Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix

doi: 10.3791/3589 Published: December 22, 2011

Summary

Cellulaire processen zoals celmigratie van oudsher bestudeerd op twee-dimensionale, stijve kunststof oppervlakken. Dit rapport beschrijft een techniek voor het direct visualiseren eiwit lokalisatie en het analyseren van eiwitten dynamiek in cellen migreren in een meer fysiologisch relevante, drie-dimensionale matrix.

Abstract

Traditioneel is celmigratie onderzocht op twee-dimensionale, stijve kunststof oppervlakken. Echter, tijdens belangrijke biologische processen zoals wondgenezing, weefselregeneratie en kanker metastase, moeten cellen navigeren door complexe, driedimensionale extracellulaire weefsel. Om beter te begrijpen van de mechanismen achter deze biologische processen, is het belangrijk te onderzoeken of het rollen van de eiwitten die verantwoordelijk zijn voor het rijden celmigratie. Hier schetsen we een protocol om de mechanismen van celmigratie het gebruik van de epitheel cellijn (MDCK) te bestuderen, en een drie-dimensionale, vezelig, self-polymeriseren matrix als een modelsysteem. Dit optisch heldere extracellulaire matrix is ​​lastig om live-cell imaging studies en een betere bootst de fysiologische, weke delen omgeving. Dit rapport toont een techniek voor het direct visualiseren eiwit lokalisatie en dynamiek, en de vervorming van de omringende drie-dimensionale matrix.

Tentamenzoek van eiwit lokalisatie en dynamiek tijdens de cellulaire processen biedt belangrijke inzicht in de eiwit-functies. Genetisch gecodeerd fluorescerende labels bieden een unieke methode voor de waarneming eiwit lokalisatie en dynamiek. Met deze techniek kunnen we de subcellulaire accumulatie van de belangrijkste te analyseren, kracht-genererende cytoskelet componenten in real-time als de cel manoeuvres door de matrix. Daarnaast is het gebruik van meerdere fluorescerende labels met verschillende golflengten, kunnen we de lokalisatie van meerdere eiwitten tegelijk, waardoor we, test bijvoorbeeld of verschillende eiwitten gelijkaardige of uiteenlopende rollen. Bovendien kan de dynamiek van fluorescent gelabelde eiwitten worden gekwantificeerd aan de hand Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analyse. Deze meting assays het eiwit mobiliteit en hoe stabiel de eiwitten gebonden zijn aan het cytoskelet-netwerk.

Door de combinatie van live-cell imaging met de behandeling van eiwit functie-remmers,kunnen we nagaan in real-time de veranderingen in de verdeling van eiwitten en de morfologie van migrerende cellen. Verder hebben we ook combineren live-cell imaging met het gebruik van fluorescerende tracer deeltjes ingebed in de matrix van de matrix vervorming te visualiseren tijdens de celmigratie. Zo kunnen we visualiseren hoe een migrerende cel kracht-genererende eiwitten verdeelt, en waar de trekkrachten worden uitgeoefend met de omringende matrix. Door middel van deze technieken, kunnen we waardevol inzicht te krijgen in de rol van specifieke eiwitten en hun bijdragen aan de mechanismen van de cel migratie.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Het genereren van een stabiele cellijn (bijv. MDCK cellen)

