Summary
Dimostriamo come sezionare e cultura pulcino ganglio statoacoustic E4 ed E6 espianti midollo spinale. Espianti sono coltivate sotto siero senza condizioni in gel di collagene 3D per 24 ore. Reattività dei neuriti è testato con fattore di crescita integrata medie e con le proteine rivestite perline.
Abstract
Gli organi sensoriali dell'orecchio interno di pollo sono innervate dai processi periferici del ganglio statoacoustic (SAG) neuroni. Innervazione organo sensoriale dipende da una combinazione di segnali guida degli assoni 1 e fattori di sopravvivenza 2 situata lungo la traiettoria degli assoni in crescita e / o all'interno degli stessi obiettivi degli organi sensoriali. Per esempio, l'interferenza funzionale con un percorso classico di guida degli assoni segnalazione, semaforina-Neuropilin, generato misrouting di assoni otic 3. Inoltre, diversi fattori di crescita espresse negli obiettivi sensoriali dell'orecchio interno, compresi neurotrofina-3 (NT-3) e del fattore neurotrofico cervello derivato (BDNF), sono stati manipolati in animali transgenici, ancora una volta porta a misrouting di assoni SAG 4. Queste stesse molecole promuovere sia la sopravvivenza e la crescita dei neuriti dei neuroni SAG pulcino in vitro 5,6.
Qui, descriviamo e dimostrare il metodo in vitro stiamo ucantare per testare la reattività dei neuriti SAG pulcino alle proteine solubili, tra cui morfogeni noto come il Wnts, così come fattori di crescita che sono importanti per la promozione dei neuriti escrescenza SAG e la sopravvivenza dei neuroni. Usando questo sistema modello, speriamo di trarre conclusioni circa gli effetti che ligandi secreto può esercitare sulla sopravvivenza dei neuroni e SAG crescita dei neuriti.
Espianti SAG sono sezionato il giorno embrionale 4 (E4) e coltivate in gel tridimensionale di collagene sotto siero senza condizioni per 24 ore. In primo luogo, la reattività dei neuriti è testato da espianti coltura integrata con proteine di media. Poi, per chiedere se fonti puntuali di ligandi secreto può avere effetti direzionali sulla crescita dei neuriti, gli espianti sono co-coltura con le proteine rivestite perline e analizzati per la capacità del cordone di promuovere a livello locale o inibire escrescenza. Abbiamo anche una dimostrazione della dissezione (modificato protocollo 7) e la cultura della E6 espianti midollo spinale. Noiabitualmente uso espianti midollo spinale per confermare bioattività delle proteine e proteine-impregnati perline, e per verificare le specie reattività crociata con i tessuti pulcino, alle condizioni stessa cultura espianti SAG. Questi test in vitro sono utili per lo screening rapido per le molecole che esercitano trofico (sopravvivenza) o tropico (direzionale) effetti sui neuroni SAG, soprattutto prima di effettuare studi in vivo. Inoltre, questo metodo permette la sperimentazione di singole molecole sotto siero senza condizioni, con alta sopravvivenza dei neuroni 8.
Protocol
Ricette
Chick Ringers
| 7,2 g | NaCl |
| 0,23 g | CaCl 2 + 2H 2 O |
| 0,37 g | KCl |
| 0,115 g | Na 2 HPO 4 |
| 900 ml | Acqua (cultura grado Tissue) |
Nota: Regolare il pH a 7,4. Portare il volume finale a 1000 ml con acqua.
PBS 10X
| 40 g | NaCl |
| 1 g | KCl |
| 7 g | Na 2 HPO 4 |
| 1,2 g | KH 2 PO 4 |
| 450 ml | DEPC acqua |
Nota: Regolare il pH a 7,4. Portare finalevolume di 500 ml con acqua. Concentrazione di lavoro (1X) è fatto diluendo 1 magazzino 10X parte con 9 parti di tessuto-cultura dell'acqua grado, come quella ottenuta con un sistema Millipore irraggiamento UV per generare acqua con 18 MΩ-cm di conducibilità.
SAG medio espianto tenendo
- DMEM/F12 con L-glutammina, 10 mM Hepes
- 10% di insulina, Trasferimento, Selenio (ITS +1)
- 1% pen-streptococco
Espianto terreno di coltura
- SAG medio espianto tenendo
- 10 ng / ml neurotrofina-3 (NT-3)
- 10 ng / ml di fattore neurotrofico ciliare (CNTF)
Dissezione del midollo spinale e medie tenendo
- L-15
- 10% di siero fetale bovino
- 1% pen-streptococco
Uova incubare a 37-38 ° C. Sterilizzare strumenti di dissezione e piatto Sylgard dissezione nel 70% di etanolo. Dissecting piatti e strumenti possono anche essere sterilizzati ai raggi UV durante la notte.
