Summary
我们演示了如何解剖和文化小鸡E4 statoacoustic节和E6脊髓植。外植体无血清条件下24小时的三维胶原凝胶培养。突起的响应测试与生长因子补充介质与蛋白包被的磁珠。
Abstract
鸡内耳感觉器官外围过程statoacoustic节（SAG）的神经元支配。感觉器官支配取决于轴突的指导线索和生存因素位于沿轨迹的轴突生长和/或在其感觉器官目标2的组合。例如，一个典型的轴突导向信号通路，semaphorin neuropilin，功能产生的干扰misrouting 3奥迪轴突。此外，多种生长因子在内耳的感官指标，包括神经营养因子3（NT - 3）和脑源性神经营养因子（BDNF），表示已在转基因动物的操纵，再次领先misrouting凹陷轴突 4 。同样是这些分子促进体外 5,6和突起生长的小鸡凹陷神经元的生存。
在这里，我们描述和证明在体外的方法，我们目前正在ü唱鸡凹陷突起的可溶性蛋白，其中包括知名morphogens如Wnts，以及促进SAG突起生长和神经元的存活重要的生长因子的响应测试。利用该模型系统，我们希望得出结论分泌的配体可以发挥SAG神经元的存活和突起生长的影响。
凹陷外植体解剖胚胎第4天（E4），并在三维胶原凝胶中培养24小时无血清条件下。首先，突起的响应测试与蛋白培养基中培养的外植体。然后，询问是否分泌配体的点源可以对突起生长的方向影响，外植体共同培养蛋白包被的磁珠和珠本地促进或抑制生长的能力检测。我们还包括一个解剖示范（修改后的协议7）E6脊髓植文化。我们经常使用脊髓植确认生物活性的蛋白质和蛋白质浸泡珠，来验证物种小鸡组织凹陷植相同的培养条件下，交叉反应。这些方便快速筛选分子施加营养（生存）或热带（定向）凹陷神经元的影响，特别是在执行体内研究，在体外实验。此外，这种方法允许单个分子的无血清条件下的测试，具有较高的神经元的存活8。
Protocol
食谱
小鸡林格
| 7.2摹 | 氯化钠 |
| 0.23摹 | 氯化钙2 + 2H 2 O |
| 0.37摹 | 氯化钾 |
| 0.115摹 | NA 2 HPO 4 |
| 900毫升 | 水（组织文化品位） |
注：调整pH值至7.4。使终体积为1000毫升水。
10X PBS
| 40克 | 氯化钠 |
| 1克 | 氯化钾 |
| 7克 | NA 2 HPO 4 |
| 1.2摹 | KH 2 PO 4 |
| 450毫升 | DEPC水 |
注：调整pH值至7.4。带来最终体积500毫升水。工作浓度（1X）是由9部分，如用微孔紫外线照射系统生成水18MΩ- cm电导率获得的组织培养级水，稀释1部分10X股票。
凹陷外植体举行的中期
- L -谷氨酰胺的DMEM/F12，10毫米的HEPES
- 10％的胰岛素，转移，硒（及其1）
- 1％钢笔链球菌
植文化介质
- 凹陷外植体举行的中期
- 10 ng / ml的神经营养因子3（NT - 3）
- 10毫微克/毫升睫状神经营养因子（CNTF）
脊髓的解剖和控股中等
- L - 15
- 10％胎牛血清
- 1％钢笔链球菌
孵育的鸡蛋，在37-38 ° C。 70％乙醇消毒解剖工具和Sylgard解剖盘。解剖菜和工具，也可以在一夜之间紫外线消毒。
- 与1毫升无菌PBS，混合，并等待珠定居管底部微管珠。
- 珠洗净，取出上清液后珠相继落户，并在PBS悬浮几次。
- 孵育珠纯化蛋白（PBS稀释）或PBS单独（管制）在室温下1小时。
- 在24孔板用1ml PBS冲洗，PBS和存储珠，直到胶原蛋白。
2。 Statoacoustic神经节清扫
- 在E4中删除，从卵胚胎，并将其放置在一碟鸡林格氏液删除胚胎膜。
- 将胚胎在Sylgard ©内衬培养皿菜充满了冷的HBSS和位置的胚胎，它与奥迪面临的囊泡的一面。使用解剖引脚引脚胚胎的菜。
- 使用两个解剖引脚，立即通过皮肤水平切腹侧运河袋，约符合蜗管。垂直切割前部和后部凹陷。使用镊子或解剖针，解除和删除三个削减接壤的皮肤瓣。
注：凹陷的otocyst anteroventral边背袋，这是很容易与明基地照明可见，腹蜗管项目ventromedially和咽弓遮挡之间的中途，位于。耳蜗管拉长，所以它的背腹层面将逐步增加E4汉堡 - 汉密尔顿阶段23日至25日9之间。
- 在一个单独从凹陷的后方向拉otocyst。置换周围组织清扫引脚凹陷，小心取出的胚胎，使用＃55钳凹陷。删除从凹陷的间叶组织和神经束凸出大块。
- 使用宽口吸管尖，外植体转移到24孔板0.5毫升凹陷持有介质的外植体。植在冰上或在室温下保持长达4小时。
3。脊髓夹层
- E6的胚胎从鸡蛋中取出，并放置在含有鸡林格氏液的解决方案的菜。删除头部和胚胎膜。
