神経突起伸長アッセイのためのコラーゲンゲルのチックStatoacousticガングリオンと脊髄の外植片の解剖と文化

Summary

我々はニワトリE4 statoacoustic神経節とE6脊髄の外植片を細かく分析し、文化に方法を示しています。外植片は、24時間3Dコラーゲンゲル中での無血清条件下で培養される。神経突起の応答性は、成長因子添加培地および蛋白質でコーティングされたビーズを使用してテストされています。

Abstract

鶏内耳の感覚器官はstatoacoustic神経節（SAG）ニューロンの末梢プロセスによって神経支配されています。感覚器官の神経支配は成長している軸索および/ ​​またはそれらの感覚器官のターゲット内での軌道に沿って位置する軸索ガイダンスの手がかり¹と生存因子²の組み合わせによって異なります。例えば、古典的な軸索 ​​ガイダンスシグナル伝達経路、セマフォリン-ニューロピリン、との機能的な干渉が耳軸索の³の経路変更を生成。また、ニューロトロフィン-3（NT - 3）と脳由来神経栄養因子（BDNF）を含む、内耳の感覚目標で表現されるいくつかの増殖因子は、、再びSAGの軸索⁴の経路変更につながる、トランスジェニック動物で操作されている。これらの同じ分子は 、in vitro ^5,6 でひよこのSAGの神経細胞の生存と神経突起伸長の両方を促進する。

ここで、我々は現在、Uなのin vitroの方法を説明し、実証既知のようなWntsなどのモルフォゲンだけでなく、SAGの神経突起伸長と神経細胞の生存を促進するための重要な成長因子を含む可溶性タンパク質、にひよこのSAGの神経突起の応答性をテストするために歌う。このモデルシステムを使用して、我々は、分泌配位子は、SAGのニューロンの生存と神経突起伸長に及ぼすことができる効果について結論を出すと思っています。

SAGの外植片は、胎生4（E4）で解剖し、24時間無血清条件下での三次元コラーゲンゲル内で培養されています。最初に、神経突起の応答性は、タンパク質含有培地で培養外植片によってテストされます。その後、分泌される配位子の点源が神経突起伸長に対する指向性の影響を持つことができるかどうか尋ねるために、外植片は、タンパク質でコーティングされたビーズと共培養し、局所的に伸長を促進または抑制するためにビーズの能力についてアッセイされています。我々はまた、E6脊髄の外植片の解剖のデモ（プロトコル^7を変更）し、文化が含まれています。我々は日常的にタンパク質とタンパク質に浸したビーズの生物活性を確認するために、脊髄の外植片を使用し、SAGの外植片と同一の培養条件下で、ニワトリ組織で種の交差反応性を確認する。 in vitroアッセイこれらは、特にin vivoでの研究を実行する前に、迅速にSAGの神経細胞に栄養（生存）または熱帯（方向性）効果を発揮する分子をスクリーニングするのに便利です。また、この方法は高いニューロンの生存⁸で、無血清条件下での個々の分子のテストが可能。

Protocol

レシピ

チックリンガー

7.2グラム	NaClを
0.23グラム	のCaCl 2 + 2H 2 O
0.37グラム	塩化カリウム
0.115グラム	のNa 2 HPO 4
900ミリリットル	水（組織培養グレード）

注意：7.4にpHを調整する。水で1000mlに最終的なボリュームをもたらす。

10 × PBS

40グラム	NaClを
1グラム	塩化カリウム
7グラム	のNa 2 HPO 4
1.2グラム	KH 2 PO 4
450ミリリットル	DEPC水

注意：7.4にpHを調整する。最終的にもたらす水500 mlにボリューム。ワーキング濃度（1X）は、このような18MΩ- cmの導電性と水を生成するためにミリポアのUV照射システムで得られるような組織培養グレードの水、9部で1部10X株式を希釈することによって行われます。

外植片保持培地のサグ

• L -グルタミン、10mMのHEPESをDMEM/F12
• 10％のインスリン、転送、セレン（ITS +1）
• 1パーセントペン連鎖球菌

移植片培養の培地

• 外植片保持培地のサグ
• 10 ng / mlのニューロトロフィン-3（NT - 3）
• 10 ng / mlの毛様体神経栄養因子（CNTF）

脊髄解剖と保持培地

• L - 15
• 10％ウシ胎児血清
• 1パーセントペン連鎖球菌

37から38で卵をインキュベート℃を解剖のツールと​​70％エタノールでSylgard解剖皿を滅菌する。料理やツールを解剖してもUVは一晩滅菌することができる。

1. 場所の1ミリリットル滅菌PBSでマイクロチューブ中のビーズ、ミックス、そしてチューブの底に沈降するビーズを待ちます。
2. ビーズが定住し、PBSに再懸濁された後に上清を除去してビーズを数回洗浄する。
3. 室温で1時間タンパク質を精製ビーズ（PBSで希釈）またはPBSのみ（コントロール）をインキュベートする。
4. コラーゲンに供されるまで1ミリリットルPBSで24ウェルプレートにPBSとストア内のビーズを洗い流す。

2。 Statoacoustic神経節郭清術

1. E4で卵から胚を削除し、胚膜を除去するためにヒヨコリンゲル溶液で皿に入れてください。
2. 冷HBSSと上向きに耳胞との側に位置胚をで満たされたSylgard ©並ぶペトリ皿の中で胚を置きます。解剖のピンを使用して皿に胚を固定。
3. への2つの解剖のピンを使用して、皮膚を​​介して水平方向のカットを加えた直後腹それは蝸牛管を満たす約運河の袋、。 SAGの前部と後部垂直カットを行います。 threeカットによって接される皮膚のフラップを持ち上げて取り外す作業にピンセットや解剖ピンを使用してください。

   注：SAGは、明視野、ベース照明とすぐに表示されている背袋、そしてventromedially投射と咽頭のアーチによって隠されて腹側蝸牛管とのほぼ中間、耳胞の前腹側縁に位置している。蝸牛管伸長し、その背腹寸法が徐々にハンバーガー - ハミルトンのステージ23から25 9の間にE4に増加します。

4. SAGと区別するために後方に耳胞を引き出します。解剖ピンとSAGを周囲の組織を置換し、慎重に第55ピンセットを用いて胚からSAGを削除します。 SAGからの間葉組織と突出神経束の大きなチャンクを削除します。
5. 広口ピペットチップを使用して、ために外植片を移す24ウェル培地を保持している0.5 mlのSAGの外植片とプレート。最大4時間まで氷上または室温で植してください。

3。脊髄の解剖

1. 卵からE6胚を取り出して、ヒヨコリンゲル液を含む皿に入れてください。頭部および胚膜を取り外します。
2. Sylgardの身体©冷たい脊髄の解剖の培地を含む解剖皿を置きます。位置と実験者が直面している胚"腹ダウン"と尾をピン。各肢を通じて、前端を通して解剖ピンを置きます。
3. ピン鉗子および/または解剖を使用して、慎重に脊髄の背側表面が見えるまで、腹側方向に移動し、皮膚や組織を取り除く。
4. 脊髄の全長に沿って、前方方向の後方に、解剖ピンと脊髄の背側正中線をカット。これは、別々の脊髄の左右の側面として"オープンブック"を作成します。
5. ピンセットで脊髄の尾最端を保持し、実験者から持ち上げ、持ち上げて本体から脊髄を削除します。残りのDRGと髄膜を取り外します。
6. 鉗子（または皿にそれを固定）と脊髄の一端を保持し、脊髄を二分する、腹側正中線に沿ってカットするVannasのはさみを使用してください。
7. 組織を固定化し、組織の長さに沿って小さな外植片（100〜500ええと長さで）をカットするVannasのはさみを使用してピンセットで植の一端を保持する。フロアプレート一つ植エッジに沿って組織の明確な肥厚として認識することができます。
8. 0.5ミリリットル冷清培地で24ウェルプレートに植片を転送するために広口ピペットチップを使用してください。 fは、組織の生存能力を維持するために氷上で外植片を保持するまたは、最大4時間まで。

4。神経突起の応答性をテストするために精製されたタンパク質と文化を外植片

1. 製造元の指示に従って、氷上で、15 mlコニカルチューブに1.5 mg / mlのコラーゲン溶液を調製します。
2. コラーゲン溶液は、pH指示薬の紙を使用して、7から7.4のpHを有することを確認します。 1μlのボリュームにNaOHを加えてpHを調整します。
3. 広口ピペットチップと余分な液を吸引を用いて24ウェルプレートに植片を移す。複数の外植片はよくかで培養することができますが、互いに間隔を少なくとも500μmを配置する必要があります。
4. 外植片を含むウェルにコラーゲンの0.5 mlを追加します。ウェルの底面上に外植片を置きます。コラーゲンは、室温で重合を開始するので、次もに進む前に、完全にそれぞれの文化を設定してください。
5. コラーゲンを重合するために30-45分のための暖かく、37℃のスライド上で培養プレートを置きます。コラーゲンはpolymeを持っている場合それはゲルに似ているでしょうrized。
6. 精製タンパク質（PBSで希釈）またはPBS（コントロール）のいずれかを添加した0.5ミリリットル暖かい移植片培養培地を追加し、37℃、5％CO _2。神経突起伸長への影響は、24時間で表示する必要があります。

   注：私達は42時間に文化のSAGの外植片に同じプロトコルを使用している。

5。外植体タンパク質でコーティングされたビーズと共培養方向の神経突起伸長をテストする

1. 外植片培養工程4.1から4.4で始まります。
2. ピペットを用いて、PBSからもコラーゲン溶液と外植片を含む1〜5ビーズを移す。
3. 外植片の端からビーズ50から500μmの位置にピンセットを使用しています。
4. コラーゲンを重合するために30-45分のための暖かく、37℃のスライド上にプレートを置きます。組織やビーズは、コラーゲンが重合として避難になることがあります。最初の5分間の組織やビーズの文化と再位置を確認してください。
5. 0.5メートルを追加l各ウェルにメディアをSAGと24時間インキュベートする。

6。免疫組織化学による神経突起伸長の可視化

1. PBSの文化をリンスし、PBS中4％パラホルムアルデヒド中で室温で1時間固定してください。
2. テフロンマイクロヘラの丸い側でゲルの端の周りにトレースすることにより、井戸の壁からゲルを離します。ウェルのゲルで免疫染色を行います。 PBSで数回すすいでください。
3. 一晩4 0.5ミリリットルブロッキング溶液（10％仔ウシ血清、0.1％トリトンX - 100、PBSに0.1％アジ化ナトリウム）℃でインキュベート
4. 一晩4 0.5ミリリットル一次抗体（ブロッキング溶液で1:500に希釈した抗β-チューブリン抗体）でインキュベート℃を
5. PBSで数回すすいでください。一晩4（1:500に希釈のAlexa Fluor ® 488ヤギの抗マウスIgG _2bの抗体）0.5ミリリットル二 ​​次抗体でインキュベート℃にの光感受性のため、これ以降のステップから、箔に暗いまたはラップでプレートを保持する二次抗体。
6. ℃のPBSで最大1週間までは4でPBSと店で数回すすいでください。

7。代表的な結果

図1。精製NT - 3とE4ひよこのSAGの外植片上でNT - 3でコーティングされたビーズの神経突起促進効果の代表的な結果。 ニューロンの細胞体および神経突起β-チューブリンで免疫染色し、共焦点顕微鏡で10倍目的で撮像されたのサグ。 in vitroで 24時間後、SAGの外植片は、100の存在下でより大きな神経突起伸長を表示ng / mlの精製ヒトNT - 3は、コントロール（1A）と比較して、細胞培養培地（1B）に追加。 SAGのニューロンは、NT - 3の点源が局所的に神経突起伸長を促進できることを実証するIN100 ng / mlのNT - 3を浸したビーズと共培養した。外植片は長く表示され、側面の密度が高い神経突起の伸長反対側（1D）と比較してPBS（1C）に浸したビーズと文化をコントロールと比較してビーズが直面している植。スケールバー= 200μmの。

図2。 E6ひよこ脊髄上で精製したWnt5aやWnt5aコートビーズの神経突起促進効果の代表的な結果。 脊髄の外植片は、β-チューブリンを用いて免疫染色し、共焦点顕微鏡で画像化した。精製マウスWnt5a（400ng/ml）の存在下で成長の24時間後、ニワトリ脊髄の外植片からの神経突起伸長はWnt5a（2A）なしで培養した対照と比較して（2B）に増加した。 500 ng / mlのWnt5aに浸したビーズは、また文化（2C）を制御するために比較して神経突起伸長（2D）を推進し、脊髄の外植片の端から300から500ミクロンを置いた。類似の共培養の結果は、以前はWnt5a発現細胞⁸で発表された。スケールバー= 200μmの。

Discussion

我々は、無血清の条件下で、ひよこから、E4のSAGとE6脊髄の外植片を細かく分析し、文化に方法を提示する。このプロシージャは、現在SAGのニューロンの生存と神経突起伸長に対する様々な分泌配位子の効果を研究する私たちのラボで使用されています。このプロトコルの小説の側面は、培養の外植片とSAGの神経突起伸長への影響を研究する成長因子を染み込ませたビーズの使用のための無血清システムの使用を含む。私たちと同様のビーズ法はひよこ脊髄¹⁰に対して記載されている。伝統的に、ビーズは、古典的な軸索ガイダンス因子とモルフォゲンと研究に使用されている。ここで、我々は、ビーズアッセイはまた、神経突起伸長（図1）上に神経栄養因子（または他の増殖因子）の影響を調査するために使用できることを示している。

異なるアプリケーション用に変更または最適化する必要がある手順の重要なステップがあります。これらの手順はまたtroubのための重要な変数です。失敗したように見えるル - 撮影の実験。最初に、ニューロトロフィン-3（NT - 3）、毛様体神経栄養因子（CNTF）およびITS（インスリン、トランスフェリン、セレン）がSAGのニューロンの生存を促進し、神経突起伸長^6,8を強化するために培地に添加した。これらの成長因子は、SAGの外植片がテストされたことを同じアッセイ条件下で分子の生物活性をテストするために脊髄の実験に含まれています。しかし、他の成長因子は、これらおよび他の組織型のためのより適切かもしれない。第二に、コラーゲン1.5 mg / mlの濃度は、それが24時間後にE4の鶏のSAGから最も堅牢な神経突起伸長を生成するので、コラーゲンの濃度（0.5、1.0、1.5及び2 mg / mlの）の範囲をテストした後に選ばれました。ニューロンの他の情報源は、コラーゲンの異なる最適表示される場合があります。最後に、タンパク質濃度、ビーズの数、および外植片とビーズの間の距離は、アプリケーションごとに最適化する必要があります。いくつかの成長の事実このようなモルフォゲンとしてORSは、、グラデーションで表現し、開発¹¹で成長している軸索上で濃度依存効果を発揮している。したがって、濃度の範囲は、常に神経突起伸長アッセイでテストする必要があります。注意は、毒性を避けるために注意すべきである：我々は、いくつかのタンパク質の高濃度（例えば、ソニックヘッジホッグ）と細胞死の上昇を観察している。