- Perle Mettere in una microtubo con 1 ml di PBS sterile, mescolare e attendere che le perline di depositarsi sul fondo della provetta.
- Lavare le perle più volte rimuovendo il surnatante dopo le perline sono stabiliti e risospendere in PBS.
- Incubare le perline in proteine purificate (diluito in PBS) o solo PBS (controllo) per 1 ora a temperatura ambiente.
- Sciacquare le perline in PBS e conservare in un 24-pozzetti con 1 ml di PBS fino al momento in collagene.
2. Ganglio dissezione Statoacoustic
- Sulla E4 rimuovere l'embrione da l'uovo e mettetelo in un piatto con la soluzione di Ringer pulcino per rimuovere membrane embrionali.
- Posto l'embrione in una Sylgard © allineati capsula di Petri riempite con HBSS freddo e la posizione l'embrione su un lato con la vescicola otica rivolto verso l'alto. Perno l'embrione al piatto con perni dissezione.
- Utilizzando due pin dissezione, fare un taglio orizzontale attraverso la pelle immediatamente ventrale alsacchetti canale, circa dove si incontra il dotto cocleare. Fare un taglio verticale anteriore e posteriore per il SAG. Usare pinze o una spilla dissezione per sollevare e rimuovere il lembo di pelle delimitato dai tre tagli.
Nota: Il SAG è situato ai margini del anteroventral otocyst, circa a metà strada tra la sacca dorsale, che è facilmente visibile con l'illuminazione di base chiaro, e il dotto cocleare ventrale che proietta ventromedially ed è oscurato dagli archi della faringe. Il dotto cocleare allunga così la sua dimensione dorsoventrale aumenterà progressivamente su E4 tra Hamburger-Hamilton fasi 23-25 settembre.
- Tirare la otocyst in direzione posteriore per separarlo dalla SAG. Spostare il tessuto che circonda la SAG con perni dissezione e rimuovere con attenzione il SAG dall'embrione utilizzando # 55 pinze. Rimuovere grossi pezzi di tessuto mesenchimale e fasci nervosi che sporge dalla SAG.
- Usando una bocca larga punta della pipetta, trasferire l'espianto ad un24-pozzetti con 0,5 ml di espianto SAG tenendo media. Tenere espianti su ghiaccio oa temperatura ambiente per un massimo di 4 ore.
3. Dissezione del midollo spinale
- Rimuovere la E6 dell'embrione dall'uovo e mettetelo in un piatto contenente la soluzione di Ringer pulcino. Togliere la testa e le membrane embrionali.
- Mettere il corpo in un Sylgard © piatto contenente la dissezione a freddo medio dissezione del midollo spinale. Posizione e il pin del "giù ventrale" embrione e caudale di fronte al sperimentatore. Luogo pin dissezione attraverso ogni arto e fino alla fine anteriore.
- Con pinze e / o dissezione pin, rimuovere con attenzione la pelle e tessuto, muovendosi in una direzione ventrale, fino a quando la superficie dorsale del midollo spinale è visibile.
- Tagliare la linea mediana dorsale del midollo spinale con un perno dissezione, in un posteriore in direzione anteriore, lungo l'intera lunghezza del midollo spinale. Questo crea un "libro aperto", come i lati sinistro e destro del midollo spinale separati.
- Togliere il midollo spinale dal corpo tenendo il più a fine caudale del midollo spinale con una pinza e di sollevamento in alto e lontano dal sperimentatore. Rimuovere DRG rimanente e meningi.
- Tenere un capo del midollo spinale con una pinza (o pin al piatto) e Vännäs usare le forbici per tagliare lungo la linea mediana ventrale, a bisecare il midollo spinale.
- Tenere un capo del espianto con una pinza per immobilizzare il tessuto e usare le forbici per tagliare Vännäs espianti piccolo (100-500 um di lunghezza) per tutta la lunghezza del tessuto. La lastra di fondo può essere riconosciuto come un chiaro ispessimento del tessuto lungo un bordo espianto.
- Utilizzare una bocca larga punta della pipetta per trasferire espianti di un piatto ben 24 con 0,5 ml di mezzo di dissezione a freddo. Tenere espianti su ghiaccio per mantenere la vitalità dei tessuti, fo fino a 4 ore.
4. Espianto cultura con le proteine purificate di verificare le risposte dei neuriti
- Preparare un 1,5 mg / ml soluzione di collagene in una provetta da 15 ml conica, sul ghiaccio, secondo le istruzioni del produttore.
- Verificare la soluzione di collagene ha un pH di 7-7,4 carta pH utilizzando l'indicatore. Regolare il pH con l'aggiunta di NaOH in 1 volumi microlitri.
- Trasferimento espianti a un 24-pozzetti utilizzando una pipetta punta larga bocca e aspirare il liquido in eccesso. Espianti multiple possono essere coltivate in un pozzo, ma devono essere collocati ad almeno 500 micron di distanza l'uno dall'altro.
- Aggiungere 0,5 ml di collagene per il pozzetto contenente l'espianto. Posizionare l'espianto sulla superficie inferiore del pozzo. Assicurarsi di impostare ogni cultura completamente prima di procedere con il pozzo successivo perché il collagene comincia a polimerizzare a temperatura ambiente.
- Posizionare la piastra di coltura in A ° C più calda scivolo per 30-45 minuti per polimerizzare il collagene 37. Quando il collagene ha polimerasirizzato la renderanno simile ad un gel.
- Aggiungere 0,5 ml di caldo terreno di coltura espianto integrato sia con proteine purificate (diluito in PBS) o PBS (Control) e incubare a 37 ° C, 5% di CO 2. Effetti sulla crescita dei neuriti dovrebbe essere visibile da 24 ore.
NOTA: Abbiamo utilizzato lo stesso protocollo per espianti SAG cultura fino a 42 ore.
5. Espianto co-coltura con le proteine rivestite di perline prova escrescenza direzionale dei neuriti
- Inizia con passi cultura espianto 4,1-4,4.
- Utilizzando una pipetta, trasferire 1-5 perle da PBS al pozzo contenente la soluzione di collagene ed espianto.
- Utilizzare pinze per posizionare perline 50-500 micron dal bordo l'espianto.
- Posizionare la piastra su A ° C più calda scivolo per 30-45 minuti per polimerizzare il collagene 37. Il tessuto o perla può diventare sfollati come il collagene polimerizza. Controllare le culture e riposizionare il tessuto e perline durante i primi 5 min.
- Aggiungere 0,5 ml SAG media per ogni pozzetto e incubare per 24 ore.
6. Visualizzazione di crescita dei neuriti di immunoistochimica
- Sciacquare le culture in PBS e fissare per 1 ora a temperatura ambiente in 4% paraformaldeide in PBS.
- Rilasciare il gel dalle pareti dei pozzi tracciando intorno al bordo del gel con la punta arrotondata di una spatola in teflon micro. Eseguire la immunostain con il gel nei pozzetti. Sciacquare più volte in PBS.
- Incubare in 0,5 ml di soluzione di bloccaggio (10% di siero bovino, 0,1% Triton X-100, sodio azide allo 0,1% in PBS) notte a 4 ° C.
- Incubare in 0,5 ml di anticorpo primario (anti-β-tubulina anticorpo diluito 1:500 in blocco soluzione) una notte a 4 ° C.
- Sciacquare più volte in PBS. Incubare in 0,5 ml di anticorpo secondario (Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG 2b diluito 1:500) notte a 4 ° C. Da questo passo in avanti, tenere le piastre al buio o avvolgerlo in un foglio, a causa della sensibilità alla luce dianticorpi secondari.
- Sciacquare più volte in PBS e conservare a 4 ° C in PBS per un massimo di una settimana.
7. Rappresentante Risultati
Figura 1. Risultati rappresentativi dei neuriti con gli effetti di purificazione e di NT-3 NT-3-rivestito perline su E4 espianti SAG pulcino. SAG corpi cellulari dei neuroni e neuriti erano immunostained con β-tubulina e ripreso con un obiettivo 10x su un microscopio confocale. Dopo 24 ore in vitro, gli espianti SAG visualizzata crescita dei neuriti maggiore in presenza di 100 ng / ml umano purificato NT-3 aggiunti al mezzo di coltura cellulare (1B), rispetto ai controlli (1A). SAG neuroni sono stati co-coltura con perline impregnato IN100 ng / ml, NT-3 per dimostrare che una sorgente puntiforme di NT-3 può localmente promuovere crescita dei neuriti. Espianti visualizzati più lunga e più densa dei neuriti escrescenza sul lato dellaespianto di fronte al tallone rispetto al lato opposto (1D) e rispetto al controllo culture con perline imbevute di PBS (1C). Barra di scala = 200 micron.
