (2011).

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