Live-cell imaging att migrera celler som uttrycker fluorescerande-taggade proteiner i en tredimensionell matris

Summary

Cellulära processer såsom cell migration har traditionellt studerats på två-dimensionell, styv plast ytor. Denna rapport beskriver en teknik för att direkt visualisera protein lokalisering och analys av proteiner dynamik i celler vandrar i ett mer fysiologiskt relevant tredimensionell matris.

Abstract

Traditionellt har cell migration studerats på två-dimensionell, styv plast ytor. Men under viktiga biologiska processer som sårläkning, vävnadsregenerering och cancer metastaser, celler navigera genom komplexa, tredimensionella extracellulära vävnaden. För att bättre förstå mekanismerna bakom dessa biologiska processer är det viktigt att undersöka vilken roll de proteiner ansvarar för att driva cell migration. Vi presenterar här ett protokoll för att studera mekanismer för cell migration med hjälp av epitelceller linje (MDCK) och en tre-dimensionell, fibrösa, själv-polymerisation matris som modellsystem. Detta optiskt klar extracellulära matrisen är lätta att live-cell imaging studier och bättre efterliknar fysiologiska, mjukdelar miljö. Denna rapport visar en teknik för att direkt visualisera protein lokalisering och dynamik, och deformering av den omgivande tredimensionella matris.

Examnering av protein lokalisering och dynamik under cellulära processer ger viktig inblick i protein funktioner. Genetiskt kodade fluorescerande taggar ge en unik metod för att observation protein lokalisering och dynamik. Med denna teknik kan vi analysera subcellulära ansamling av nyckel, kraft-genererande cytoskelettala komponenter i realtid som cellen manövrar genom matrisen. Dessutom använder flera fluorescerande taggar med olika våglängder, kan vi undersöka lokalisering av flera proteiner samtidigt, vilket gör det möjligt för oss att testa, till exempel om olika proteiner har liknande eller olika roller. Dessutom kan dynamiken i fluorescerande taggade proteiner kvantifieras med hjälp av fluorescerande återhämtning efter fotoblekning (FRAP) analys. Denna mätning analyser proteinet rörlighet och hur stabilt bundna till proteiner till cytoskelettala nätverk.

Genom att kombinera live-cell imaging med behandling av inhibitorer proteiners funktion,kan vi undersöka i realtid på förändringar i fördelningen av proteiner och morfologi av flyttande celler. Dessutom kombinerar vi också live-cell imaging med hjälp av fluorescerande spårämne partiklar inbäddade i matrisen för att visualisera matrisen deformation vid cell migration. Därmed kan vi visualisera hur en vandrande cell distribuerar kraft-genererande proteiner och där dragkrafter är utövas till den omgivande matris. Genom dessa metoder kan vi få värdefull insikt i de rollerna av specifika proteiner och deras bidrag till mekanismer för cell migration.