このメソッドは、他の年齢層、組織の種類、共培養の方法、および追加免疫（例えば、細胞生存アッセイ）を含む追加のアプリケーション用に適応させることができます。我々は、同じ培養条件を用いて、ニワトリから、うまく培養E3 - E5のSAG、E6網膜、およびE7嗅球の外植片を持っている。伸長は、コントロールサンプルで堅牢である場合、このメソッドは、分泌因子に反発応答を明らかにすることができます。同様のメソッドは、哺乳類のニューロン^12,13のモルフォゲンの効果をテストするために使用され、そして我々は現在のところBMPが、FGFの、そしてSHの効果を調査しているSAGの神経突起伸長に対するH。また、コラーゲンゲルは24ウェルプレートに重合されているため、彼らはその後の埋め込みとクライオスタットで切片のための十分な大きさです。我々は日常的に私たちは、同じサンプル⁸から神経突起伸長の量と細胞の生存のレベルを相互に関連付けることができるコラーゲンゲル培養、の凍結切片をTUNELアッセイを行います。

我々はそれらをここに提示したような方法でコラーゲンゲルアッセイの使用には制限があります。例えば、意図的にin vitroでの環境では簡略化において観察された応答は、同じ要因への応答を反映していない可能性がある場合生体の状況でより複雑に存在する。同様に、我々は中央のプロセスから周辺機器を区別することはできませんし、前庭神経突起から聴覚を区別することはできません。したがって、これらの集団の間で反応性の不均一性は、応答人口は全体のごく一部である場合、不規則なまたは不均一な伸長をもたらすかができる合計、神経節は何の効果も示さないとして採点されることがあります。最後に、我々は軸索ガイダンスに細胞の生存を学ぶから様々なアプリケーションで、重要なニューロンの生存率と無血清条件下で培養E4のSAGの外植片に使用することができる方法を提示している。それは生体内環境に存在する可能性がある他の分泌因子や軸索ガイダンスの手がかりの交絡変数なしの因子を単独または組み合わせで、精製の ​​添加による影響を監視する1つできるので、全体的に、このシステムが有益です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection microscope			We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination
Slide warmer	C.S. E.		Collagen polymerization
Chicken egg incubator
37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator
Sylgard© coated petri dish
24-well cell culture plate	Corning	3526
#5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-30
#55 Dumont forceps	Fine Science Tools	11295-51
Stainless steel dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10	Embryo pinning, fine dissection
Moria perforated spoon	Fine Science Tools	10370-17	Embryo harvest/transfer
200 μl wide mouth pipet tips	Dot Scientific, Inc.	118-96R	Explant transfer
E4 and E6 chicken eggs
Chick Ringer’s solution			Embryo harvest
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264	SAG dissection
L15 medium	Sigma-Aldrich	L5520	Spinal cord dissection medium
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11150	Spinal cord dissection medium
Vannas Scissors	World Precision Instruments, Inc.	501778	Spinal cord dissection
Rat-tail collagen Type I	BD Biosciences	354249	Explant culture
10X PBS (Sterile)			To neutralize collagen
1N NaOH (Sterile)			To neutralize collagen
Distilled water (Sterile)			To neutralize collagen
pH indicator papers (6.0-8.1)	Whatman, GE Healthcare	2629-990	To check collagen pH
15 ml conical tubes	Dot Scientific, Inc.	818-PG
500 μl wide mouth pipet tips	Dot Scientific, Inc.	119-R100	To pipet collagen
DMEM/F12 medium	Sigma-Aldrich	D8437	Explant culture medium
ITS+1	Sigma-Aldrich	I2521	Medium supplement
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Medium supplement
CNTF (rat)	Sigma-Aldrich	C3835	Medium supplement
NT-3 (human)	Sigma-Aldrich	N1905	Medium supplement
Purified mouse Wnt5a	R&D Systems	645-WN-010
Affi-gel Blue gel beads	Bio-Rad	153-7302
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Fixation
PBS			Rinses
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Blocking solution
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032	Blocking solution
Calf serum	Invitrogen	16170-078	Blocking solution
Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody	Sigma-Aldrich	T8535	Labels cell bodies and neurites
Alexa fluor 488 goat anti -–mouse IgG2b antibody	Invitrogen	A21141	Detects β Tubulin antibody
Teflon micro spatula	VWR international	57949-033	Release collagen gels from well