  1. Plaat cellen op 80-90% confluentie in een p35 schotel. Laat geen cellen vormen 100% confluent monolaag, die transfectie-efficiëntie zal verminderen.
  2. Transfecteren de cellen met het plasmide van belang met behulp van Lipofectamine 2000. Optimaliseren transfectie omstandigheden met behulp van de fabrikant protocol.
  3. De volgende dag, passage van de cellen in twee P150 petrischaaltjes. De grote schaal wordt aanbevolen om voldoende afstand tussen de stal kolonies mogelijk te maken.
  4. De volgende dag, wijzigt u de media en voeg 500 ug / ml G418 aan elk gerecht. De G418 concentratie moet worden geoptimaliseerd voor de individuele cellijnen.
  5. Wijzig de media om de andere dag gedurende ongeveer 2 weken. Na 2 weken, moet G418-resistente kolonies beginnen te vormen, en zijn zichtbaar met het blote oog.
  6. Met behulp van een omgekeerde fluorescentie microscoop te identificeren GFP positieve kolonies. Markeer deze kolonies op de plaat met behulp van een Sharpie pen.
  7. Naar selectief trypsinize de koloniën van de weefselkweek plaat, zuigen uit de media, en twee keer was de cellen met PBS of trypsine oplossing. Op de tweede wassen, niet zuigen alles uit de oplossing. Laat een dun laagje vloeistof op de bodem van de plaat om cellen te voorkomen drogen.
  8. Voor elk gemarkeerd kolonie: gebruik een gesteriliseerd wattenstaafje om zo dicht mogelijk veeg rond de rand van de kolonie. Dit zal leiden tot een eiland van nat gebied met de cel kolonie. Pipetteer 10 ul van trypsine op de kolonie. Herhaal dit voor elke kolonie, en ga snel om uitdrogen te voorkomen. Een ervaren onderzoeker kan meestal kiezen ~ 12 kolonies per plaat P150.
  9. Incubeer plaat bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten tot de cellen los te maken van de plaat en verschijnen rond.
  10. Voor elke kolonie: Pipetteer 10 ul van trypsine op de kolonie, en op en neer een paar keer pipet om cellen van de plaat los te maken. Dan pipet alle cellen van de kolonie in een goed in een 24 goed gerecht.
  11. <li> Na een stabiele kolonies zijn gegroeid, eiwit expressie van elke kolonie wordt geanalyseerd met behulp van standaard western blot en immunofluorescentie. Vouw deze cellijnen voor verdere analyse.

2. Oppervlakte modificatie van glazen bodem schaal voor optimale collageen binding (optioneel)

  1. Om silaniseren het glas, pipet 300 ul van 2% 3-aminopropyltrimethoxysilaan oplossing op het glazen gedeelte van elk p35 schotel met een 10 mm opening. Zie figuur 1 voor de silanisatie en cross-linking schema. 3-aminopropyltrimethoxysilaan wordt verdund in gefilterd water.
  2. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  3. Aspireren van de 3-aminopropyltrimethoxysilaan oplossing en wassen met gefilterd water drie keer voor 10 minuten elk.
  4. Aspireren uit het water en zet gerechten op hete plaat ingesteld op 50 ° C gedurende 1,5 uur. Plaats toppen van de gerechten een beetje uit de schotel, zodat vocht in de schotel kan ontsnappen.
  5. Verwijder de gerechten van het vuur en laat cool.
  6. Pipetteer 300 ul van 2% glutaaraldehyde-oplossing op de glazen gedeelte van elk gerecht. De glutaraldehyde wordt verdund in PBS.
  7. Incubeer gedurende 1 uur.
  8. Aspireren de glutaaraldehyde oplossing en afwassen met PBS drie keer voor 10 minuten elk.
  9. Steriliseren gerechten door blootstelling aan UV-licht gedurende 1 uur. De gesilaniseerd gerechten worden bewaard bij kamertemperatuur.

