Summary
Demostramos cómo diseccionar y la cultura de pollo ganglio statoacoustic E4 y E6 explantes de la médula espinal. Los explantes se cultivaron en condiciones libres de suero en geles de colágeno en 3D durante 24 horas. La capacidad de respuesta neuritas se prueba con el factor de crecimiento medio suplementado y con recubrimiento de proteínas cuentas.
Abstract
Los órganos sensoriales del oído interno de pollo son inervados por los procesos periféricos del ganglio statoacoustic (SAG), las neuronas. Inervación sensorial del órgano depende de una combinación de señales de orientación axón 1 y 2 factores de supervivencia situadas a lo largo de la trayectoria de los axones en crecimiento y / o dentro de sus objetivos órgano sensorial. Por ejemplo, la interferencia funcional con una vía axón orientación clásica de señalización, semaforina-neuropilina, genera misrouting de los axones ótica 3. Además, varios factores de crecimiento expresados en los objetivos sensoriales del oído interno, incluyendo la neurotrofina-3 (NT-3) y el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), han sido manipulados en animales transgénicos, lo cual también misrouting de 4 axones SAG. Estas mismas moléculas promueven la supervivencia y crecimiento de las neuritas de neuronas SAG pollo in vitro 5,6.
En este sentido, describir y demostrar el método in vitro que actualmente ucantar para poner a prueba la capacidad de respuesta de neuritas SAG de pollo a las proteínas solubles, como morfógenos conocido como el Wnts, así como los factores de crecimiento que son importantes para promover la extensión de neuritas SAG y la supervivencia de las neuronas. El uso de este sistema de modelo, que esperamos para sacar conclusiones sobre los efectos que los ligandos secretados pueden ejercer sobre la supervivencia de las neuronas SAG y crecimiento de las neuritas.
Explantes SAG se diseccionan en el día embrionario 4 (E4) y cultivadas en geles de colágeno tridimensional bajo condiciones libres de suero durante 24 horas. En primer lugar, la capacidad de respuesta de neuritas es probado por el cultivo de explantes con la proteína-medio suplementado. Luego, para preguntar si las fuentes puntuales de ligandos secretados pueden tener efectos direccionales en neurite, los explantes son co-cultivadas con granos recubiertos de proteínas y ensayados para la capacidad de la cuenta para promover a nivel local o inhibir la extensión. También se incluye una demostración de la disección (protocolo modificado 7) y la cultura de E6 explantes de la médula espinal. Nosotrosutilizan de forma habitual explantes la médula espinal para confirmar la bioactividad de las proteínas y los granos remojados en proteínas, y para verificar las especies de reactividad cruzada con los tejidos de pollo, bajo la mismas condiciones de cultivo como explantes SAG. Estos ensayos in vitro son convenientes para la rápida detección de las moléculas que ejercen trófica (supervivencia) o el trópico (direccional) efectos sobre las neuronas de la SAG, especialmente antes de la realización de estudios in vivo. Además, este método permite el ensayo de las moléculas individuales en condiciones libres de suero, con una alta supervivencia de las neuronas 8.
Protocol
Recetas
Timbres de pollo
| 7,2 g | NaCl |
| 0,23 g | CaCl2 + 2H 2 O |
| 0,37 g | KCl |
| 0,115 g | Na 2 HPO 4 |
| 900 ml | Agua (grado de cultivo de tejidos) |
Nota: Ajustar el pH a 7.4. Alcanzar un volumen final de 1000 ml con agua.
PBS 10 veces
| 40 g | NaCl |
| 1 g | KCl |
| 7 g | Na 2 HPO 4 |
| 1,2 g | KH 2 PO 4 |
| 450 ml | DEPC agua |
Nota: Ajustar el pH a 7.4. Traiga finalesvolumen a 500 ml con agua. Concentración de trabajo (1X) se hace mediante la dilución de un stock de piezas 10 veces en 9 partes de agua de grado de cultivo de tejidos, como la obtenida con un sistema de irradiación UV Millipore para generar agua con 18 mW cm de conductividad.
SAG medio de la celebración de explante
- DMEM/F12 con L-glutamina, Hepes 10 mM
- 10% de la insulina, la transferencia, el selenio (ITS 1)
- 1% de la pluma de estreptococos
Explante medio de cultivo
- SAG medio de la celebración de explante
- 10 ng / ml neurotrofina 3 (NT-3)
- 10 ng / ml de factor neurotrófico ciliar (CNTF)
Disección de la médula espinal y el medio de mantenimiento
- L-15
- 10% de suero fetal bovino
- 1% de la pluma de estreptococos
Huevos se incuban a 37-38 ° C. Esterilizar las herramientas de disección y un plato Sylgard disección en el 70% de etanol. La disección de los platos y las herramientas también pueden ser esterilizados UV durante la noche.
- Cuentas a cabo en un microtubo con 1 ml de PBS estéril, mezclar y esperar a que las cuentas se deposite en el fondo del tubo.
- Lave las cuentas varias veces, eliminando el sobrenadante después de las cuentas se han establecido y se resuspenden en PBS.
- Incubar las cuentas de la proteína purificada (diluida en PBS) o PBS solo (control) durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Aclarar las cuentas en PBS y guardar en una placa de 24 pocillos con 1 ml de PBS hasta que se coloque en el colágeno.
2. La disección ganglionar Statoacoustic
- En E4 extraer el embrión del huevo y colocarlo en un plato de pollo con una solución de Ringer para eliminar las membranas embrionarias.
- Lugar al embrión en un plato de petri Sylgard © alineados llenos de HBSS frío y la posición del embrión en su lado de la vesícula ótica hacia arriba. Pin del embrión al plato con alfileres de disección.
- El uso de dos pines de disección, hacer un corte horizontal a través de la piel inmediatamente ventral a labolsas de canal, aproximadamente donde se encuentra el conducto coclear. Haga un corte vertical anterior y posterior a la SAG. El uso de fórceps o un alfiler de disección para levantar y remover la capa de piel bordeado por los tres cortes.
Nota: El SAG se localiza en el borde anteroventral del otocyst, a medio camino entre la bolsa dorsal que es fácilmente visible con iluminación de campo claro de base, y el conducto coclear ventral que se proyecta ventromedially y es oscurecida por los arcos faríngeos. El conducto coclear se alarga por lo que su dimensión dorsoventral irá aumentando progresivamente en la E4 entre Hamilton Hamburguesa etapas de 23 hasta 25 sept.
- Tire de la otocyst en dirección posterior para separarla de la SAG. Desplazar el tejido que rodea el SAG con alfileres de disección y retire con cuidado la SAG desde el embrión utilizando # 55 pinzas. Eliminar grandes porciones de tejido mesenquimal y manojos de nervios que sobresalen de la SAG.
- Con una punta de pipeta de boca ancha, la transferencia de los explantes a un24 pocillos con 0,5 ml de la celebración de explante SAG medio. Mantener los explantes en hielo oa temperatura ambiente por hasta 4 horas.
3. Disección de la médula espinal
- Extraer el embrión E6 del huevo y colocarlo en un plato de pollo que contiene la solución de Ringer. Quitar la cabeza y las membranas embrionarias.
- Colocar el cuerpo en un Sylgard © plato que contiene la disección fría disección de la médula espinal medio. Posición y el pin del embrión "abajo ventral" y caudal hacia el experimentador. Coloque pasadores de disección a través de cada miembro y por el extremo anterior.
- El uso de pinzas y / o la disección de los pernos, retire con cuidado la piel y el tejido, se mueve en dirección ventral, hasta que la superficie dorsal de la médula espinal es visible.
- Cortar la línea media dorsal de la médula espinal con una aguja de disección, en una posterior a la dirección anterior, a lo largo de toda la longitud de la médula espinal. Esto crea un "libro abierto", como los lados izquierdo y derecho de la médula espinal por separado.
- Eliminar la médula espinal del cuerpo por la celebración de la final-la mayoría de caudal de la médula espinal con unas pinzas y el levantamiento de arriba y lejos del experimentador. Quitar DRG restantes y las meninges.
- Sostenga un extremo de la médula espinal con unas pinzas el (o pin a la placa) y el uso de tijeras para cortar a lo largo de Vannas la línea media ventral, a dividir en dos la columna vertebral.
- Sostenga un extremo del explante con una pinza para inmovilizar el tejido y el uso de tijeras para cortar Vannas explantes pequeños (100-500 um de longitud) a lo largo de la longitud del tejido. La placa de piso puede ser reconocido como un engrosamiento del tejido claro lo largo del borde explante uno.
- Utilice una punta de pipeta de boca ancha para la transferencia de los explantes a un plato y 24 con 0,5 ml de medio de la disección en frío. Mantener los explantes en el hielo para mantener la viabilidad del tejido, fo hasta 4 horas.
4. Explante cultura con proteínas purificadas para poner a prueba la capacidad de respuesta de neuritas
- Prepare un 1,5 mg / ml solución de colágeno en un tubo cónico de 15 ml, en el hielo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Verificar la solución de colágeno tiene un pH de 7-7,4 papel con indicador de pH. Ajustar el pH mediante la adición de NaOH en volúmenes de 1 l.
- La transferencia de los explantes a una placa de 24 pocillos con una pipeta de punta de la boca ancha y el exceso de líquido aspirado. Explantes múltiples pueden ser cultivadas en un pozo, pero se debe colocar por lo menos 500 m uno del otro.
- Añadir 0,5 ml de colágeno en el pozo que contiene el explante. La posición del explante en la superficie del fondo del pozo. Asegúrese de ajustar cada cultura antes de proceder con la siguiente y debido a que el colágeno se empiezan a polimerizar a temperatura ambiente.
- Colocar la placa de cultivo de A ° C más caliente de diapositivas durante 30-45 min para polimerizar el colágeno 37. Cuando el colágeno se ha polymerized que se asemejan a un gel.
- Añadir 0,5 ml de medio de cultivo de explantes cálida complementada con proteínas purificadas (diluido en PBS) o PBS (control) y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2. Efectos sobre el crecimiento de las neuritas debe ser visible a las 24 horas.
NOTA: Hemos utilizado el mismo protocolo de explantes SAG cultura hasta 42 horas.
5. Explante co-cultivo con cubierta de proteínas cuentas para poner a prueba neurite direccional
- Comience con pasos explante cultura 4.1-4.4.
- Con una pipeta, transferir 5.1 cuentas de PBS a la fuente que contiene la solución de colágeno y explante.
- Use unas pinzas para colocar cuentas de 50 a 500 micras desde el borde del explante.
- Coloque la placa en A ° C más caliente de diapositivas por 30-45 min para polimerizar el colágeno 37. El tejido o cordón puede llegar a ser desplazados como el colágeno se polimeriza. Compruebe las culturas y volver a colocar el tejido y los granos durante los primeros 5 min.
- Añadir 0,5 ml SAG medios de comunicación a cada pocillo e incubar durante 24 horas.
6. Visualización de crecimiento de las neuritas mediante técnicas de inmunohistoquímica
- Enjuague las culturas en PBS y fijar, por 1 hora a temperatura ambiente en el 4% de paraformaldehído en PBS.
- Liberación de los geles de las paredes de los pozos mediante el trazado de los bordes de los geles con el extremo redondeado de una espátula de teflón micro. Realizar la inmunotinción con los geles en los pozos. Enjuagar varias veces con PBS.
- Incubar en 0,5 ml de solución de bloqueo (10% de suero de ternera, 0,1% Triton X-100, azida de sodio al 0,1% en PBS) durante la noche a 4 ° C.
- Incubar en 0,5 ml de anticuerpo primario (anti-β-tubulina anticuerpo diluido 1:500 en solución de bloqueo) la noche a 4 ° C.
- Enjuagar varias veces con PBS. Incubar en el anticuerpo secundario de 0,5 ml (Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón de anticuerpos IgG 2b diluido 1:500) durante la noche a 4 ° C. A partir de este paso adelante, mantener las placas en la oscuridad o envolver en papel de aluminio, debido a la sensibilidad a la luz desecundaria de anticuerpos.
- Enjuagar varias veces con PBS y se almacena a 4 º C en PBS durante hasta una semana.
7. Resultados representante
Figura 1. Los resultados representativos de los efectos de promoción de neuritas purificada NT-3 y NT-3-revestida de piedras en los explantes E4 SAG pollo. SAG cuerpos neuronales de células y axones se immunostained con β-tubulina y la imagen con un objetivo de 10x en un microscopio confocal. Después de 24 horas in vitro, los explantes SAG mostrado un mayor crecimiento de las neuritas en la presencia de 100 ng / ml humana purificada NT-3 añade al medio de cultivo celular (1B), en comparación con los controles (1A). Neuronas SAG fueron co-cultivadas con granos empapados IN100 ng / ml de NT-3 para demostrar que una fuente puntual de NT-3 a nivel local puede promover crecimiento de las neuritas. Los explantes se muestra más y más densa extensión de neuritas en el lado de laexplante frente al cordón en comparación con el lado opuesto (1D) y en comparación con el control de las culturas con los granos remojados en PBS (1C). Barra de escala = 200 micras.