Protocol

1. Generering av stabil cell linje (t.ex. MDCK celler)

1. Tavla celler vid 80-90% confluency i ett P35 maträtt. Låt inte cellerna bildar 100% konfluenta cellslager, vilket kommer att minska transfektion effektivitet.
2. Transfektera cellerna med hjälp av plasmiden av intresse att använda Lipofectamine 2000. Optimera transfektion villkor med tillverkarens protokoll.
3. Nästa dag, passage de celler i två P150 petriskålar. Den stora skålen rekommenderas att låta tillräckligt avstånd mellan stabila kolonier.
4. Nästa dag, bytt media och lägga till 500 mikrogram / ml G418 till varje maträtt. Det G418 Koncentrationen bör optimeras för enskilda cellinjer.
5. Ändra media varannan dag i ca 2 veckor. Efter två veckor bör G418-resistenta kolonier börjar form, och kommer att vara synlig med blotta ögat.
6. Med ett inverterat fluorescerande mikroskop, identifiera GFP positiva kolonier. Markera dessa kolonier på plattan med hjälp av en Sharpie penna.
7. Till selectively trypsinize kolonierna från vävnadsodling plattan, aspirera ut i media och tvätta cellerna två gånger med PBS eller trypsin lösningen. På den andra tvättar, inte aspirera inte ut all lösning. Lämna ett tunt lager vätska på botten av plattan för att förhindra att celler från uttorkning.
8. För varje märkt koloni: använd en steriliserad bomullspinne för att torka så nära som möjligt runt kanten av kolonin. Detta kommer att skapa en ö av våt yta som innehåller cellen kolonin. Pipettera 10 ìl av trypsin på kolonin. Upprepa för varje koloni, och gå snabbt att undvika uttorkning. En erfaren forskare kan oftast plocka ~ 12 kolonier per P150 platta.
9. Inkubera plattan vid 37 ° C i 5-10 minuter tills celler bort från plattan och visas runt.
10. För varje koloni: Pipettera 10 ìl av trypsin på kolonin, och pipettera upp och ner ett par gånger för att lösgöra cellerna från plattan. Sedan pipett alla celler från kolonin till en enda bra i en 24 bra maträtt.
<li> Efter stabila kolonier har vuxit, är protein uttryck för varje koloni analyseras med hjälp av standard western blot och immunofluorescens. Expandera dessa cellinjer för vidare analys.

2. Ytbearbetning av glas nedre skålen för optimal kollagen bindande (tillval)

1. För att silaniseras glas, pipett 300 l med 2% 3-Aminopropyltrimethoxysilane lösning på glaset del av varje P35 rätt med en 10 mm öppning. Se Figur 1 för silaniseringen och tvärbindning schematisk. 3-Aminopropyltrimethoxysilane späds ut i filtrerat vatten.
2. Inkubera i 1 timme i rumstemperatur.
3. Sug ut 3-Aminopropyltrimethoxysilane lösning och tvätta med filtrerat vatten tre gånger i 10 minuter vardera.
4. Sug ut vatten och placera rätter på värmeplatta inställd på 50 ° C i 1,5 timmar. Placera toppen av rätter något från skålen så att fukten i skålen kan fly.
5. Ta rätter från värmen och låt COOl.
6. Pipettera 300 l av 2% glutaraldehyd lösning på glaset del av varje maträtt. Den glutaraldehyd spätts i PBS.
7. Inkubera i 1 timme.
8. Sug ut glutaraldehyd lösningen och diska med PBS tre gånger i 10 minuter vardera.
9. Sterilisera rätter av exponering för UV-ljus i 1 timme. Den silaniseras rätter kan förvaras i rumstemperatur.

3. Beredning av 3D kollagen gel med spårljus partiklar

1. Tvätta fluorescerande spårämne partiklar genom att snurra ner 100 l i lager spårämne partiklar (10 ¹⁰ partiklar / ml) i en centrifugera vid 15.000 rpm i 5 minuter, aspirera ut vätskan och tillsätt 500 l av media. Upprepa 5 gånger. Efter sista tvättningen, återsuspendera partiklar i 30 l av media.
2. Trypsinize GFP-innehållande celler som vanligt.
3. Resuspendera cellpelleten till cirka 2 x 10 ⁶ celler / ml.
4. Pipettera 240 l av tillväxt medier i ett Eppendorf-rör.
5. Tillsätt 12,6 ìl 1M Hepes, 20 l filtrerat vatten, 50 l av cell-lösning, sedan 10 l av fluorescerande partiklar.
6. Slutligen tillsätts 167 ìl av nötkreatur dermis Collagen jag lösningen (att få en fungerande koncentration av 1 mg / ml).
7. Blanda lösningen ordentligt, sedan Pipettera 80 ìl av lösningen på glaset del av silaniserad glasbotten maträtt.
8. Placera skålen i kuvös och låt gelen polymerisera vid 37 ° C i 30 minuter. Se Figur 1A för typiska kollagen gel i en P35 glas botten maträtt.
9. Tillsätt 2 ml tillväxt media noggrant till varje maträtt.