3. De voorbereiding van 3D collageen gel met tracer deeltjes

  1. Was fluorescerende tracer deeltjes door te stoppen met draaien 100 ul op voorraad tracer deeltjes (10 10 deeltjes / ml) in een centrifuge bij 15.000 rpm gedurende 5 minuten, aspiratie uit vloeibaar, en voeg 500 ul van de media. Herhaal dit vijf keer. Na de laatste wasbeurt, opnieuw in suspensie deeltjes in 30 pi van media.
  2. Trypsinize GFP tot expressie brengen zoals gewoonlijk.
  3. Resuspendeer celpellet tot ongeveer 2 x 10 6 cellen / ml.
  4. Pipetteer 240 ul van de groei media in een eppendorfbuisje.
  5. Voeg 12,6 ul van 1 M Hepes, 20 ul van gefilterd water, 50 ul van cel-oplossing, dan is 10 ul van fluorescerende deeltjes.
  6. Voeg ten slotte 167 pl van runderen dermis Collageen I-oplossing (een werkend concentratie van 1 mg / ml te verkrijgen).
  7. Grondig te mengen oplossing, dan pipet 80 ul van de oplossing op het glazen gedeelte van de gesilaniseerd glazen bodem schaal.
  8. Plaats schotel in de couveuse en laat de gel polymeriseren bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Zie figuur 1A voor typische collageen gel in een p35 glazen bodem schaal.
  9. Zorgvuldig Voeg 2 ml van de groei media bij elk gerecht.

4. Procedure voor time-lapse beeldacquisitie

  1. Zet de temperatuur van de microscoop behuizing en laat de mogelijkheden kamer evenwicht tot een steady-state temperatuur tot 37 ° C. Zie figuur 2 voor een voorbeeld van live-cell imaging systeem.
  2. Verander media naar de nieuwe media aangevuld met 25 mM Hepes tot een neutrale pH-waarde te behouden. VoorDIC imaging, wisselen de bovenkant van de schotel met een dat een glazen blad heeft. Met behulp van een dunne strook van parafilm, bedek de zijkant van de schotel naar media verdamping te voorkomen.
  3. Voor een olie-immersie objectief, plaats een druppel immersie vloeistof op de doelstelling.
  4. Zet de collageen-gel met schotel op microscoop het podium, en zorg ervoor dat de schotel contact maakt met de onderdompeling vloeistof.
  5. Focus van het monster en zoeken naar cellen van belang om de afbeelding. Te minimaliseren stadium drift, laat schotel om voor ongeveer 45 minuten rusten vóór het begin van een lang vast te leggen.
  6. Specificeer de parameters van het beeld acquisitie. Een minimum te beperken laserbelichting, waardoor schade aan de cellen, door het moduleren van het laservermogen, belichtingstijd, frequentie en duur van de tijd vast te leggen. De werkelijke parameters zal variëren met de microscoop systeem en celtype.
  7. Tijdens de time-lapse acquisitie, een remmer worden toegevoegd. Voor de inhibitor toevoeging experiment, niet afdichting de schotel met parafilm.
    1. Prepzijn Hepes media met drugs aangevuld met een gewenste werkende concentratie.
    2. Als u klaar bent om drugsgebruik toe te voegen aan media, pauzeren het beeld vast te leggen, en zorgvuldig de schotel boven te verwijderen zonder de schotel.
    3. Aspireren van de media in de schotel, en het pipet het geneesmiddel bevattende media in de schaal. Vervolgens vervang voorzichtig de schotel top.
    4. Het monster kan out-of-focus als gevolg van de toevoeging van nieuwe media, stel de focus.
    5. Start de capture, dan is toezicht op de vast te leggen voor de volgende 30 minuten, en stel de focus indien nodig. Zie afbeelding 4 voor een voorbeeld van drugsverslaving experiment.

5. FRAP procedure en analyse

  1. De FRAP setup varieert tussen systemen, volg dan de fabrikant instructies.
  2. Parameters instellen voor live-cell imaging.
  3. Parameters instellen voor fotobleken. Gebruik voldoende laservermogen de fluorescerende signaal photobleach zonder beschadiging van de cel. Test deze parameters op de praktijk cellen.
  4. Start beeld vast te leggen, en laat minstens 5 frames van het beeld vast te leggen voordat fotobleken de regio van belang.
  5. Verder vast te leggen, en herstel de tijd moet voldoende zijn om de volledige fluorescentie herstel vast te leggen. Zie figuur 5 voor een voorbeeld van FRAP experiment.
  6. Analyseer de fluorescentie herstel door het meten van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de photobleached gebied (voor en na fotobleken) in de tijd. Met behulp van een statistische analyse software (bijv. Excel), past het herstel curve om de exponentiële vergelijking: I = I f (1-e-kt), waar ik is de intensiteit, I f is de uiteindelijke intensiteit, t is tijd, en τ ½ is de tijd die nodig is om de intensiteit te bereiken de helft van de uiteindelijke waarde: τ ½ = ln (2) / k. De half-time is een maat voor de snelheid van de mobiliteit van het eiwit.
  7. Het verkrijgen van de parameters, half-time en de uiteindelijke intensiteit van de exponentiële curve-fit. Bereken ee mobiele fractie door het nemen van de verhouding van de finale om de eerste fluorescentie-intensiteiten.