Figura 2. Los resultados representativos de los efectos de promoción de neuritas purificada Wnt5a y cuentas Wnt5a recubierto en la médula espinal de pollo E6. Explantes de la médula espinal se immunostained con β-tubulina y la imagen con un microscopio confocal. Después de 24 horas de crecimiento en presencia de agua purificada ratón Wnt5a (400ng/ml), crecimiento de las neuritas a partir de explantes de pollo de la médula espinal se incrementó (2B), en comparación con los controles cultivados sin Wnt5a (2A). Bolas empapadas en 500 ng / ml Wnt5a, puesto 300-500 m desde el borde de los explantes de la médula espinal, también se promueve crecimiento de las neuritas (2D) en comparación con el control de las culturas (2C). Similares de co-cultivo resultados fueron publicados previamente con Wnt5a células que expresan 8. Barra de escala = 200micras.
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Discussion
Se presenta un método para analizar la cultura y la SAG E4 y E6 explantes de la médula espinal, de pollo, bajo condiciones libres de suero. Este procedimiento se utiliza actualmente en nuestro laboratorio para estudiar los efectos de diferentes ligandos secretados en la supervivencia de las neuronas SAG y crecimiento de las neuritas. Aspectos novedosos de este protocolo incluye el uso de un sistema libre de suero para los explantes de cultivo y el uso de los granos remojados en factores de crecimiento para estudiar los efectos en consecuencia SAG neuritas. Un método de cuentas similar a la nuestra ha sido descrito por el cordón espinal de pollo 10. Tradicionalmente, las cuentas se han utilizado en estudios con factores clásicos de axón orientación y morfógenos. En este caso, hemos demostrado que el ensayo de cuentas también se puede utilizar para investigar los efectos de las neurotrofinas (u otros factores de crecimiento) en el crecimiento de las neuritas (Fig. 1).
Hay pasos críticos en el procedimiento que puede ser necesario modificar u optimizados para distintas aplicaciones. Estos pasos son también variables importantes para TROUBle-tiro experimentos que parecen tener éxito. En primer lugar, la neurotrofina-3 (NT-3), el factor neurotrófico ciliar (CNTF) y SU (insulina, transferrina, selenio) se añadieron al medio de cultivo para promover la supervivencia neuronal y aumentar la SAG neurite 6,8. Estos factores de crecimiento están incluidos en los experimentos de la médula espinal con el fin de probar la actividad biológica de las moléculas en las condiciones del ensayo mismo que los explantes SAG se pusieron a prueba. Sin embargo, otros factores de crecimiento pueden ser más apropiados para estos y otros tipos de tejidos. En segundo lugar, un 1,5 mg / ml de concentración de colágeno fue elegido después de probar una amplia gama de concentraciones de colágeno (0,5, 1,0, 1,5 y 2 mg / ml), ya que produce el crecimiento de las neuritas más robusta de la SAG pollo E4 después de 24 horas. Otras fuentes de las neuronas puede mostrar un óptimo diferentes de colágeno. Finalmente, las concentraciones de proteínas, el número de cuentas, y la distancia entre los explantes y cuentas también debe ser optimizado para cada aplicación. Un hecho el crecimientoalcaldes, como morfógenos, se expresan en los gradientes y ejercen efectos dependientes de la concentración en los axones en crecimiento durante el desarrollo 11. Por lo tanto, un rango de concentraciones siempre debe ser probado con los ensayos de crecimiento de las neuritas. Se debe tener cuidado para evitar la toxicidad: Se han observado niveles elevados de muerte de las células con altas concentraciones de algunas proteínas (por ejemplo, Sonic hedgehog).
Este método puede ser adaptado para otras aplicaciones, incluyendo otras edades, tipos de tejidos, los métodos de co-cultivo, y la inmunotinción adicionales (por ejemplo, pruebas de supervivencia de las células). Hemos logrado cultivadas E3-E5 SAG, la retina E6, y E7 explantes bulbo olfatorio, de pollo, con la mismas condiciones de cultivo. Cuando consecuencia es sólido en las muestras de control, este método también puede revelar las respuestas de repulsión a los factores secretados. Métodos similares se utilizaron para probar los efectos de los morfógenos en las neuronas de mamíferos 12,13, y actualmente estamos investigando los efectos de las BMP, FGF, y Shh en consecuencia SAG neuritas. Además, dado que los geles de colágeno se polimerizan en una placa de 24 pozos, que son lo suficientemente grandes como para su posterior inclusión y corte con un criostato. De manera rutinaria, realizar ensayos de TUNEL cryosections de culturas gel de colágeno, lo que nos permite correlacionar el nivel de supervivencia de las células con la cantidad de crecimiento de las neuritas de la misma muestra 8.
Existen limitaciones a la utilización de los ensayos de gel de colágeno en la forma en que hemos presentado aquí. Por ejemplo, las respuestas observadas en el simplificado deliberadamente en el entorno in vitro no reflejan las respuestas a un mismo factor cuando se presenta en más compleja la situación in vivo. Además, no podemos distinguir periférica de los procesos centrales y no puede distinguir auditiva de neuritas vestibular. Por lo tanto, la heterogeneidad en la capacidad de respuesta entre estas poblaciones podrían dar fruto irregular o no uniforme o, si la población está respondiendo a una pequeña fracción de latotal, el ganglio se puede calificar como no muestran ningún efecto. Por último, hemos presentado un método que puede utilizar para explantes cultura SAG E4 en condiciones libres de suero con la supervivencia de neuronas importantes, con una variedad de aplicaciones, desde el estudio de la supervivencia celular a la guía de axones. En general, este sistema es beneficioso porque permite controlar los efectos debido a la adición de agua purificada factores por sí solos o en combinaciones, sin las variables de confusión de otros factores secretados y señales axón orientación que pueden estar presentes en el medio ambiente en vivo.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Grant RO1DC002756 y la Fundación de Investigación de Purdue. Damos las gracias a Doris Wu y Chang Wiese para el consejo con los experimentos y McPhail Rodney para ayudar con las cifras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection microscope | We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination | ||
| Slide warmer | C.S. E. | Collagen polymerization | |
| Chicken egg incubator | |||
| 37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator | |||
| Sylgard© coated petri dish | |||
| 24-well cell culture plate | Corning | 3526 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Stainless steel dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Embryo pinning, fine dissection |
| Moria perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Embryo harvest/transfer |
| 200 μl wide mouth pipet tips | Dot Scientific, Inc. | 118-96R | Explant transfer |
| E4 and E6 chicken eggs | |||
| Chick Ringer’s solution | Embryo harvest | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | H8264 | SAG dissection |
| L15 medium | Sigma-Aldrich | L5520 | Spinal cord dissection medium |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11150 | Spinal cord dissection medium |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments, Inc. | 501778 | Spinal cord dissection |
| Rat-tail collagen Type I | BD Biosciences | 354249 | Explant culture |
| 10X PBS (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| 1N NaOH (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| Distilled water (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| pH indicator papers (6.0-8.1) | Whatman, GE Healthcare | 2629-990 | To check collagen pH |
| 15 ml conical tubes | Dot Scientific, Inc. | 818-PG | |
| 500 μl wide mouth pipet tips | Dot Scientific, Inc. | 119-R100 | To pipet collagen |
| DMEM/F12 medium | Sigma-Aldrich | D8437 | Explant culture medium |
| ITS+1 | Sigma-Aldrich | I2521 | Medium supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Medium supplement |
| CNTF (rat) | Sigma-Aldrich | C3835 | Medium supplement |
| NT-3 (human) | Sigma-Aldrich | N1905 | Medium supplement |
| Purified mouse Wnt5a | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Affi-gel Blue gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation |
| PBS | Rinses | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Blocking solution |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Blocking solution |
| Calf serum | Invitrogen | 16170-078 | Blocking solution |
| Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody | Sigma-Aldrich | T8535 | Labels cell bodies and neurites |
| Alexa fluor 488 goat anti -–mouse IgG2b antibody | Invitrogen | A21141 | Detects β Tubulin antibody |
| Teflon micro spatula | VWR international | 57949-033 | Release collagen gels from well |
References
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