4. Förfarande för time-lapse bild förvärv

1. Slå på temperaturkontroll av mikroskopet höljet och låta omfattningen kammaren jämvikt till en steady state temperaturen till 37 ° C. Se figur 2 för ett exempel på live-cell imaging system.
2. Ändra media till nya medier kompletteras med 25 mm Hepes att upprätthålla ett neutralt pH. FörDIC avbildning, utbyte toppen av skålen med en som har en glasskiva. Med hjälp av en tunn remsa av parafilm, täcker sidan av skålen för att förhindra att media avdunstning.
3. För en oljeimmersion mål, placera en droppe nedsänkning vätska på målet.
4. Placera kollagen gel som innehåller maträtt på mikroskop scenen, och se till att skålen får kontakt med nedsänkning vätska.
5. Fokus provet och söka efter celler av intresse för bild. För att minimera skede drift, gör rätt att bosätta sig i ca 45 minuter innan en lång fånga.
6. Ange parametrar för bildtagning. Minimera laserexponering, vilket kan skada celler, genom att modulera lasern makt, exponeringstid, frekvens och varaktighet fånga tiden. Den faktiska parametrarna kommer att variera med mikroskop systemet och celltyp.
7. Under time-lapse förvärv kan en inhibitor tillsättas. För hämmare Dessutom experimentet inte tätningen inte skålen med parafilm.
   1. Prepär Hepes kompletteras media med läkemedel vid önskad arbetstid koncentration.
   2. När du är redo att lägga drog till media, pausa bildfångst, och ta försiktigt bort skålen upp utan att störa skålen.
   3. Sug ut media i skålen, och pipettera drogen som innehåller material i skålen. Sedan försiktigt tillbaka skålen toppen.
   4. Provet kan vara out-of-fokus på grund av tillägg av nya medier, justera fokus.
   5. Starta om fånga, sedan övervaka att fånga för nästa 30 minuter och justera fokus som behövs. Se Figur 4 för ett exempel på drogberoende experiment.

5. FRAP förfarande och analys

1. Den FRAP inställning varierar mellan systemen, följa tillverkarens anvisningar.
2. Ställ in parametrar för live-cell imaging.
3. Ställ in parametrar för fotoblekning. Använd tillräckligt med laser makt att photobleach den fluorescerande signalen utan att skada cellen. Testa dessa parameters på praktiken celler.
4. Start Bildinsamling, och låt minst 5 bilder i Image Capture innan fotoblekning regionen av intresse.
5. Fortsätt fånga, och återhämtning bör vara tillräcklig för att ta tillvara alla fluorescens återhämtning. Se Figur 5 för ett exempel på FRAP experiment.
6. Analysera fluorescens återhämtning genom att mäta den genomsnittliga fluorescerande intensitet photobleached området (före och efter fotoblekning) över tiden. Med hjälp av en statistisk analys program (t.ex. Excel), passa återhämtningen kurvan till den exponentiella ekvationen: I = I _f ^(1-e-kt), där jag är intensiteten, jag _f är den slutliga intensitet, t tiden och τ _½ är den tid det tar för intensitet för att nå hälften av det slutliga värdet: τ _½ = ln (2) / K. I halvtid är ett mått på graden av rörlighet av proteinet.
7. Skaffa parametrar, halvtid och sista intensitet från den exponentiella-fit kurva. Beräkna the mobil bråkdel genom att förhållandet mellan den slutliga till första fluorescens intensiteter.

6. Representativa resultat

Ett exempel på live-cell imaging av friska epitelceller i matrisen visas i figur 3. Friska celler uppvisar en jämn, kontinuerlig membran, och distinkta kärnan, medan sjuka celler har ofta en störd membran, och alltför många vakuoler. I en 3D-matris, enda epitelceller migrera ^1, och under loppet av flera dagar, epitelceller bildar tredimensionella, sfäriska, flercelliga cystor i matris ^2. Cellerna är också mycket dynamisk och migrera inom cysta (Figur 3). Matrisen deformation på grund av den dragkraft krafter som migrerar cellerna analyseras genom förskjutning av spårämne partiklar inbäddade i den omgivande matris (Figur 4). Den spårämne partikel rörelser visas som en maximal projektion bild av olikaENT tidpunkter, och varje tidpunkt är pseudo-färgade för att indikera tiden (Figur 4B). Alternativt är bilder av ett enskilt spårämne partikel visas som ett montage för att visa förflyttning av spårämne partikeln över tid (Figur 4C). Alla bildanalys gjordes med hjälp ImageJ. Dessa kvalitativa bedömningar av matris deformation, och därför krafter genom att migrera celler, är användbara första approximation av dragkraft distribution. Den kvantitativa uppskattningen av dragkraft krafter som migrerar cellerna i 3D är utanför ramen för detta protokoll och beskrivs på annat håll ^3,4.

En typisk fluorescens återhämtning efter fotoblekning experiment visas i Figur 5. Regionen intresse måste photobleached med optimerade laser inställningarna så att fluorescensintensiteten synbart minskar jämfört med bakgrundshalter (för att maximera signal-brus-förhållande), samtidigt som friska och oskadade celler. Den optimala inställningen måste be bestämmas empiriskt eftersom varje FRAP inställning är olika (t.ex. FRAP med laser-scanning konfokala system).

Exponeringen och tidsintervall av post-FRAP bild förvärv skall kontrolleras noggrant för att undvika bakgrunden fotoblekning. Användningen av lägre laser makt, kort exponeringstid, och användningen av känsliga kamera och högeffektiva optik är avgörande för hög kvalitet FRAP bildbehandling. Om fluorescensen blekning under bilden förvärv är betydande, måste denna bakgrund blekning kvantifieras och normaliserade från det observerade fluorescensintensiteten återhämtning. Tack vare 3D natur miljön, får z-komponenten i fluorescensintensiteten återhämtning bli betydande. Därför är det viktigt att definiera en photobleached volym genom att ta före och efter 3D-stack bilder av photobleached regionen. Vidare analys och modellering av fluorescens återhämtning diskuteras någon annanstans ^5,6.

Den unika kombinationen av live-cell imaging techniques: GFP att följa dynamiken i cytoskelettala proteiner, röd fluorescens spårämne partiklar att följa matrisen deformation, och tillägget av inhibitorer, kan användas samtidigt för analys av protein dynamik, dragkraft och molekylära vägar.

Figur 1. Beredning av kollagen gel. A) polymeriserad kollagenmatrisen på ett glas botten skålen. Den rosa färgen på gelen beror på inbäddade fluorescerande partiklar. B) Förfarande för att behandla disken glaset botten för att Crosslink kollagen gel till glasytan. För det första är glaset nedre skålen som behandlats med 3-Aminopropyltrimethoxysilane lösning, då glutaraldehyd lösning som antipyridinantikropp kollagenmatrisen till glaset.

Figur 2. Schema för konfokala / FRAP mikroskop setup. Den konfokalamikroskop är baserad på en Zeiss AxioObserver med en CoolSnap HQ II-CCD-kamera och helt automatiserat av Slidebook programvara (Intelligent Imaging Innovations). Den konfokala Enheten är specialdesignade och baseras på Yokogawa spinning disk enhet CSU10 och två solid-state laser (488 nm med 50 mW och 561 nm med 40 mW) med Akusto-Optisk Avstämbara Filter (AOTF) för att millisekunder växla mellan två lasrar. Utsläppen filter är 525/50 nm och 620/60 nm (# 118.661 och # 118.085, Chroma Technology) och dikroiskt spegeln är 488-568 BrightLine Dual band (Semrock). Målen är en lång arbetsdag avstånd 40x C-Apochromat målet med NA 1,1 och arbeta avstånd på 0,62 mm och en 63x Plan-Apochromat målet med NA 1,4 och en arbetsgrupp avstånd av 0,19 mm. Mikroskopet ingår också ett system FRAP photoablation som består av ett fiber optiskt pumpad färgämneslaseroscillatorer, en datorstyrd balk position och intensitet och en diffraktion begränsad plats storlek. Dessutom är mikroskop utrustat medett xy-motoriserad skede som omfattar 0,1 mikron linjära pulsgivare på varje axel. Under time-lapse avbildning, är den omgivande temperaturen upprätthålls av en färdig konstruerad mikroskop kammare och ett aggregat med en återkoppling temperaturreglering. Att isolera eventuella buller och vibrationer, är hela mikroskop systemet på en vibrationsfri bord.

Figur 3. Levande cell imaging av epitelceller som uttrycker GFP-aktin. Dessa celler bildas en cysta efter 4 dagar av kultur i en 3D kollagenmatrisen. Vissa celler rör sig längs ytan av cysta (gul pil), medan andra flyttar inom det inre av cysta (röd pil). Skala bar 10 mikrometer, i timmar.

Figur 4. Effekten av Rho-kinas-hämning på dragkraft. A) DIC bild av en vandrande MDCK cell som uttrycker GFP taggade kärnkraft markör. Bilden togs omedelbart före behandling av Rho-kinas-hämmare Y-27.632. Skala bar 10 mikrometer. B) Partikel förskjutning från tillsats av Y-27.632. Partikeln positioner vid olika tidpunkter (0 - 52 min) var pseudo-färgad enligt intensitet skala, sedan projiceras på en enda bild. Den vita regionen är GFP-positiva kärnan i den vandrande celler. Skala bar 10 mikrometer. Tid i minuter. C) partikel rörelsen vid bakkanten av cellen (se pilen i B). Asterisk betecknar den sista bilden fångas innan Y-27.632 tillägg. Den spårämne partikel gick mot och bort från bakkanten på den vandrande cellen före och efter tillsats av Y-27.632, respektive. Skala bar 1 mikrometer.

Figur 5. FRAP analys av GFP-aktin uttrycka cellen vandrar i en tredimensionell matris. A) Timelapse bilder av GFP-actin uttrycka cell av före och efter fotoblekning. En liten region i GFP-aktin samlats på cell-bak var photobleached (röd pil) vid tidpunkterna 0. Tid i sekunder, Skalningsfält 5 ìm. B) Den genomsnittliga fluorescensintensitet av photobleached regionen (heldragen linje) och den exponentiella passar för fluorescens återhämtning (cirklar) plottas över tiden. Fluorescensintensiteten normaliserades till det ursprungliga värdet före fotoblekning.

Discussion

Här beskriver vi en metod för att använda live-cell imaging för att studera de mekanismer av cell migration i en tredimensionell matris. Framgången för denna teknik är beroende av att få "bra" kloner stabilt uttrycka GFP-märkta proteiner. Den låga GFP proteiner kommer att kräva ett överskott excitation exponering som kompromisser cell hälsa, medan för hög GFP nivå kommer att få oönskade biverkningar på cellen. Således är vektorn val att transfektera gener i celler viktiga (t.ex., promotorn, fluorescens tag, etc). Det finns många fluorescerande taggar än GFP, inklusive röda fluorescerande protein (RFP) ^7,8. Dessa protein taggar kräver specifik våglängd excitation ljus, och därför olika uppsättningar av fluorescens filter. Dessutom olika antibiotika resistenta gener (t.ex. G418, hygromycin, puromycin etc) är också tillgängliga och kan användas för att generera stabila kloner.

För live-cell imaging, övergående transfekterade celler Cen också användas. Även om detta minimerar den tid och ansträngning som krävs för att utveckla en stabil cellinje, övergående transfekterade cellerna är generellt ohälsosamma, och därmed mindre tillförlitliga för att användas i experiment. Dessutom är befolkningen av övergående transfekterade celler en heterogen blandning av uttryck och icke-uttryckande celler, och uttrycker cellerna förlorar fluorescerande protein uttryck över tid. I jämförelse är stabilt innehållande celler vanligen klonade från en enda koloni av celler och protein uttryck ska vara stabil och homogen, även om uttrycket nivå kommer att vara lägre än i tillfälligt uttrycka celler. Eftersom kolonin stabila celler har sannolikt sitt ursprung från en enda cell, är det viktigt att välja kolonier som har morfologi och beteende liknar normal, untransfected celler, för att undvika fenotyper som är specifika bara för att klona (om inte transfekterade plasmiden är utformade för att störa cellmorfologin). Flera kolonier bör användas för experiments att undvika fenotyper grund av klonat variation. Alternativt kan virala transfektion eller elektroporation användas för att införa gener av intresse. Detta virus transfektion är särskilt användbart för svåra att transfektera celler eller galvaniska element (se detaljerade protokoll från andra transfektion tekniker som beskrivs på annan plats i denna tidskrift).

Den svåraste delen av detta förfarande är subcloning. Stabil kloner kan plockas med metoden bomullspinne som beskrivs här, alternativt använda en kloning ring. En annan metod för att välja GFP-positiva celler använder FACS. FACS väljer celler som endast grundas på omfattningen av fluorescensintensiteten. I jämförelse med hjälp av kloning metoden som beskrivs här, kan användaren identifiera visuellt inte bara graden av GFP uttryck och utan också dess cellulär lokalisering med hjälp av ett mikroskop. Även resultat kloning med FACS vanligtvis i en mer heterogen population av celler. För att lösa detta problem, FACS-sorterat celler kanpläterade direkt in 96 bra rätter, så att varje brunn innehåller endast en cell. Kolonier som kommer från enskilda celler ska vara en homogen befolkning.

Den metod som används för att fästa kollagenmatrisen till glasbottnen skålen (Figur 1) är kritisk för live-cell imaging och celler odling i en gel under en längre tid. Det första steget för att fästa matrisen för att glaset är bildandet av en silan monolager. Fel på silan att sätta in en monolager kommer ofta resultera i kollagenmatrisen lossnar från glaset. Detta beror på att cellerna är förankrade i den matris som utövar kontraktila dragkrafter, och orsaka matrisen att krympa, vilket ökar sannolikheten för att matrisen lossnar från skålen. Därför är silan / glutaraldehyd behandling av skålen kritiska för att upprätthålla gel infästning i skålen. Observera att kollagen montering förhållanden (koncentration, tid och pH) kan behöva optimeras för olika kollagen typ och parti. IDessutom kan protokollet kan användas med olika typer av kollagen eller andra 3D-gel som Matrigel eller fibroblast härrör matris ^9.

Även om många celler inte visar negativa effekter till följd av HEPES buffert, en del celler är mer petiga. För att upprätthålla cellens hälsa under time-lapse förvärvet kan en CO ₂ inkubator läggas att kontrollera pH-värdet i mikroskop kapslingen. Dessutom bör laserexponering cellerna minimeras. Om den fluorescens som avges av cellerna är för svag, kan fluorescens samlas mer effektivt med hjälp av en mer känslig kamera, eller en bättre mål, eller ett mer effektivt filter som bör etc. cellmorfologin i mikroskop kapsling jämföras med dess morfologi i CO ₂ inkubator för att kontrollera att cellerna är friska och beter sig normalt. Eftersom denna metod beskriver enda cell baserade analyser, vissa cell till cell variation förväntas. Därför upprepade experiment och data quantification är viktigt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen, bovine, Type I	BD Biosciences	354231	Stock is about 3 mg/ml
3-aminopropyltrimethoxysilane	Sigma-Aldrich	281778	Dilute in water
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	340855	Dilute in PBS
1M Hepes	Invitrogen	15630-080
Fluospheres polystyrene microspheres 1 μm, red fluorescence (580/605)	Invitrogen	F13083
Geneticin (G418)	Invitrogen	11811-031
DMEM	Invitrogen	31600-034
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S115500
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Kanamycin	Invitrogen	15160-054