6. Representatieve resultaten

Een voorbeeld van de live-cell imaging van gezonde epitheelcellen binnen de matrix is ​​weergegeven in figuur 3. Gezonde cellen vertonen een soepele, ononderbroken membraan, en duidelijke kern, terwijl de ongezonde cellen hebben vaak een verstoord membraan, en een te groot aantal vacuolen. In een 3D-matrix, een epitheliale cellen migreren 1, en ​​in de loop van enkele dagen, epitheelcellen vormen drie-dimensionale, bolvormige, multi-cellulaire cysten in de matrix 2. De cellen zijn ook zeer dynamisch, en migreren binnen de cyste (figuur 3). De matrix vervorming als gevolg van de trekkrachten uitgeoefend door migrerende cellen wordt geanalyseerd door de verplaatsing van de tracer deeltjes ingebed in de omringende matrix (figuur 4). De tracer deeltje bewegingen worden weergegeven als een maximale projectie beeld van de verschillenlende tijdstippen, en elk tijdstip is pseudo-gekleurd om aan te geven van de tijd (Figuur 4B). Als alternatief worden de beelden van een individuele tracer deeltje weergegeven als een montage van de beweging van de tracer deeltje in de tijd (figuur 4C) te tonen. Alle beeldanalyse werd gedaan met behulp van ImageJ. Deze kwalitatieve beoordeling van de matrix vervorming, en dus de krachten uitgeoefend door migrerende cellen, zijn nuttige eerste aanpassing van de trekkracht distributie. De kwantitatieve schatting van de trekkrachten uitgeoefend door migrerende cellen in 3D valt buiten het bestek van dit protocol en wordt elders 3,4 beschreven.

Een typische fluorescentie herstel na fotobleken experiment is weergegeven in figuur 5. De regio van de rente moet worden photobleached met behulp van laser geoptimaliseerde instellingen, zodat de fluorescentie-intensiteit zichtbaar is verminderd ten opzichte van achtergrondniveaus (om signaal-ruisverhouding te maximaliseren), met behoud van gezonde cellen en onbeschadigd. De optimale instelling moet be empirisch bepaald als elke FRAP setup is anders (bijvoorbeeld FRAP met behulp van laser-scanning confocale systeem).

De belichting en de time-interval van de post-FRAP beeldacquisitie moeten zorgvuldig worden gecontroleerd op de achtergrond fotobleken te voorkomen. Het gebruik van lagere laservermogen, korte belichtingstijd, en het gebruik van gevoelige camera en een hoge efficiënte optieken zijn essentieel voor een hoge kwaliteit FRAP beeldvorming. Als de fluorescentie bleken tijdens de afbeelding overname groot is, moet deze achtergrond vervagen worden gekwantificeerd en genormaliseerd uit de waargenomen fluorescentie-intensiteit herstel. Vanwege de aard van de 3D-omgeving, kan de z-component van de fluorescentie-intensiteit het herstel significant worden. Daarom is het belangrijk om een ​​photobleached volume te definiëren door het nemen van pre-en post 3D-stapel beelden van photobleached regio. Verdere analyse en modellering van fluorescentie herstel wordt elders 5,6 besproken.

