Dissection והתרבות של גנגליון צ'יק Statoacoustic Explants ואת חוט השדרה ג'ל קולגן עבור מבחני תוצאה Neurite

Summary

אנו מדגימים כיצד לנתח ותרבות חומוס הגנגליון E4 statoacoustic ו E6 explants חוט השדרה. Explants הם תרבותי תחת בסרום ללא תנאים ג'ל קולגן 3D עבור 24 שעות. ההיענות Neurite נבדק עם המדיום גורם הגדילה, שיושלם עם חלבון מצופים חרוזים.

Abstract

איברי חושים של האוזן הפנימית עוף מעוצבבים על ידי תהליכים של הפריפריה הגנגליון (SAG) נוירונים statoacoustic. עצבוב איבר חושי תלוי בשילוב רמזים של האקסון הדרכה ¹ וגורמים הישרדות ² הממוקמים לאורך מסלול של האקסונים לגדול ו / או מטרות בתוך החושית שלהם איברים. לדוגמה, הפרעה תפקודית עם מסלול הדרכה קלאסי האקסון איתות, semaphorin-neuropilin, שנוצר misrouting של אקסונים otic ^3. כמו כן, גורמי גדילה אחדים לידי ביטוי את יעדי חושית של האוזן הפנימית, לרבות Neurotrophin-3 (NT-3) ו neurotrophic נגזר המוח פקטור (BDNF), הופעלו חיות טרנסגניות, שוב מובילה misrouting של אקסונים SAG ^4. אלו מולקולות לקדם אותו בשתי הישרדות neurite תולדה של נוירונים SAG חומוס במבחנה ^5,6.

כאן, אנו לתאר ולהדגים את שיטת במבחנה אנחנו כרגע uלשיר על מנת לבחון את ההיענות של neurites חומוס SAG חלבונים מסיסים, כולל morphogens ידוע כגון Wnts, כמו גם גורמי גדילה חשובים לקידום neurite SAG תולדה והישרדות נוירון. באמצעות מערכת זו המודל, אנו מקווים להסיק מסקנות לגבי ההשפעות כי ligands המופרש יכול להפעיל על ההישרדות SAG נוירון ו תולדה neurite.

Explants SAG הם גזור ביום עובריים 4 (E4) תרבותי תלת ממדי ג'ל סרום קולגן תחת ללא תנאי למשך 24 שעות. ראשית, ההיענות neurite הוא נבדק על ידי explants culturing עם בינוני בתוספת חלבון. לאחר מכן, כדי לשאול אם מקורות נקודת ligands מופרש יכולה להיות השפעה על כיווני תולדה neurite, explants הם שיתוף תרבותי עם חלבון מצופים חרוזים assayed על היכולת של חרוז כדי לקדם או לעכב מקומית תוצאה. אנו כוללים גם הפגנה של דיסקציה (שינה פרוטוקול ⁷⁾ והתרבות של E6 explants חוט השדרה. אנומשתמשים באופן שגרתי explants חוט השדרה על מנת לאשר bioactivity של חלבונים חלבון ספוג חרוזים, ולוודא מינים תגובתיות צולבת עם רקמה חומוס, בתנאים תרבות כמו explants SAG. אלה מבחני חוץ גופית הם נוח במהירות ההקרנה של מולקולות מפעילים trophic (הישרדות) או טרופי (כיווני) ההשפעות על נוירונים SAG, במיוחד לפני ביצוע מחקרי in vivo. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת בדיקה של מולקולות בודדות תחת בסרום ללא תנאים, עם הישרדות נוירון גבוהה ^8.

Protocol

מתכונים

צ'יק האצבעות

7.2 גרם	NaCl
0.23 גר '	CaCl 2 + 2H 2 O
0.37 גר '	KCl
0.115 גרם	Na 2 HPO 4
900 מ"ל	מים (תרבות כיתה רקמות)

הערה: התאמת ה-pH ל -7.4. תביאו נפח סופי 1000 מ"ל עם מים.

10X PBS

40 גרם	NaCl
1 גרם	KCl
7 גרם	Na 2 HPO 4
1.2 גרם	KH 2 PO 4
450 מ"ל	DEPC מים

הערה: התאמת ה-pH ל -7.4. תביאו הסופי נפח 500 מ"ל מים. ריכוז עבודה (1X) נעשית על ידי דילול המניות חלק 1 10X עם 9 חלקים של מים רקמות תרבות כיתה, כגון זה שהושג עם מערכת הקרנה Millipore UV כדי לייצר מים עם מוליכות MΩ 18 ס"מ.

SAG בינוני explant מחזיק

• DMEM/F12 עם L-גלוטמין, 10 Hepes mM
• אינסולין 10%, העברת, סלניום (1 ​​ITS)
• 1% עט סטרפטוקוקוס

Explant בינוני תרבות

• SAG בינוני explant מחזיק
• 10 ng / ml Neurotrophin-3 (NT-3)
• 10 ng / ml גורם neurotrophic ריסי (CNTF)

חוט השדרה לנתיחה ובינוניים מחזיק

• L-15
• 10% עגל בסרום עוברי
• 1% עט סטרפטוקוקוס

לדגור על הביצים 37-38 ° C. לעקר לנתח בכלים צלחת Sylgard לנתח באתנול 70%. הביתור צלחות וכלים יכול להיות גם UV לעקר לילה.

> 1. הכנה ביד

1. המקום חרוזים microtube עם 1 מ"ל סטרילי PBS, לערבב, ולחכות החרוזים להתיישב אל החלק התחתון של הצינור.
2. שטפו את החרוזים כמה פעמים על ידי הסרת supernatant לאחר חרוזים יש מיושב resuspend ב PBS.
3. דגירה את החרוזים מטוהרים חלבון (בדילול מלא PBS) או PBS לבד (Control) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
4. יש לשטוף את החרוזים PBS ולאחסן בצלחת 24-היטב עם 1ml PBS עד ממוקם קולגן.

2. הגנגליון Statoacoustic לנתיחה

1. ב E4 להסיר את העובר מן הביצה ומניחים אותו בצלחת חומוס עם פתרון של Ringer להסרת קרומים עובריים.
2. מניחים את העובר בצלחת פטרי Sylgard © מרופדת מלא HBSS קר עמדת העובר על צידו עם שלפוחית ​​otic פונה כלפי מעלה. פין העובר על צלחת באמצעות סיכות לנתח.
3. באמצעות שתי סיכות לנתח, לעשות חתך אופקי דרך העור הגחון מידשקיות התעלה, כ איפה זה פוגש את צינור שבלול. ביצוע חתך אנכי הקדמי ואת האחורי לשקוע. שימוש במלקחיים או סיכה להרים לנתח ולהסיר את קפל העור גובל שלושה חתכים.

   הערה: SAG ממוקם בקצה anteroventral של otocyst, בערך באמצע הדרך בין כיס הגבי המופיעה בקלות עם תאורה בסיס brightfield, ואת צינור שבלול הגחון אשר פרויקטים ventromedially והוא מוסתר על ידי הקשתות בלוע. מתארך כל כך דביק שבלול מימד dorsoventral שלה יהיה להגדיל בהדרגה על E4 בין המבורגר, המילטון בשלבים 23-25 ​​ספטמבר.

4. משוך את otocyst בכיוון האחורי כדי להפריד אותו SAG. לעקור הרקמה שמסביב SAG עם סיכות לנתיחה ובזהירות להסיר את SAG מן העובר באמצעות מלקחיים # 55. הסר חתיכות גדולות של רקמה mesenchymal וצרורות עצבים מבצבצת SAG.
5. בעזרת קצה רחב הפה pipet, העברת explant ל24 גם צלחת עם explant 0.5 מ"ל SAG מחזיק בינוני. שמור explants על הקרח או בטמפרטורת החדר עד 4 שעות.

3. חוט השדרה לנתיחה

1. הסר את העובר E6 מן הביצה ומניחים בצלחת חומוס המכיל פתרון של Ringer. הסר את הראש ואת הקרומים העובריים.
2. מניחים את הגוף Sylgard © מאכל המכיל לנתח לנתיחה קר חוט השדרה בינוני. מיקום הסיכה העובר "את הגחון" ואת הזנב מול הנסיין. המקום סיכות לנתח דרך כל איבר עד סוף הקדמי.
3. שימוש במלקחיים ו / או לנתח סיכות, בזהירות להסיר עור ורקמות, נע לכיוון הגחון, עד פני השטח הגבי של חוט השדרה גלוי.
4. חותכים את קו האמצע הגבי של חוט השדרה עם סיכה לנתח, ב האחורי לכיוון הקדמי, לאורך כל אורכו של חוט השדרה. זה יוצר "ספר פתוח", כמו את הצדדים הימני והשמאלי של חוט השדרה נפרדת.
5. הסר את חוט השדרה מן הגוף על ידי מחזיק את קצה הזנב ביותר של חוט השדרה עם מלקחיים והרמת למעלה מן הנסיין. הסר DRG הנותרים קרומי המוח.
6. החזק קצה אחד של חוט השדרה עם מלקחיים (או להצמיד אותו בצלחת) ולהשתמש מספריים Vannas לחתוך לאורך קו האמצע הגחון, כדי לחצות את חוט השדרה.
7. החזק קצה אחד של explant עם מלקחיים כדי לשתק את רקמות להשתמש במספריים Vannas לחתוך explants קטנות (100-500 אממ אורך) לאורכו של הרקמה. צלחת בקומה יכול להיות מוכר עיבוי ברורה של רקמות לאורך קצה אחד explant.
8. השתמש קצה הפה רחב pipet להעביר explants לצלחת גם 24 עם בינוני לנתיחה מ"ל 0.5 קר. שמור explants על קרח כדי לשמור על הכדאיות רקמות, ואו עד 4 שעות.

4. Explant תרבות עם חלבונים מטוהרים לבחון היענות neurite

1. הכן 1.5 מ"ג / מ"ל ​​פתרון קולגן צינור חרוטי 15 מ"ל, על הקרח, על פי הוראות היצרן.
2. בדוק את הפתרון קולגן יש pH של 7-7.4 באמצעות נייר אינדיקטור pH. התאם את ה-pH ע"י הוספת NaOH ב 1 כרכים μl.
3. העברת explants לצלחת 24 גם באמצעות פה רחב pipet טיפ לשאוב נוזל עודף. Explants מרובים יכול להיות מתורבת אחד טוב, אבל צריך להיות ממוקם לפחות 500 מיקרומטר אחד מהשני.
4. הוסף 0.5 מ"ל של קולגן אל הבאר המכילה את explant. מקם את explant על פני השטח התחתון של הבאר. הקפידו להגדיר כל תרבות לחלוטין לפני שתמשיך גם כי קולגן הבא יתחיל לפלמר בטמפרטורת החדר.
5. מניחים את הצלחת התרבות על 37 ° C שקופיות חם 30-45 דקות עד לפלמר קולגן. כאשר הקולגן יש polymerized זה יהיה דומה ג'ל.
6. הוסף 0.5 מ"ל תרבות explant חם בינוני בתוספת או חלבונים מטוהרים (בדילול מלא PBS) או PBS (Control) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. השפעות על תוצאה neurite צריך להיות גלוי על ידי 24 שעות.

   הערה: השתמשנו באותו פרוטוקול כדי explants SAG תרבות עד 42 שעות.

5. Explant שיתוף תרבות עם חלבון מצופים חרוזים לבדוק תוצאה neurite כיוונית

1. בגין בצעדים תרבות explant 4.1-4.4.
2. שימוש pipet, העברת 1-5 חרוזים מן PBS אל היטב המכיל את פתרון קולגן explant.
3. שימוש במלקחיים למצב חרוזים 5-50 מיקרומטר מקצה explant.
4. מניחים את הצלחת על 37 ° C שקופיות חם 30-45 דקות עד לפלמר קולגן. הרקמה או חרוז עשוי להפוך העקורים כפי הקולגן polymerizes. בדוק את תרבויות מחדש לתפקיד רקמות וחרוזים במשך 5 דקות הראשונות.
5. הוסף 0.5 מ 'אני SAG מדיה זה טוב דגירה למשך 24 שעות.

6. ויזואליזציה של תוצאה neurite ידי אימונוהיסטוכימיה

1. יש לשטוף תרבויות PBS ולתקן שעה 1 בטמפרטורת החדר paraformaldehyde 4% ב-PBS.
2. שחרר את הג'לים מחומות בארות על ידי התחקות מסביב לקצה של הג'לים עם סיום מעוגל של מרית טפלון מיקרו. בצע את immunostain עם ג'לים של בארות. יש לשטוף מספר פעמים PBS.
3. דגירה בפתרון 0.5 מ"ל חסימה (10% נסיוב עגל, 0.1% טריטון X-100, אזיד הנתרן 0.1% ב PBS) לילה ב 4 ° C.
4. דגירה של נוגדנים 0.5 העיקרי מ"ל (אנטי-β טובולין נוגדן מדולל 1:500 בחסימת פתרון) לילה ב 4 ° C.
5. יש לשטוף מספר פעמים PBS. דגירה של נוגדנים 0.5 מ"ל משני (אלקסה פלואוריד 488 עיזים אנטי עכבר נוגדנים IgG _2b מדולל 1:500) לילה ב 4 ° C. מתוך שלב זה קדימה, לשמור על צלחות בחושך או לעטוף בנייר כסף, בשל הרגישות של אורמשני נוגדנים.
6. יש לשטוף מספר פעמים PBS ולאחסן ב 4 ° C ב PBS עד שבוע אחד.

7. נציג תוצאות

באיור 1. תוצאות נציג neurite קידום השפעות מטוהרים NT-3 ו NT-3-מצופה חרוזים על explants E4 חומוס SAG. SAG תא עצב גופים neurites היו immunostained עם טובולין β-הדמיה עם מטרה 10x על מיקרוסקופ confocal. לאחר 24 שעות במבחנה, explants SAG מוצג תולדה neurite יותר בנוכחות של 100 ng / ml מטוהרים אדם NT-3 הוסיף המדיום הסלולרי תרבות (1B), בהשוואה לקבוצת הביקורת (1A). נוירונים SAG היו שיתוף תרבותי עם חרוזים ספוג in100 ng / ml NT-3 להוכיח כי מקור הצבע של NT-3 יכול מקומי לקדם תוצאה neurite. Explants מוצג ארוכים תולדה neurite צפופה בצד שלexplant מול חרוז לעומת הצד הנגדי (1D) ו לעומת שליטה תרבויות עם חרוזים ספוגה PBS (1C). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר.

באיור 2. תוצאות נציג neurite קידום השפעות מטוהרים Wnt5a ו Wnt5a מצופים חרוזים על חוט השדרה E6 חומוס. Explants חוט השדרה היו immunostained עם טובולין β-הדמיה באמצעות מיקרוסקופ confocal. לאחר 24 שעות של גידול בנוכחות מטוהרים עכבר Wnt5a (400ng/ml), תולדה neurite מ explants חומוס חוט השדרה הוגדל (2B) בהשוואה לקבוצת הביקורת תרבותי ללא Wnt5a (2A). חרוזים ספוגה 500 ng / ml Wnt5a, הניח 300-500 מיקרומטר מקצה explants חוט השדרה, קידם גם תולדה neurite (2D) לעומת שליטה תרבויות (2C). בדומה שיתוף תרבות התוצאות פורסמו בעבר עם Wnt5a-להביע תאים ^8. סרגל קנה מידה = 200מיקרומטר.

Discussion

אנו מציגים שיטה לנתח ותרבות SAG E4 ו E6 explants חוט השדרה, מן חומוס, תחת בסרום ללא תנאים. הליך זה משמש כיום במעבדה שלנו כדי לחקור את ההשפעות של ligands שונים המופרשים על ההישרדות SAG נוירון ו תולדה neurite. היבטים רומן של פרוטוקול זה כולל את השימוש במערכת בסרום חופשי עבור explants culturing ושימוש חרוזים ספוגה גורמי גדילה כדי ללמוד על השפעות תולדה neurite SAG. שיטה חרוז דומה לשלנו תוארה על חוט השדרה חומוס ^10. באופן מסורתי, חרוזים שימשו במחקרים קלאסי עם הדרכה גורמים האקסון ו morphogens. כאן, אנו הראו כי assay חרוז יכול לשמש גם כדי לחקור את ההשפעות של neurotrophins (או גורמי גדילה אחרים) על תוצאה neurite (איור 1).

ישנם שלבים קריטיים בהליך כי ייתכן שיהיה צורך לשנות או אופטימיזציה עבור יישומים שונים. צעדים אלה הם גם משתנים חשובים עבור trouble-ירי ניסויים שנראים מוצלחים. ראשית, Neurotrophin-3 (NT-3), גורם neurotrophic ריסי (CNTF) ו ITS (אינסולין, transferrin, סלניום) נוספו בינוני התרבות כדי לקדם נוירון הישרדות SAG ולשפר תולדה neurite ^6,8. גורמים אלו הצמיחה כלולים הניסויים חוט השדרה על מנת לבדוק את bioactivity של מולקולות בתנאים assay אותו כי explants SAG נבדקו. עם זאת, גורמי גדילה אחרים עשויים להיות מתאימים יותר עבור אלו סוגי רקמות אחרות. שנית, 1.5 מ"ג / מ"ל ​​בריכוז של קולגן נבחר לאחר בדיקת מגוון רחב של ריכוזי קולגן (0.5, 1.0, 1.5 ו - 2 מ"ג / מ"ל) משום שהוא הפיק תוצאה neurite החזקה ביותר מ SAG את העוף E4 אחרי 24 שעות. מקורות אחרים של נוירונים עשוי להציג אופטימלית שונים של קולגן. לבסוף, ריכוז החלבון, מספר חרוזים, ואת המרחק בין explants וחרוזים צריך גם להיות מותאם עבור כל יישום. חלקם למעשה צמיחהאו.אר. אס, כגון morphogens, באים לידי ביטוי הדרגתיים ולהפעיל ריכוז תלויי השפעות על האקסונים לגדול במהלך הפיתוח ^11. לכן, בטווח של ריכוזי תמיד צריך להיבדק עם מבחני תוצאה neurite. יש להקפיד להימנע רעילות: ראינו רמות גבוהות של מוות של תאים עם ריכוז גבוה של חלבונים מסוימים (למשל, סוניק הקיפוד).

שיטה זו ניתן להתאים ליישומים נוספים, כולל בגילאים אחרים, סוגי רקמות, שיתוף בתרבות שיטות immunostaining נוספים (למשל, מבחני הישרדות התא). יש לנו תרבות בהצלחה E3-E5 SAG, הרשתית E6, E7 ו explants הנורה חוש הריח, מן חומוס, באמצעות תנאים אותה תרבות. כאשר תוצאה היא איתנה בדגימות שליטה, שיטה זו יכולה גם לחשוף את התגובות דוחה גורמים המופרשים. שיטות דומות שימשו לבדיקת ההשפעות של morphogens על נוירונים יונקים ^12,13, ואנחנו בודקים את ההשפעות של BMPs, FGFs ו ששעות על תוצאה neurite SAG. כמו כן, מאחר ג'ל קולגן הם polymerized בצלחת 24-היטב, הם גדולים מספיק בשביל לאחר מכן הטבעה וכן חתך עם cryostat. אנו שגרתי לבצע מבחני TUNEL על cryosections של ג'ל תרבויות קולגן, אשר מאפשרת לנו לתאם את רמת הישרדות התא עם סכום של תוצאה neurite ממדגם אותו ^8.

ישנן מגבלות על השימוש בג'ל מבחני קולגן באופן שבו הצגנו אותם כאן. לדוגמה, התגובות שנצפו פשוטה בכוונה בסביבה חוץ גופית עלולה שלא לשקף התגובות גורם זהה כאשר נוכח מורכבות יותר במצב vivo. כמו כן, אין אנו יכולים להבחין היקפי מתהליכים המרכזי אינו יכול להבחין שמיעתי מן neurites שיווי המשקל. לכן, ההטרוגניות של היענות בקרב אוכלוסיות אלו יכול להניב תוצאה לא סדיר או לא אחידה, או אם את האוכלוסייה להגיב הוא חלק קטן שלבסך הכל, הגנגליון יכול להיות הבקיע כמו מראה שום השפעה. לבסוף, הצגנו שיטה שניתן להשתמש בהם כדי explants תרבות E4 SAG תחת בסרום ללא תנאים עם הישרדות נוירון משמעותי, עם מגוון של יישומים מלימוד הישרדות התא אל האקסון הדרכה. בסך הכל, המערכת הזו מועילה משום שהיא מאפשרת לעקוב אחר תופעות עקב תוספת של מטוהרים גורמים לבד או בצירופים ללא המשתנים מבלבלים גורמים אחרים מופרשים והדרכה האקסון רמזים שעשויים להיות נוכח בסביבה vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection microscope			We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination
Slide warmer	C.S. E.		Collagen polymerization
Chicken egg incubator
37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator
Sylgard© coated petri dish
24-well cell culture plate	Corning	3526
#5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-30
#55 Dumont forceps	Fine Science Tools	11295-51
Stainless steel dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10	Embryo pinning, fine dissection
Moria perforated spoon	Fine Science Tools	10370-17	Embryo harvest/transfer
200 μl wide mouth pipet tips	Dot Scientific, Inc.	118-96R	Explant transfer
E4 and E6 chicken eggs
Chick Ringer’s solution			Embryo harvest
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264	SAG dissection
L15 medium	Sigma-Aldrich	L5520	Spinal cord dissection medium
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11150	Spinal cord dissection medium
Vannas Scissors	World Precision Instruments, Inc.	501778	Spinal cord dissection
Rat-tail collagen Type I	BD Biosciences	354249	Explant culture
10X PBS (Sterile)			To neutralize collagen
1N NaOH (Sterile)			To neutralize collagen
Distilled water (Sterile)			To neutralize collagen
pH indicator papers (6.0-8.1)	Whatman, GE Healthcare	2629-990	To check collagen pH
15 ml conical tubes	Dot Scientific, Inc.	818-PG
500 μl wide mouth pipet tips	Dot Scientific, Inc.	119-R100	To pipet collagen
DMEM/F12 medium	Sigma-Aldrich	D8437	Explant culture medium
ITS+1	Sigma-Aldrich	I2521	Medium supplement
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Medium supplement
CNTF (rat)	Sigma-Aldrich	C3835	Medium supplement
NT-3 (human)	Sigma-Aldrich	N1905	Medium supplement
Purified mouse Wnt5a	R&D Systems	645-WN-010
Affi-gel Blue gel beads	Bio-Rad	153-7302
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Fixation
PBS			Rinses
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Blocking solution
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032	Blocking solution
Calf serum	Invitrogen	16170-078	Blocking solution
Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody	Sigma-Aldrich	T8535	Labels cell bodies and neurites
Alexa fluor 488 goat anti -–mouse IgG2b antibody	Invitrogen	A21141	Detects β Tubulin antibody
Teflon micro spatula	VWR international	57949-033	Release collagen gels from well