Summary
हम प्रदर्शन कैसे टुकड़े करना और संस्कृति लड़की E4 statoacoustic नाड़ीग्रन्थि और E6 रीढ़ की हड्डी explants. Explants 24 घंटे के लिए 3 डी कोलेजन जैल में सीरम मुक्त शर्तों के तहत सुसंस्कृत हैं. Neurite जवाबदेही कारक पूरक मध्यम विकास के साथ और प्रोटीन में लिपटे मोतियों के साथ परीक्षण किया है.
Protocol
व्यंजनों
चिकी Ringers
| 7.2 छ | NaCl |
| 0.23 छ | CaCl 2 + 2 हे 2H |
| 0.37 छ | KCl |
| .115 छ | ना दो चार HPO |
| 900 मिलीलीटर | जल (टिशू कल्चर ग्रेड) |
नोट: 7.4 पीएच समायोजित. 1000 मिलीलीटर पानी के साथ अंतिम मात्रा लाओ.
10X पीबीएस
| 40 छ | NaCl |
| 1 ग्राम | KCl |
| 7 छ | ना दो चार HPO |
| 1.2 छ | के.एच. 2 पीओ 4 |
| 450 मिलीलीटर | DEPC पानी |
नोट: 7.4 पीएच समायोजित. अंतिम लाओपानी के साथ 500 मिलीलीटर मात्रा. कार्य एकाग्रता (1X) Millipore यूवी विकिरण 18 MΩ सेमी चालकता के साथ पानी उत्पन्न सिस्टम के साथ प्राप्त की है कि जैसे ऊतक संस्कृति ग्रेड पानी के 9, भागों के साथ भाग 1 10X शेयर गिराए के द्वारा बनाई गई है.
Explant पकड़े मध्यम शिथिलता
- एल glutamine के साथ, DMEM/F12 10 मिमी Hepes
- 10% इंसुलिन, स्थानांतरण सेलेनियम, (1 इसके)
- 1% कलम strep
Explant मध्यम संस्कृति
- Explant पकड़े मध्यम शिथिलता
- 10 एनजी / मिलीलीटर Neurotrophin-3 (NT-3)
- 10 एनजी / एमएल सिलिअरी neurotrophic कारक (CNTF)
रीढ़ की हड्डी विच्छेदन और मध्यम पकड़े
- L-15
- 10% भ्रूण बछड़ा सीरम
- 1% कलम strep
37-38 में अंडे सेते ° सी. 70% इथेनॉल में उपकरण और Sylgard विदारक पकवान विदारक जीवाणुरहित. व्यंजन और उपकरणों विदारक भी यूवी रातोंरात निष्फल कर सकते हैं.
- 1 मिलीलीटर बाँझ Pbs, मिश्रण, और मोतियों के लिए प्रतीक्षा करने के लिए ट्यूब के नीचे बसने के साथ एक microtube में रखें मोती.
- मोती सतह पर तैरनेवाला हटाने के बाद मोती बसे और पीबीएस में resuspend के द्वारा कई बार धोएं.
- कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्रोटीन (पीबीएस में पतला) या पीबीएस अकेले (नियंत्रण) शुद्ध में मोती सेते हैं.
- 1ml पीबीएस के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली में पीबीएस और दुकान में मोती कुल्ला तक कोलेजन में रखा है.
2. Statoacoustic नाड़ीग्रन्थि विच्छेदन
- E4 में अंडे से भ्रूण को हटाने और यह लड़की है घंटी भ्रूण झिल्ली को हटाने समाधान के साथ एक थाली में जगह है.
- एक Sylgard © पंक्तिवाला पेट्री ठंड HBSS और कान का सामना करना पड़ रहा पुटिका के साथ अपनी तरफ भ्रूण की स्थिति से भरा पकवान में भ्रूण रखें. विदारक पिन का उपयोग पकवान भ्रूण पिन.
- दो विदारक पिन का उपयोग, त्वचा के माध्यम से एक क्षैतिज कटौती करने के तुरंत वेंट्रलनहर के पाउच, जहां लगभग यह कर्णावत वाहिनी मिलती है. एक ऊर्ध्वाधर कट पूर्वकाल और शिथिलता के लिए पीछे. संदंश या एक विदारक पिन का उपयोग लिफ्ट हटाने और त्वचा के प्रालंब तीन कटौती द्वारा bordered है.
नोट: शिथिलता otocyst के anteroventral किनारे पर स्थित है, पृष्ठीय थैली है जो आसानी से brightfield आधार रोशनी के साथ दिखाई देता है, और वेंट्रल कर्णावत वाहिनी जो ventromedially परियोजनाओं और ग्रसनी मेहराब द्वारा obscured है के बीच बीच के बारे में. कर्णावत वाहिनी elongates अपनी dorsoventral आयाम ताकि E4 पर हैम्बर्गर - हैमिल्टन 9 23-25 चरणों के बीच उत्तरोत्तर वृद्धि होगी.
- पीछे यह शिथिलता से अलग दिशा में otocyst खींचो. विस्थापित विच्छेदन पिन के साथ शिथिलता आसपास के ऊतकों और ध्यान # 55 संदंश का उपयोग भ्रूण से शिथिलता को दूर. Mesenchymal ऊतक और उभड़नेवाला शिथिलता से तंत्रिका बंडलों का बड़ा हिस्सा निकालें.
- एक मुँह विस्तृत pipet टिप का उपयोग करना, एक explant हस्तांतरण0.5 मिलीलीटर शिथिलता मध्यम पकड़े explant के साथ 24 अच्छी तरह से थाली. 4 घंटे के लिए बर्फ पर explants या कमरे के तापमान पर रखें.
3. स्पाइनल कॉर्ड विच्छेदन
- अंडे से E6 भ्रूण निकालें और यह एक लड़की है घंटी समाधान युक्त पकवान में जगह. सिर और भ्रूण झिल्ली निकालें.
- शरीर में एक Sylgard © विदारक ठंड रीढ़ की हड्डी विच्छेदन मध्यम युक्त पकवान प्लेस. स्थिति और पिन भ्रूण "नीचे ventral" और दुम का experimenter का सामना करना पड़ रहा है. प्रत्येक अंग के माध्यम से और पूर्वकाल अंत के माध्यम से विदारक पिन प्लेस.
- संदंश और / या पिन विदारक, ध्यान से त्वचा और ऊतकों को निकालने के लिए, एक वेंट्रल दिशा में चलती है, रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सतह तक दिखाई देता है.
- एक विदारक पिन के साथ रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय midline कट, पूर्वकाल दिशा में एक पश्च में रीढ़ की हड्डी की पूरी लंबाई के साथ. यह एक रीढ़ की हड्डी अलग की हड्डी के बाएँ और दाएँ पक्ष के रूप में एक "खुली किताब" बनाता है.
- संदंश के साथ दुम का सबसे रीढ़ की हड्डी के अंत पकड़ और experimenter से और दूर उठाने के द्वारा शरीर से रीढ़ की हड्डी निकालें. शेष DRG और meninges निकालें.
- संदंश (या यह पकवान के लिए पिन) के साथ रीढ़ की हड्डी के एक छोर पकड़ो और Vannas कैंची का उपयोग वेंट्रल midline के साथ काटा, रीढ़ की हड्डी द्विविभाजित.
- संदंश ऊतक स्थिर और Vannas कैंची का उपयोग करने के लिए ऊतक की लंबाई के साथ छोटे explants (लंबाई में 100-500 उम) में कटौती के साथ explant के एक छोर पकड़ो. मंजिल थाली ऊतक के एक explant बढ़त के साथ एक स्पष्ट और अधिक मोटा होना के रूप में पहचाना जा सकता है है.
- एक चौड़े मुंह pipet टिप का प्रयोग 0.5 मिलीलीटर ठंड विच्छेदन मध्यम के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए explants हस्तांतरण. बर्फ पर explants ऊतक व्यवहार्यता, च बनाए रखने के लिए रखेंया अप करने के लिए 4 घंटे.
4. शुट्ठ प्रोटीन के साथ संस्कृति Explant neurite जवाबदेही का परीक्षण
- एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 1.5 मिलीग्राम / एमएल समाधान कोलेजन तैयार, बर्फ पर निर्माता के निर्देशों के अनुसार.
- सत्यापित करें कोलेजन समाधान 7-7.4 का उपयोग पीएच सूचक कागज का एक pH है. 1 μl मात्रा में NaOH जोड़कर पीएच को समायोजित करें.
- 24 अच्छी तरह से थाली का उपयोग एक चौड़े मुंह pipet टिप और महाप्राण (व्यंजन) अतिरिक्त तरल explants स्थानांतरण. एक अच्छी तरह से में एकाधिक explants सुसंस्कृत किया जा सकता है है, लेकिन कम से कम 500 सुक्ष्ममापी रखा जाना चाहिए है एक दूसरे से अलग.
- अच्छी तरह से explant युक्त करने के लिए कोलेजन की 0.5 मिलीलीटर जोड़ें. अच्छी तरह से नीचे की सतह पर explant स्थिति. प्रत्येक संस्कृति पूरी तरह से अगले अच्छी तरह के साथ आगे बढ़ने से पहले क्योंकि कोलेजन कमरे के तापमान पर भाजन करना शुरू हो जाएगा सेट करने के लिए सुनिश्चित करें.
- एक डिग्री सेल्सियस स्लाइड 30-45 मिनट के लिए गर्म कोलेजन polymerize 37 पर संस्कृति की थाली प्लेस. जब कोलेजन polyme हैrized है कि यह एक जेल समान होगा.
- 0.5 मिलीलीटर गर्म explant संस्कृति या तो शुद्ध प्रोटीन (पीबीएस में पतला) या पीबीएस (नियंत्रण) के साथ पूरक मध्यम जोड़ें और 37 में सेते ° सी, 5% सीओ 2 . Neurite परिणाम पर प्रभाव 24 घंटे से दिखाई जानी चाहिए.
नोट: हम संस्कृति शिथिलता explants करने के लिए एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग किया है 42 घंटे के लिए.
5. प्रोटीन में लिपटे मोतियों के साथ सह संस्कृति Explant दिशात्मक neurite परिणाम परीक्षण
- Explant 4.1 4.4 संस्कृति कदम के साथ शुरू करो.
- एक pipet का प्रयोग, पीबीएस से अच्छी तरह से कोलेजन समाधान और explant युक्त 1-5 मोती हस्तांतरण.
- संदंश का प्रयोग करें explant के किनारे से 50-500 सुक्ष्ममापी मोती स्थिति.
- एक डिग्री सेल्सियस स्लाइड 30-45 मिनट के लिए गर्म कोलेजन polymerize 37 पर थाली प्लेस. ऊतक या मनका विस्थापित के रूप में कोलेजन polymerizes बन सकता है. पहले 5 मिनट के दौरान और फिर स्थिति ऊतक और मोती संस्कृतियों की जाँच करें.
- 0.5 मीटर जोड़ेंएल एक अच्छी तरह से मीडिया शिथिलता और 24 घंटे के लिए सेते हैं.
6. Neurite परिणाम के immunohistochemistry द्वारा विज़ुअलाइज़ेशन
- पीबीएस में संस्कृतियों कुल्ला और पीबीएस में 4% paraformaldehyde में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ठीक है.
- कुओं की दीवारों से एक teflon सूक्ष्म लेपनी के गोल अंत के साथ जैल के किनारे के आसपास अनुरेखण द्वारा जैल रिलीज. कुओं में जैल के साथ प्रदर्शन immunostain. पीबीएस में कई बार कुल्ला करें.
- 0.5 मिलीलीटर अवरुद्ध (10% बछड़ा सीरम, 0.1% ट्राइटन X-100, पीबीएस में 0.1% सोडियम azide) 4 बजे समाधान रातोंरात डिग्री सेल्सियस में सेते
- 0.5 मिलीलीटर प्राथमिक एंटीबॉडी (विरोधी β ट्यूबिलिन एंटीबॉडी 1:500 पतला समाधान अवरुद्ध में) में 4 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस
- पीबीएस में कई बार कुल्ला करें. 0.5 मिलीलीटर माध्यमिक एंटीबॉडी (Alexa स्त्राव 488 बकरी विरोधी माउस आईजीजी 2b एंटीबॉडी पतला 1:500) में 4 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस इस कदम आगे से, अंधेरे या पन्नी में लपेटो में प्लेटें, प्रकाश की संवेदनशीलता के कारण रखनामाध्यमिक एंटीबॉडी.
- 4 में एक सप्ताह तक के लिए डिग्री सेल्सियस पीबीएस में पीबीएस और दुकान में कई बार कुल्ला.
7. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1. NT-3 शुद्ध और E4 लड़की शिथिलता explants पर NT-3-लिपटे मोतियों के neurite को बढ़ावा देने के प्रभाव के प्रतिनिधि परिणाम है. न्यूरॉन सेल शरीर और neurites β ट्यूबिलिन साथ immunostained थे और एक confocal खुर्दबीन पर एक 10x उद्देश्य के साथ imaged शिथिलता. इन विट्रो में 24 घंटे के बाद, शिथिलता explants एनजी / मिलीलीटर विशुद्ध मानव NT 3 - सेल संस्कृति माध्यम (1 बी) में जोड़ा 100 की उपस्थिति में अधिक से अधिक neurite परिणाम प्रदर्शित नियंत्रण (1 ए) की तुलना में. शिथिलता न्यूरॉन्स थे in100 एनजी / मिलीलीटर NT-3 लथपथ को दिखाना है कि NT-3 के एक बिंदु स्रोत स्थानीय neurite परिणाम को बढ़ावा कर सकते हैं मोतियों के साथ सह सुसंस्कृत. Explants अब प्रदर्शित की तरफ denser neurite परिणामका सामना करना पड़ रहा explant मनका विपरीत पक्ष (1D) की तुलना में और पीबीएस (1C) में भिगो मोतियों के साथ संस्कृतियों को नियंत्रित करने के लिए की तुलना में. स्केल बार = 200 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 2. E6 लड़की रीढ़ की हड्डी पर neurite को बढ़ावा देने के शुद्ध Wnt5a और Wnt5a लिपटे मोतियों के प्रभाव के प्रतिनिधि परिणाम है. रीढ़ की हड्डी explants β ट्यूबिलिन साथ immunostained थे और एक confocal खुर्दबीन के साथ imaged. शुद्ध माउस (400ng/ml) Wnt5a लड़की रीढ़ की हड्डी explants से neurite परिणाम की उपस्थिति में विकास के 24 घंटे के बाद बढ़ा दिया गया था (2B) Wnt5a (2A) के बिना सभ्य नियंत्रण की तुलना में. 500 एनजी / मिलीलीटर Wnt5a में लथपथ मोती, रीढ़ की हड्डी explants के किनारे से 300-500 सुक्ष्ममापी रखा, भी neurite परिणाम (2 डी) (2C) संस्कृतियों को नियंत्रित करने के लिए की तुलना में पदोन्नत. पहले 8 Wnt5a व्यक्त कोशिकाओं के साथ इसी प्रकार की सह - संस्कृति परिणाम प्रकाशित किए गए थे . स्केल बार = 200सुक्ष्ममापी.
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Discussion
हम एक विधि टुकड़े करना और संस्कृति E4 शिथिलता और E6 रीढ़ की हड्डी explants, लड़की से सीरम मुक्त शर्तों के तहत, वर्तमान. यह प्रक्रिया वर्तमान में हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है शिथिलता न्यूरॉन अस्तित्व और neurite परिणाम पर विभिन्न secreted ligands के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए. इस प्रोटोकॉल के उपन्यास पहलुओं संवर्धन explants और वृद्धि कारकों में शिथिलता neurite परिणाम पर प्रभाव का अध्ययन करने के लिए भिगो मोतियों के उपयोग के लिए एक सीरम मुक्त प्रणाली का उपयोग शामिल है. चूजा 10 कॉर्ड रीढ़ की हड्डी के लिए एक मनका हमारा समान विधि वर्णित किया गया है . परंपरागत रूप से, मोती क्लासिक अक्षतंतु मार्गदर्शन कारकों और morphogens के साथ अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है. यहाँ, हम पता चला है कि मनका परख भी neurite परिणाम (1 छवि) पर neurotrophins (या अन्य विकास कारकों) के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम है कि संशोधित या विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा आवश्यकता हो सकती है. ये कदम भी troub के लिए महत्वपूर्ण चर रहे हैंले शूटिंग प्रयोगों है कि असफल हो दिखाई देते हैं. सबसे पहले, Neurotrophin 3 (NT-3), सिलिअरी neurotrophic (CNTF) कारक है और इसके (इंसुलिन, transferrin, सेलेनियम) संस्कृति के माध्यम से जोड़ा गया शिथिलता न्यूरॉन के अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए और बढ़ाने neurite परिणाम 6,8. इन वृद्धि कारकों रीढ़ की हड्डी के प्रयोगों में शामिल कर रहे हैं क्रम में एक ही परख कि शिथिलता explants परीक्षण किया गया शर्तों के तहत अणुओं की bioactivity परीक्षण है. हालांकि, अन्य विकास कारकों इन और अन्य प्रकार के ऊतकों के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है. दूसरा, कोलेजन की एकाग्रता एक 1.5 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन सांद्रता की एक सीमा (0.5, 1.0, 1.5 और 2 मिलीग्राम / एमएल) का परीक्षण है क्योंकि 24 घंटों के बाद सबसे मजबूत E4 चिकन शिथिलता से neurite परिणाम का उत्पादन किया के बाद चुना गया था. न्यूरॉन्स के अन्य स्रोतों कोलेजन का एक अलग इष्टतम प्रदर्शित कर सकता है. अंत में, प्रोटीन सांद्रता, मोतियों की संख्या, और explants और मोतियों के बीच की दूरी भी प्रत्येक आवेदन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. कुछ विकास तथ्यmorphogens जैसे अन्य रैंकों, gradients में व्यक्त कर रहे हैं और 11 के विकास के दौरान एकाग्रता पर निर्भर बढ़ रही axons पर प्रभाव डालती है . इसलिए, सांद्रता के एक श्रृंखला हमेशा neurite परिणाम assays के साथ परीक्षण किया जाना चाहिए. देखभाल करने के लिए विषाक्तता से बचने के लिए लिया जाना चाहिए: हम कुछ प्रोटीन की उच्च सांद्रता के साथ मनाया कोशिका मृत्यु का ऊंचा स्तर (eg., ध्वनि हाथी).
यह विधि अन्य उम्र, ऊतक प्रकार, सह संस्कृति तरीकों, और अतिरिक्त immunostaining (eg., सेल अस्तित्व assays) सहित अतिरिक्त अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हम सफलतापूर्वक सुसंस्कृत शिथिलता E3-E5, E6 रेटिना, और E7 घ्राण बल्ब explants है, लड़की से, एक ही संस्कृति शर्तों का उपयोग कर. जब परिणाम नियंत्रण नमूनों में मजबूत है, इस पद्धति का भी secreted कारकों को प्रतिकारक प्रतिक्रिया प्रकट कर सकते हैं. इसी तरह के तरीकों स्तनधारी 12,13 न्यूरॉन्स पर morphogens के प्रभाव के परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया थे, और हम वर्तमान में BMPs, FGFs, और श्री के प्रभाव की जांच कर रहे हैंशिथिलता neurite परिणाम पर घंटे. इसके अलावा, के बाद से कोलेजन जैल 24 अच्छी तरह से एक थाली में polymerized हैं, वे के लिए काफी बड़े हैं बाद में एम्बेड और cryostat साथ सेक्शनिंग. हम नियमित रूप से कोलेजन जेल संस्कृतियों, जो हमें neurite परिणाम की राशि के साथ ही 8 नमूना सेल अस्तित्व के स्तर सहसंबंधी करने के लिए सक्षम बनाता है cryosections पर TUNEL के assays के प्रदर्शन.
जिस तरह से है कि हम उन्हें यहाँ प्रस्तुत किया है में कोलेजन जेल assays का उपयोग करने के लिए सीमाएं हैं. उदाहरण के लिए, जानबूझकर इन विट्रो वातावरण में सरल में मनाया प्रतिक्रियाओं प्रतिक्रियाओं एक ही पहलू को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है जब vivo स्थिति में और अधिक जटिल में मौजूद है. के रूप में अच्छी तरह से, हम परिधीय केंद्रीय प्रक्रियाओं से भेद नहीं श्रवण और vestibular neurites से भेद नहीं कर सकते कर सकते हैं. इसलिए, इन आबादियों के बीच जवाबदेही में विविधता अनियमित या गैर वर्दी परिणाम उपज, या हो सकता है अगर जवाब जनसंख्या का एक छोटा सा अंश हैकुल नाड़ीग्रन्थि कोई प्रभाव नहीं दिखा के रूप में बने हो सकता है. अंत में, हम एक तरीका है कि महत्वपूर्ण न्यूरॉन अस्तित्व के साथ सीरम मुक्त शर्तों के तहत संस्कृति E4 शिथिलता explants करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रस्तुत किया है अक्षतंतु मार्गदर्शन करने के लिए सेल अस्तित्व का अध्ययन से आवेदनों की एक किस्म के साथ. कुल मिलाकर, इस प्रणाली लाभकारी है क्योंकि यह एक की अनुमति देता है के अलावा अन्य कारकों secreted और अक्षतंतु मार्गदर्शन संकेत है कि vivo वातावरण में मौजूद हो सकता है के confounding चर के बिना अकेले या संयोजन में कारकों शुद्ध कारण प्रभाव की निगरानी.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान RO1DC002756 के संस्थानों और पर्ड्यू अनुसंधान फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था. हम प्रयोगों और आंकड़ों के साथ मदद के लिए रॉडने McPhail के साथ सलाह के लिए डोरिस वू और Wiese चांग धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection microscope | We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination | ||
| Slide warmer | C.S. E. | Collagen polymerization | |
| Chicken egg incubator | |||
| 37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator | |||
| Sylgard© coated petri dish | |||
| 24-well cell culture plate | Corning | 3526 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Stainless steel dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Embryo pinning, fine dissection |
| Moria perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Embryo harvest/transfer |
| 200 μl wide mouth pipet tips | Dot Scientific, Inc. | 118-96R | Explant transfer |
| E4 and E6 chicken eggs | |||
| Chick Ringer’s solution | Embryo harvest | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | H8264 | SAG dissection |
| L15 medium | Sigma-Aldrich | L5520 | Spinal cord dissection medium |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11150 | Spinal cord dissection medium |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments, Inc. | 501778 | Spinal cord dissection |
| Rat-tail collagen Type I | BD Biosciences | 354249 | Explant culture |
| 10X PBS (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| 1N NaOH (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| Distilled water (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| pH indicator papers (6.0-8.1) | Whatman, GE Healthcare | 2629-990 | To check collagen pH |
| 15 ml conical tubes | Dot Scientific, Inc. | 818-PG | |
| 500 μl wide mouth pipet tips | Dot Scientific, Inc. | 119-R100 | To pipet collagen |
| DMEM/F12 medium | Sigma-Aldrich | D8437 | Explant culture medium |
| ITS+1 | Sigma-Aldrich | I2521 | Medium supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Medium supplement |
| CNTF (rat) | Sigma-Aldrich | C3835 | Medium supplement |
| NT-3 (human) | Sigma-Aldrich | N1905 | Medium supplement |
| Purified mouse Wnt5a | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Affi-gel Blue gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation |
| PBS | Rinses | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Blocking solution |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Blocking solution |
| Calf serum | Invitrogen | 16170-078 | Blocking solution |
| Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody | Sigma-Aldrich | T8535 | Labels cell bodies and neurites |
| Alexa fluor 488 goat anti -–mouse IgG2b antibody | Invitrogen | A21141 | Detects β Tubulin antibody |
| Teflon micro spatula | VWR international | 57949-033 | Release collagen gels from well |
References
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