De unieke combinatie van live-cell imaging techniques: GFP aan de dynamiek van cytoskeleteiwitten, rode fluorescentie tracer deeltjes volgen om de matrix vervorming, en de toevoeging van remmers monitor, tegelijkertijd kan worden gebruikt voor de analyse van eiwit dynamiek, trekkracht en moleculaire pathways.

Figuur 1
Figuur 1. Voorbereiding van de collageen-gel. A) gepolymeriseerd collageen matrix op een glazen bodem schaal. De roze kleur van de gel is te wijten aan embedded fluorescerende deeltjes. B) Procedure om de glazen bodem gerechten te trakteren op het collageen gel verknopen met het glasoppervlak. Eerst wordt de glazen bodem schaal behandeld worden met 3-aminopropyltrimethoxysilaan oplossing, dan glutaaraldehyde oplossing die de collageen matrix verknopingen op het glas.

Figuur 2
Figuur 2. Schema's van de confocale / FRAP microscoop setup. De confocalemicroscoop is gebaseerd op een Zeiss AxioObserver met een CoolSNAP HQ II CCD-camera en volledig geautomatiseerd door Slidebook software (Intelligent Imaging Innovations). De confocale unit is op maat ontworpen en op basis van Yokogawa draaiende schijf unit CSU10 en twee solid-state lasers (488 nm met 50 mW en 561 nm met 40 mW) met acousto-optische Tunable Filter (AOTF) om milliseconden schakelen tussen twee lasers mogelijk te maken. De emissie filters zijn 525/50 nm en 620 / 60 nm (# 118661 en # 118085, Chroma Technology) en dichroïde spiegel is 488-568 BrightLine Dual band (Semrock). De doelstellingen zijn een lange werkafstand 40x C-Apochromat objectief met NA 1.1 en werkafstand van 0,62 mm, en een 63x Plan-Apochromat objectief met NA 1.4 en een werkafstand van 0,19 mm. De microscoop bevat ook een FRAP photoablation systeem dat bestaat uit een vezel optisch gepompte kleurstof laser, een computergestuurde straal positie en intensiteit, en een diffractie beperkte spotgrootte. Verder is de microscoop uitgerust met eeneen XY-gemotoriseerde stadium dat 0,1 micron lineaire encoders op elke as omvat. Tijdens de time-lapse imaging, is de omgevingstemperatuur onderhouden door een op maat ontworpen microscoop kamer en een verwarming met een terugkoppeling temperatuurregeling. Te isoleren geen lawaai en trillingen, het hele microscoop systeem is op een trillingsvrij tafel.

Figuur 3
Figuur 3. Live cell imaging van epitheliale cellen die GFP-actine. Deze cellen vormen een cyste na 4 dagen van de cultuur in een 3D-collageen matrix. Sommige cellen bewegen langs het oppervlak van de cyste (gele pijlpunt), terwijl anderen migreren in het interieur van de cyste (rode pijlpunt). Schaalbalk 10 micrometer, de tijd in uren.

Figuur 4
Figuur 4. Het effect van Rho-kinase remming op trekkracht. A) DIC beeld van een migrerende cel te drukken MDCK GFP getagd nucleaire marker. Het beeld werd direct voor de behandeling van Rho-kinase remmer Y-27632. Schaalbalk 10 urn. B) Particle verplaatsing als gevolg van de toevoeging van Y-27632. Het deeltje posities op verschillende tijdstippen (0 - 52 min.) waren pseudo-gekleurd volgens de intensiteit schaal, vervolgens geprojecteerd op een enkel beeld. De witte regio is de GFP-positieve kern in de migrerende cellen. Schaalbalk 10 urn. De tijd in minuten. C) Het deeltje beweging aan de achterrand van de cel (zie pijl in B). Asterisk duidt op de laatste frame gevangen voor de Y-27632 toevoeging. De tracer deeltje verplaatst naar en uit de buurt van de achterrand van de migrerende cellen voor en na de toevoeging van Y-27.632, respectievelijk. Schaalbalk 1 micrometer.