Figura 2. Risultati rappresentativi dei neuriti con gli effetti di purificazione e di Wnt5a Wnt5a perle rivestite in E6 pulcino midollo spinale. Espianti di midollo spinale sono state immunostained con β-tubulina e ripreso con un microscopio confocale. Dopo 24 ore di crescita in presenza di Wnt5a purificato del mouse (400ng/ml), crescita dei neuriti da espianti pulcino midollo spinale è stato aumentato (2B), rispetto ai controlli colta senza Wnt5a (2A). Perline imbevuto di 500 ng / ml Wnt5a, posto 300-500 micron dal bordo di espianti midollo spinale, anche promosso crescita dei neuriti (2D) rispetto al controllo culture (2C). Simili co-coltura risultati sono stati precedentemente pubblicato con Wnt5a cellule che esprimono 8. Barra di scala = 200micron.
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Discussion
Vi presentiamo un metodo per sezionare e cultura SAG E4 ed E6 espianti midollo spinale, da ragazza, sotto siero senza condizioni. Questa procedura è attualmente utilizzato nel nostro laboratorio per studiare gli effetti dei vari ligandi secreto SAG sulla sopravvivenza dei neuroni e crescita dei neuriti. Nuovi aspetti di questo protocollo includono l'uso di un siero privo di espianti di sistema per la coltura e l'uso di perline imbevute di fattori di crescita per studiare gli effetti sulla escrescenza SAG neuriti. Un metodo simile al nostro cordone è stato descritto per il midollo spinale pulcino 10. Tradizionalmente, le perle sono state utilizzate in studi con i fattori classici guida degli assoni e morfogeni. Qui, abbiamo dimostrato che il test tallone può essere utilizzato anche per studiare gli effetti delle neurotrofine (o di altri fattori di crescita) su crescita dei neuriti (Fig. 1).
Ci sono passaggi critici nella procedura che potrebbe essere necessario modificare o ottimizzate per diverse applicazioni. Questi passaggi sono variabili importanti per trouble-riprese gli esperimenti che sembrano non avere successo. In primo luogo, neurotrofina-3 (NT-3), il fattore neurotrofico ciliare (CNTF) e ITS (insulina, transferrina, selenio) sono stati aggiunti al mezzo di coltura per promuovere la sopravvivenza dei neuroni SAG e migliorare la crescita dei neuriti 6,8. Questi fattori di crescita sono inclusi negli esperimenti del midollo spinale, al fine di testare l'attività biologica delle molecole nelle condizioni del test stesso che il SAG espianti sono stati testati. Tuttavia, altri fattori di crescita può essere più appropriato per questi e altri tipi di tessuto. In secondo luogo, di 1,5 mg / ml concentrazione di collagene è stata scelta dopo la prova di una serie di concentrazioni di collagene (0,5, 1,0, 1,5 e 2 mg / ml) in quanto ha prodotto la crescita dei neuriti più robusto dal SAG pollo E4 dopo 24h. Altre fonti di neuroni potrebbe visualizzare un ottimale diverso di collagene. Infine, le concentrazioni di proteine, il numero di perline, e la distanza tra la espianti e perline dovrebbe essere ottimizzata per ogni applicazione. Alcuni di crescita fattoors, come morfogeni, sono espressi in gradienti ed esercitare concentrazione-dipendente effetti sulla crescita degli assoni durante lo sviluppo 11. Quindi, una gamma di concentrazioni devono essere sempre testati con saggi di crescita dei neuriti. Si deve prestare attenzione per evitare la tossicità: abbiamo osservato livelli elevati di morte cellulare con alte concentrazioni di alcune proteine (ad esempio, Sonic hedgehog).
Questo metodo può essere adattato per le applicazioni aggiuntive, tra cui altri tempi, tipi di tessuto, co-coltura metodi e immunostaining aggiuntive (ad esempio, saggi di sopravvivenza delle cellule). Abbiamo colto con successo E3-E5 SAG, E6 retina, e E7 espianti bulbo olfattivo, dal pulcino, utilizzando le stesse condizioni di coltura. Quando escrescenza è robusto in campioni di controllo, questo metodo può anche rivelare le risposte ripugnante a fattori secreti. Metodi simili sono stati usati per testare gli effetti di morfogeni sui neuroni dei mammiferi 12,13, e stiamo attualmente studiando gli effetti di BMP, FGF, e Shh su escrescenza SAG neuriti. Inoltre, poiché il gel collagene sono polimerizzati in un 24-pozzetti, sono abbastanza grandi per la successiva inclusione e sezionamento con un criostato. Noi di routine eseguire saggi TUNEL su criosezioni di culture gel di collagene, che ci permette di correlare il livello di sopravvivenza delle cellule con la quantità di crescita dei neuriti dallo stesso campione 8.