- 将在Sylgard ©解剖菜含有冷脊髓夹层介质的身体。位置和针胚胎“腹侧向下”和尾鳍面临实验者。将通过每个肢体和解剖引脚通过前结束。
- 使用镊子和/或解剖引脚，小心地取出皮肤和组织，在腹侧方向移动，直到脊髓背表面可见。
- 切割用解剖针脊髓背中线，在后前方向，沿整个长度的脊髓。这创建了一个脊髓单独的左，右两侧的“开卷”。
- 从身体中取出，用镊子尾鳍最末端的脊髓和解除实验者和远离脊髓。删除剩余的背根神经节和脑膜。
- 按住钳（或针菜）脊髓的一端，并用Vannas剪刀切沿腹正中线，平分脊髓。
- 按住钳固定的组织，并用Vannas剪刀切沿小外植体组织的长度（长度为100-500微米）的外植体的一端。底板可以被视为一个明确沿着一个外植体边缘增厚组织。
- 使用宽口吸管尖0.5毫升冷夹层介质转移到24孔板植。保持在冰上植，以保持组织活力，F长达4小时。
4。外植体与纯化蛋白质的文化测试突起响应
- 准备在一个15毫升的锥形管的1.5毫克/毫升的胶原溶液，在冰上，根据制造商的指示。
- 验证胶原溶液的pH值7-7.4使用pH试纸。加入1μL体积的NaOH调整pH值。
- 植转移到24孔板中，用一个宽口吸管尖和吸出多余的液体。多植，可培养一个孔，但应放在彼此相距至少500微米。
- 加入0.5毫升的胶原蛋白的以及含有外植体。井底表面上的外植体的位置。请务必设置与未来以及出发前，每一种文化，完全是因为胶原蛋白会开始在室温下聚合。
- 将培养板在37 ° C幻灯片30-45分钟的温暖聚合胶原蛋白。当胶原蛋白已polymerized将类似于凝胶。
- 加入0.5毫升的温暖外植体培养基中，无论是纯化的蛋白质（PBS稀释）或PBS（管制）补充，并在37 ° C，5％的CO 2。突起生长的影响应该是24小时可见。
注：我们使用相同的协议，以文化凹陷植，达42小时。
5。外植体与蛋白包被的磁珠共培养测试定向突起生长
- 开始与植文化的步骤4.1 - 4.4。
- 使用吸管，转让1-5珠从PBS以及含胶原蛋白溶液和外植体。
- 使用镊子，从外植体的边缘位置珠50-500微米。
- 放在37 ° C幻灯片30-45分钟的温暖聚合胶原蛋白的板块。组织或珠可能成为流离失所的胶原蛋白的聚合。在第5分钟，检查文化和重新定位，组织和珠。
- 添加0.5米升凹陷每口井的媒体和孵育24小时。
6。通过免疫组化突起生长的可视化
- 在PBS冲洗的文化，并在4％多聚甲醛的PBS在室温下1小时修复。
- 从井的墙壁跟踪周围的凝胶边缘圆润的聚四氟乙烯微型抹刀结束发行的凝胶。执行井凝胶的免疫染色。在PBS冲洗数次。
- 培育基地0.5毫升封闭液（10％小牛血清，0.1％的Triton X - 100的，0.1％的PBS叠氮化钠）4℃过夜° C。
- 在0.5毫升的主要抗体（抗β-微管蛋白抗体稀释于封闭液1:500）孵育4℃过夜° C。
- 在PBS冲洗数次。在0.5毫升的二抗（1:500稀释的Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG 2B抗体）孵育4℃过夜° C。从这一步，保持在黑暗或铝箔包装板，由于对光线的敏感度二抗。
- 在4 ° C的PBS长达一周冲洗多次在PBS和存储。
7。代表性的成果
图1。代表纯化的NT - 3和E4鸡凹陷植NT - 3涂层珠突起促进作用结果 。 凹陷的神经元细胞体和免疫染色与β-微管蛋白和共聚焦显微镜10倍的目标与成像突起。 体外培养 24小时后，凹陷植显示在100毫微克/毫升纯化的人NT - 3添加到细胞培养液（1B）存在较大的突起生长，控制（1A） 。凹陷神经元共培养浸泡in100 ng / ml的NT - 3的证明，NT - 3的点源，可以在本地促进轴突生长的珠子。植显示时间和致密突起生长的一面植面临珠相比，对面（1D）和珠浸泡在PBS（1C）与对照组比较文化。比例尺= 200微米。
图2。代表E6的小鸡脊髓纯化Wnt5a和Wnt5a涂珠的突起促进影响结果。 脊髓外植体与β-微管蛋白的免疫染色和共聚焦显微镜成像。经过24小时的纯化鼠标Wnt5a（400ng/ml），从鸡胚脊髓外植体的轴突生长的增长增加（2B）相比没有Wnt5a（2A）培养的控制。珠，浸泡在500毫微克/毫升Wnt5a放置在离边缘的脊髓植300-500微米，也促进突起生长（2D）与对照组比较文化（2C）。类似的合作培养结果察看Wnt5a的表达细胞8。比例尺= 200微米。
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Discussion
我们提出了一个方法来剖析和文化的E4凹陷和E6脊髓植，从小鸡无血清条件下，。目前，这个过程是在我们的实验室研究SAG神经元的存活和突起生长分泌各种配体的影响。本议定书的小说方面，包括使用的无血清培养的外植体浸泡在生长因子的研究凹陷突起生长的影响的珠。珠的方法类似我们已经描述鸡胚脊髓 10 。传统上，珠已被用于研究与经典的轴突导向因子和morphogens。在这里，我们已经表明，珠检测也可以用来研究突起生长的神经营养因子（图1）（或其他生长因子）的影响。
有过程中的关键步骤，可能需要进行修改，或针对不同的应用进行了优化。这些步骤也troub的重要变量乐拍摄的实验，似乎是不成功的。首先，神经营养因子3（NT - 3），睫状神经营养因子（CNTF）和ITS（胰岛素，转铁蛋白，硒）被添加到培养液中，以促进凹陷的神经元的存活和加强轴突生长 6,8 。这些生长因子包括在脊髓的实验，以测试在相同的实验条件进行了测试，SAG植的生物活性分子。然而，其他生长因子，可这些和其他组织类型比较合适。其次，1.5 mg / ml的胶原蛋白的浓度被选为测试后的胶原蛋白的浓度范围（0.5，1.0，1.5和2毫克/毫升），因为它产生后24小时从E4鸡凹陷最强大的突起生长。其他来源的神经元可能会显示不同的最佳的胶原蛋白。最后，蛋白浓度，珠，植和珠子之间的距离也应为每个应用程序进行优化。一些增长的事实morphogens如口服补液盐，在梯度表示，在开发过程中11对轴突生长的浓度依赖效应。因此，应始终被测试的浓度范围内与突起生长实验。应小心，以避免毒性：我们观察到一些蛋白质高浓度的水平升高的细胞死亡（如，刺猬）。
这种方法可以适用于其他应用程序，包括其他年龄，组织类型，共培养的方法，和额外的免疫（如，细胞存活分析）。我们已经成功培养E3 - E5的凹陷，E6的视网膜和E7嗅球植，从鸡，使用相同的培养条件。当生长健壮的对照样品，这种方法还可以揭示令人厌恶的反应，分泌的因素。类似的方法，用于测试的morphogens 12,13哺乳动物神经元的影响，我们目前正在调查中BMPs的，FGFs和SH的影响H凹陷突起生长。此外，由于胶原凝胶聚合在24孔板，他们是够大，随后一个恒温器嵌入和切片。我们经常对胶原凝胶的文化，这使我们能够关联突起生长量从同一样品8的细胞存活水平冰冻切片的TUNEL法检测。
使用胶原凝胶分析中，我们介绍了他们在这里的方式有局限性。例如，观察在体外环境中刻意简化的反应可能不会反映相同的因素时，在体内的情况更加复杂。同时，我们不能区分外设从中央工艺并不能区分听觉前庭突起。因此，在这些人群中异质性的响应，可能会产生不规则或不统一的产物，或者，如果应对人口是一小部分总神经节可取得没有效果。最后，我们提出了一个显著的神经元存活的无血清条件下，可用于文化E4凹陷植方法的应用，从各种研究细胞的存活轴突导向。总体而言，这个系统是有利的，因为它允许一个监测由于没有其他分泌的因素和轴突的指导线索，可在体内环境中存在的混杂变量因素单独或组合的纯化此外的影响。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由国家卫生部批准RO1DC002756和普渡大学研究基金会。我们感谢与实验的意见和罗德尼帮助数字McPhail多丽丝吴和维泽张。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection microscope | We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination | ||
| Slide warmer | C.S. E. | Collagen polymerization | |
| Chicken egg incubator | |||
| 37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator | |||
| Sylgard© coated petri dish | |||
| 24-well cell culture plate | Corning | 3526 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Stainless steel dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Embryo pinning, fine dissection |
| Moria perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Embryo harvest/transfer |
| 200 μl wide mouth pipet tips | Dot Scientific, Inc. | 118-96R | Explant transfer |
| E4 and E6 chicken eggs | |||
| Chick Ringer’s solution | Embryo harvest | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | H8264 | SAG dissection |
| L15 medium | Sigma-Aldrich | L5520 | Spinal cord dissection medium |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11150 | Spinal cord dissection medium |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments, Inc. | 501778 | Spinal cord dissection |
| Rat-tail collagen Type I | BD Biosciences | 354249 | Explant culture |
| 10X PBS (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| 1N NaOH (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| Distilled water (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| pH indicator papers (6.0-8.1) | Whatman, GE Healthcare | 2629-990 | To check collagen pH |
| 15 ml conical tubes | Dot Scientific, Inc. | 818-PG | |
| 500 μl wide mouth pipet tips | Dot Scientific, Inc. | 119-R100 | To pipet collagen |
| DMEM/F12 medium | Sigma-Aldrich | D8437 | Explant culture medium |
| ITS+1 | Sigma-Aldrich | I2521 | Medium supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Medium supplement |
| CNTF (rat) | Sigma-Aldrich | C3835 | Medium supplement |
| NT-3 (human) | Sigma-Aldrich | N1905 | Medium supplement |
| Purified mouse Wnt5a | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Affi-gel Blue gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation |
| PBS | Rinses | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Blocking solution |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Blocking solution |
| Calf serum | Invitrogen | 16170-078 | Blocking solution |
| Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody | Sigma-Aldrich | T8535 | Labels cell bodies and neurites |
| Alexa fluor 488 goat anti -–mouse IgG2b antibody | Invitrogen | A21141 | Detects β Tubulin antibody |
| Teflon micro spatula | VWR international | 57949-033 | Release collagen gels from well |
References
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