Figuur 5
Figuur 5. FRAP analyse van de GFP-actine-expressie cel migreren in een drie-dimensionale matrix. A) Time-lapse beelden van de GFP-actine uitdrukken cel van voor en na de fotobleken. Een klein deel van de GFP-actine opgebouwd op de mobiele achterzijde was photobleached (rode pijl) op tijdpunt 0. Tijd in seconden, schaalbalk 5 micrometer. B) De gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de photobleached regio (vaste lijn), en de exponentiële fit van de fluorescentie herstel (cirkels) uitgezet in de tijd. De fluorescentie-intensiteit werd genormaliseerd tot de initiële waarde vóór fotobleken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hier beschrijven we een methode voor het gebruik van live-cell imaging om de mechanismen van de cel migratie onderzoek in een drie-dimensionale matrix. Het succes van deze techniek is afhankelijk van het verkrijgen van "goede" klonen stabiel uiten van GFP-gelabelde eiwitten. Het lage niveau van GFP eiwitten vergt een teveel excitatie blootstelling die cel gezondheid van compromissen, terwijl een te hoge GFP niveau hebben ongewenste neveneffecten op de cel. Zo is de vector keuze om genen in cellen te transfecteren is belangrijk (bv. de promotor, fluorescentie tag, enz.). Er zijn veel fluorescerende labels anders dan GFP, met inbegrip van rode fluorescerende eiwit (RFP) 7,8. Deze eiwitten labels vereisen specifieke excitatie golflengte licht, en dus verschillende sets van de fluorescentie filters. Bovendien hebben verschillende antibiotica-resistente genen (bijvoorbeeld, G418, hygromycine, puromycine etc) zijn ook beschikbaar en kunnen worden gebruikt om stabiele klonen te genereren.

Voor de live-cell imaging, transient getransfecteerde cellen ceen ook worden gebruikt. Hoewel dit minimaliseert de tijd en de inspanning die nodig is om een ​​stabiele cellijn te ontwikkelen, transient getransfecteerde cellen zijn over het algemeen ongezond, en dus minder betrouwbaar voor gebruik in proeven. Daarnaast is de populatie van transient getransfecteerde cellen is een heterogeen mengsel van uiten en niet-expressie brengende cellen, en het uiten van cellen zullen fluorescent eiwit expressie te verliezen na verloop van tijd. Ter vergelijking, zijn stabiel tot expressie brengen meestal gekloond uit een kolonie van cellen en eiwitexpressie moeten stabiel en homogeen, hoewel de expressie niveau lager zal zijn dan in kortstondig tot expressie brengen. Sinds de kolonie van stabiele cellen is waarschijnlijk ontstaan ​​uit een enkele cel, is het belangrijk om kolonies die morfologie en gedrag lijkt op een normale, ongetransfecteerde cellen hebben, om te fenotypes die specifiek zijn alleen voor die klonen (vermijd halen, tenzij de getransfecteerde plasmide is ontworpen om celmorfologie verstoren). Meerdere kolonies moet worden gebruikt voor exexperimenten om fenotypes als gevolg van klonale variatie te voorkomen. Als alternatief kan virale transfectie of elektroporatie worden gebruikt om de genen van belang te introduceren. Deze virale transfectie is vooral handig voor moeilijk te transfecteren cellen of primaire cellen (zie de gedetailleerde protocollen van andere transfectie technieken zoals beschreven elders in dit tijdschrift).

Het lastigste onderdeel van deze procedure is subkloneren. Stabiele klonen kan worden opgehaald met behulp van het wattenstaafje hier beschreven methode, of als alternatief, met behulp van een ring het klonen. Een andere methode voor het selecteren van GFP-positieve cellen met behulp van FACS. FACS selecteert cellen uitsluitend gebaseerd op de omvang van de fluorescentie-intensiteit. Ter vergelijking, met behulp van het klonen hier beschreven methode, kan de gebruiker visueel te identificeren, niet alleen het niveau van de GFP-expressie en maar ook de cellulaire lokalisatie met behulp van een microscoop. Ook het klonen met behulp van FACS resulteert meestal in een meer heterogene populatie van cellen. Om dit probleem, FACS-gesorteerde cellen kunnen wordenvergulde direct in 96 goed gerechten, zodat elk goed slechts een cel bevat. Kolonies afkomstig zijn uit enkele cellen moet een homogene bevolking.