Ci sono limitazioni all'uso del test collagene gel nel modo in cui li abbiamo presentato qui. Per esempio, le risposte osservate nel volutamente semplificato in un ambiente in vitro non può riflettere le risposte al fattore stesso qualora si presenti in più complesso nella situazione in vivo. Inoltre, non possiamo distinguere periferico di processi centrali e non possono distinguere uditivo da neuriti vestibolari. Pertanto, l'eterogeneità nella capacità di risposta tra queste popolazioni potrebbe produrre escrescenza irregolare o non uniforme o, se la popolazione risponde è una piccola frazione deltotale, il ganglio può essere segnato come mostrano alcun effetto. Infine, abbiamo presentato un metodo che può essere utilizzato per la cultura espianti SAG E4 sotto siero senza condizioni con la sopravvivenza dei neuroni significativo, con una varietà di applicazioni da studio sopravvivenza cellulare alla guida degli assoni. Nel complesso, questo sistema è vantaggioso perché permette di monitorare gli effetti dovuti all'aggiunta di fattori purificati da soli o in combinazioni senza le variabili confondenti di altri fattori secreti e le indicazioni di guida degli assoni che possono essere presenti in un ambiente nel vivo.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health di Grant RO1DC002756 e la Purdue Research Foundation. Ringraziamo Wu Doris e Wiese Chang per la consulenza con esperimenti e McPhail Rodney aiuto con figure.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection microscope | We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination | ||
| Slide warmer | C.S. E. | Collagen polymerization | |
| Chicken egg incubator | |||
| 37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator | |||
| Sylgard© coated petri dish | |||
| 24-well cell culture plate | Corning | 3526 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Stainless steel dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Embryo pinning, fine dissection |
| Moria perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Embryo harvest/transfer |
| 200 μl wide mouth pipet tips | Dot Scientific, Inc. | 118-96R | Explant transfer |
| E4 and E6 chicken eggs | |||
| Chick Ringer’s solution | Embryo harvest | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | H8264 | SAG dissection |
| L15 medium | Sigma-Aldrich | L5520 | Spinal cord dissection medium |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11150 | Spinal cord dissection medium |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments, Inc. | 501778 | Spinal cord dissection |
| Rat-tail collagen Type I | BD Biosciences | 354249 | Explant culture |
| 10X PBS (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| 1N NaOH (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| Distilled water (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| pH indicator papers (6.0-8.1) | Whatman, GE Healthcare | 2629-990 | To check collagen pH |
| 15 ml conical tubes | Dot Scientific, Inc. | 818-PG | |
| 500 μl wide mouth pipet tips | Dot Scientific, Inc. | 119-R100 | To pipet collagen |
| DMEM/F12 medium | Sigma-Aldrich | D8437 | Explant culture medium |
| ITS+1 | Sigma-Aldrich | I2521 | Medium supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Medium supplement |
| CNTF (rat) | Sigma-Aldrich | C3835 | Medium supplement |
| NT-3 (human) | Sigma-Aldrich | N1905 | Medium supplement |
| Purified mouse Wnt5a | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Affi-gel Blue gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation |
| PBS | Rinses | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Blocking solution |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Blocking solution |
| Calf serum | Invitrogen | 16170-078 | Blocking solution |
| Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody | Sigma-Aldrich | T8535 | Labels cell bodies and neurites |
| Alexa fluor 488 goat anti -–mouse IgG2b antibody | Invitrogen | A21141 | Detects β Tubulin antibody |
| Teflon micro spatula | VWR international | 57949-033 | Release collagen gels from well |
References
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).
- Fritzsch, B. Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia. Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).
- Gu, C. Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development. Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).
- Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea. J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).
- Avila, M. A. Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons. Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).
- Bianchi, L. M., Cohan, C. S. Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor. Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).
- Juurlink, B. ernhardH. J. Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture. Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).
- Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons. Hear. Res. , (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).
- Bourikas, D. Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord. Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).
- Augsburger, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).
- Lyuksyutova, A. I. Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling. Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).