De methode die wordt gebruikt om de collageen matrix hechten aan de glazen bodem schaal (Figuur 1) is van cruciaal belang voor de live-cell imaging en het kweken van cellen in een gel voor een langere periode van tijd. De eerste stap voor het bevestigen van de matrix op het glas is de vorming van een silaan monolaag. Niet-silaan te storten op een monolaag zal vaak resulteren in collageen matrix onthechting van het glas. Dit komt omdat de cellen ingebed in de matrix uit te oefenen contractiele trekkrachten, en de oorzaak van de matrix te krimpen, waardoor de kans op matrix onthechting van de schotel. Daarom silaan / glutaaraldehyde de behandeling van de schotel is van cruciaal belang voor het behoud van gel bevestiging aan het gerecht. Merk op dat collageen montage omstandigheden (concentratie, tijd en pH) moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor verschillende collageen type en batch. InDaarnaast kan het protocol worden gebruikt met verschillende types van collageen of andere 3D-gels, zoals Matrigel of fibroblast afgeleid matrix 9.

Hoewel veel cellen niet nadelige effecten vertonen als reactie op HEPES buffer, sommige cellen zijn kieskeurig. Te onderhouden gezondheid van de cellen tijdens de time-lapse overname, kan een CO 2 incubator worden toegevoegd om de pH binnen de microscoop behuizing te controleren. Daarnaast moet laser blootstelling aan de cellen worden geminimaliseerd. Als de fluorescentie uitgezonden door de cellen te zwak is, de fluorescentie beter kan worden verzameld met behulp van een meer gevoelige camera, of een beter objectief, of een meer efficiënte filter instellen, moet etc. celmorfologie binnen de microscoop behuizing worden vergeleken met de morfologie van in de CO 2 incubator om ervoor te zorgen dat cellen gezond zijn en gedragen normaal. Omdat deze methode beschrijft enkele cel gebaseerde testen, is een cel-cel variant verwacht. Daarom herhaalde experimenten en gegevens quantification is essentieel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Wij danken dr. Grant Sumida voor de kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een Beckman Young Investigator Award (SY), een Hellman Family New Faculty Award (SY), een NIH EUREKA, de University of California Cancer Research Coordinating Committee.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen, bovine, Type I BD Biosciences 354231 Stock is about 3 mg/ml
3-aminopropyltrimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778 Dilute in water
glutaraldehyde Sigma-Aldrich 340855 Dilute in PBS
1M Hepes Invitrogen 15630-080
Fluospheres polystyrene microspheres 1 μm, red fluorescence (580/605) Invitrogen F13083
Geneticin (G418) Invitrogen 11811-031
DMEM Invitrogen 31600-034
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S115500
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
Kanamycin Invitrogen 15160-054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shih, W., Yamada, S., Myosin, A dependent retrograde flow drives 3D cell migration. Biophys. J. 98, (8), L29-L31 (2010).
  2. O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures. Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).
  3. Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat. Methods. 7, (12), 969-971 (2010).
  4. Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, (33), 13343-13348 (2007).
  5. Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, (6), 444-456 (2001).
  6. Phair, R. D., Misteli, T. Kinetic modeling approaches to in vivo imaging. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, (12), 898-907 (2001).
  7. Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. Fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, (5771), 217-224 (2006).
  8. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).
  9. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, (5547), 1708-1712 (2001).
Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shih, W., Yamada, S. Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix. J. Vis. Exp. (58), e3589, doi:10.3791/3589 (2011).More

Shih, W., Yamada, S. Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix. J. Vis. Exp. (58), e3589, doi:10.3791/3589 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter