Summary
有条件击倒在成年斑马鱼视网膜的目标蛋白质的表达，是一个方法，它涉及到玻璃体内注射反义morpholinos和电穿孔进入视网膜。由此产生的蛋白质是撞倒了好几天，这使得检测蛋白质的作用，在再生或完整的视网膜。
Abstract
许多破坏性的遗传性眼疾造成逐步和不可逆转的失明，因为人类无法再生死亡或患病的视网膜神经细胞。相比之下，成年斑马鱼视网膜拥有强大的能力，自发地再生是在各种不同的视网膜损伤模型，包括视网膜穿刺术，化学消融，集中的高温，和强光治疗1-8失去任何神经类。我们的实验室广泛的特点不断强光处理后玻璃体内注射哇巴因2，5，9的内层视网膜神经元再生光感受器。在所有情况下，居民米勒的神经胶质细胞重新进入细胞周期的产生，这将继续增殖，迁移到适当的视网膜层，在那里他们不足的神经元分化的神经祖细胞。
我们的特点在五个不同阶段的光，DAMA再生GED视网膜特定的细胞反应突出。我们确定了在每个阶段的视网膜再生多个差异表达的基因，通过基因芯片分析 10 。这些基因中的许多人还眼发展的关键。为了测试每个候选基因/蛋白的作用，在视网膜再生的，我们需要制定一个有条件限制，只能在次候选人蛋白的表达，在成人视网膜再生的方法。
啉寡核苷酸被广泛用于研究特定蛋白质的功能丧失，在斑马鱼，爪蟾，鸡，鼠的发展，和人类异种移植肿瘤11-14。这些修改后的寡核苷酸碱基互补的RNA序列，以阻止靶RNA的剪接或翻译。 Morpholinos稳定在细胞中，可以消除或“击倒”为三至五年天12蛋白的表达。
在这里，我们描述了一个有效击倒目标在成年斑马鱼视网膜蛋白的表达方法。这种方法采用里沙明标记的反义，到成年斑马鱼眼玻璃体注射morpholinos。吗啉是利用电极钳，然后到背侧和中央视网膜的所有类型的细胞电穿孔。里沙明提供啉电击负责，并可以可视化评估的视网膜细胞啉的存在。
有条件击倒在视网膜上可以用来研究在再生过程中的不同时间的特定蛋白质的作用。此外，这种方法可用于研究二阶神经元的视觉传导和视觉处理等过程中的特定蛋白质，在未损坏的视网膜中的作用。
Protocol
1。吗啉的准备：
- 所有的吗啉代寡核苷酸应定制设计，并通过GeneTools有序（Philomath，OR）。我们使用的里沙明标签带正电的morpholinos驱动实现负电极的电穿孔morpholinos。我们尝试过，但没有成功，目标带负电荷的荧光标记morpholinos的正极，使用这种技术。 100μL无核酸酶水稀释成300 nmol啉产量3毫米的解决方案。分装成多个石蜡密封离心管吗啉。在室温下避光储存。
- 确定稀释5μL啉（或用来稀释为空白啉的水），在95μL的0.1 N的盐酸吗啉浓度。设置分光光度计波长（λ）为265 nm。计算使用下列公式啉的常数：
常数=分子量特别是你吗啉O X 1000/molar吸光度。 - 你会发现“寡糖属性”表提供每个啉的分子量和摩尔吸光度数据。分析的空白，以验证其基准读数和每个稀释啉读数。其待定常数，稀释倍数乘以每个啉在265 nm的吸光度，以ng /μL的浓度。这个数字除以分子量确定以毫米为单位的浓度。稀释的吗啉，如果必要的话，一个工作浓度。
2。卸下外层角膜层：
- 麻醉6-12个月Tricaine或1.0毫克/毫升，斑马鱼的鱼缸水2 - 苯氧乙醇岁成年斑马鱼。
- 包装在一个斑马鱼蘸纸毛巾，覆盖鳃，但眼睛暴露。包装的鱼被放置在一个立体的放大倍数增加，直到填充眼的直径大约三分之一的视野（图1）。
- 使用杜蒙＃5镊子，抢附近的视神经裂外层角膜。这个组织被染成红色，并标有“业主立案法团”，在图1。有轻微的突起或标有“瘦肉精”的箭头所指示的唇。在整个眼低角度（即10度），拉出外层角膜。随着实践中，这可以完成一项议案。如果镊子滑，重抓组织，并删除之前，再次以低角度拉。一个附加的可引起角膜的眼睛被拔出时，从插座脱落。您可以继续成为steadying另一套镊子脱落的眼睛。
3。角膜切口和吗啉注射：
- 紧随去除外层的角膜，使角膜小切口瞳孔与虹膜（图2）。这是使用蓝宝石手术刀刀片（见材料）。
- 装入一个Hamilt 0.5微升3.0毫米啉解决方案配备了33号可拆卸，钝针（见材料）上的注射器。移液器上下线，以消除气泡。通过切口（图2），小心地插入玻璃体针。不要太远，否则您将穿刺视网膜的针插入或置换镜头。
- 慢慢地注入vitreal空间吗啉的解决方案。根据鱼的年龄，vitreal空间将于〜0.5μL。你应该想象本色切口玻璃体泄漏，因为它是由啉溶液流离失所。直到啉解决方案泄漏的少量注入了切口。你应该清楚地可视化里沙明标签啉眼内。
- 注射后，返回鱼坦克恢复。我们通常只注入左眼，使用右眼作为uninjected对照，但双眼电击是有可能的。
4。电穿孔：
- 以下注入约10条鱼，重新麻醉注射鱼和包裹在纸巾浸湿一块，正好覆盖鳃，但眼睛暴露。鱼转移到培养皿中。乳胶或类似的手套，以避免暴露于麻醉。轻轻地捧着鱼盘底部，填写麻醉的菜（图3，左图）。
- 一个直径3毫米的铂金板电极（见材料）本地化的电脉冲视网膜的约一半。我们通常的目标背视网膜。轻轻向下按正极上的眼睛腹侧一半。删除与外角膜，眼睛很容易旋转，暴露眼球的背部分。
- 尽管仍然按眼腹侧，将附近的负电极（〜1 - 2毫米）暴露的眼睛背一半。小心不要触摸负电极直接到眼睛，这将导致损坏背视网膜。一旦你确定适当的电极之间的距离，使用电极的手柄调节螺丝，保持传播时，电穿孔。这使负极从按下位置时，正极的眼球的最佳距离。
- Electroporate使用一个CUY21方波Electroporator（见材料）的眼睛。电参数应设置为两个连续的50毫秒脉冲，在75 V之间的脉冲1秒暂停。
- 鱼返回油箱。我们通常恒定的光致视网膜变性后立即电击开始我们的协议。
5。代表性的成果：
- 3-5天以下的电（取决于啉的稳定），里沙明标签可在切片视网膜视网膜层（图4）可视化。这作为一个在场的确认标记吗啉。
- 我们可以实现完整的蛋白质击倒以下电击可达3-5天，这取决于啉的疗效（图5）。通常情况下，在光照治疗研究中，我们收获吗啉电穿孔后3或4天的眼睛。这是由弧形的两端（图6，材料）与杜蒙＃5B钳取出整个眼球和组织处理 15免疫组化。任何敲除技术，高效击倒示范必须证明为了验证表型。因此，我们建议您感兴趣的蛋白质获得抗血清。另外，如果和抗体不和吗啉是向任前体mRNA的剪接受体或供区，它会阻止有效的mRNA剪接。在这种情况下，可以使用逆转录PCR扩增在morphant RNA的侧翼序列，并确定阻断正常splic的工作效率ING模式。
- 当视网膜切片从鼻腔背腹轴的时间，蓝框的阴影（图6）代表的是最常见的电击事件本身损坏的视网膜的领域。阴影粉红色的框代表啉引入成视网膜细胞电穿孔的目标区域。
图。图1描绘去除角膜上皮细胞层。左侧面板显示眼球的主要结构特点，包括镜头（L），玻璃体（VIT），视网膜（R），外角膜（OC），内角膜（IC），角膜凸出（ CL）眼睛的方向显示在右下角的第一个面板和标记（一）前，后（P），背（四），腹（五）。红色着色表示被删除，外层的角膜。第二届泛 EL显示如何使用镊子把握角膜前突和低角度（第三个面板）拉整个眼睛外层角膜。右侧的面板显示的第二双钳可用于稳定的眼睛，同时拉动了角膜。
图2：在玻璃体内注射的吗啉所涉及的步骤示意图。小切口是在眼睛的瞳孔与虹膜（左侧面板）。这个差距应该足够大，为33号针头，这是充满啉的解决方案，要插入（中间面板）。慢慢地注入玻璃体（右图）0.5μL解决方案。你应该看到一个vitreal解决方案的小切口玻璃体部分取代与里沙明标签吗啉（右图）。
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图3。一般的电穿孔过程的示意图。麻醉的鱼，这是玻璃体内注入与吗啉，轻轻包裹在湿纸巾（左侧面板）。纸巾应包括鳃，但并不妨碍眼（中间面板）。轻轻按下正极腹侧部的眼睛，让眼睛的背半旋转插座。从眼睛的背侧半负极约1毫米，并开始电击（右图）。
图4比较而玻璃体内注射一个啉里沙明标签（一），和视网膜与里沙明标签的吗啉（二）玻璃体内注射和电穿孔电穿孔的一个视网膜的共聚焦图像。里沙明标签发现，所有的视网膜层和细胞类型。活性氧，棒外段;外核，外核层的INL，内核层;保利协鑫，神经节细胞层。
图5比较PCNA的免疫定位与控制啉（左侧面板），并与抗PCNA啉（右图）前的光诱导感光细胞死亡的电穿孔视网膜电穿孔视网膜共焦图像。暗适应成年白化斑马鱼被放置1，2，或3天的吗啉电击后在不断强烈的光线。控制啉未能压制在光损伤视网膜PCNA表达增加。抗PCNA啉有效撞倒通过不断强光损害三天PCNA蛋白表达。
图6。示意图（左图）为P眼眼球摘除rocessing和cryosectioning，这是沿背腹轴。粉红色的阴影框（右图）显示与使用这种技术的蛋白质击倒的最大金额的视网膜区域。蓝色的阴影框代表，是最常见的电击事件破坏的地区。眼睛的方向标记（一）前，后（P），（四）背，腹（五）。
Discussion
最近，两个芯片分析研究基因表达的变化发生在光受损的视网膜，或手术切除视网膜修补10，16再生。这两项研究显示，展出众多的基因表达显著变化，增加或减少，这可能是针对不同的事件发生在视网膜再生的，如米勒胶质细胞重新进入细胞周期进入，要求，继续增殖和迁移神经祖细胞受损的视网膜层，并到正确的神经细胞类型的神经祖细胞的分化。虽然这两个芯片的数据集的直接比较，揭示候选人在这些细胞的活动可能涉及的基因，这些基因及其编码的蛋白质最终必须进行测试，以确定它们是否是必要的神经再生。在这里，我们描述了一个强大的丧失功能的方法来conditio成年斑马鱼视网膜的利益应受击倒的蛋白质。这项技术已用于研究外和细胞内的蛋白质，以及信号分子，转录因子和DNA 复制 17-19所需的蛋白质。因此，这种方法有很大的帮助我们基本在斑马鱼成人视网膜再生的分子机制的理解。
我们测试了多个电参数（电压，脉冲数，脉冲之间的时间）前取得一个成功的协议。一个以前的报告中使用的电穿孔进入再生斑马鱼尾鳍morpholinos在低电压（15 V） 的 20 10个脉冲。因为成年斑马鱼视网膜是由多个细胞层包围，不容易接触到镊子电极，在鱼翅中所使用的参数是不成功的，在有效地进入成人视网膜电穿孔morpholinos。相反，高电压（100伏）经常水库ulted死亡的鱼。近日，5脉冲80 V的描述electroporate 21小狗新生小鼠视网膜质粒DNA。我们发现，略少激烈2脉冲75 V的morpholinos成功电击到100％经处理后的鱼的生存与成年斑马鱼视网膜。此外，我们发现，去除最外面的（或最外部的）角膜组件，大大提高了电穿孔效率。增加脉冲数，可以消除消除这个组织的需要，但也可能导致更大的组织损伤。广泛的控制的研究表明，这些参数没有造成任何显著的视网膜细胞死亡或改变在感光再生 19中观察到的特定的细胞反应。增益功能的研究是目前无法使用这种技术在体内 ，由于我们无法一贯electroporate所有R大型核糖核酸etinal细胞。然而， 在植体内和斑马鱼视网膜的小鼠视网膜质粒电穿孔进入的成功表明，它仍然是一个在斑马鱼 21， 22的可能性。
这项技术的优势之一是电击出现，有效地引入不同的视网膜细胞类型的吗啉。然而，一个潜在的弱点，电击有效地传递到只有背和视网膜中央区域啉。朝着良好的目标是在所有图层的视网膜结果腹半的第二次电击事件，但往往损害结果。这种空间的限制，可能是由于电极的形状和位置。定制设计的杯形电极，可放在眼部周围的使用可能会改善这一弱点。这啉交付空间的限制使用这种技术，并排除使用检测SUCERG的分析h的，就需要一个全球评估的视网膜。应该指出的是，与任何啉实验，最好是确认你的结果，使用第二个，非重叠啉靶mRNA。在某些情况下，很可能也electroporate两个不同的morpholinos同时击倒了两个不同的蛋白质表达。我们证明撞倒的Pax6a和Pax6b蛋白质的表达，单独和组合 18这一点。
虽然我们展示了使用这种技术，我们的光损伤模型，它可能可以用来研究其他损伤模型2-8再生或用于研究蛋白质的功能完好的视网膜。例如，morpholinos电击可以用来击倒的具体通道或在神经节或无长突细胞的信号转导分子的表达，然后研究这些信号的功能在视觉处理的途径。然而，作为morpholinos只影响新的蛋白质的翻译，必须要等到发生内源性蛋白质周转才可以执行一个试验。根据蛋白的稳定性，范围可以从几个小时到天18。
Disclosures
我们什么都没有披露
Acknowledgments
作者想感谢的关心和维护斑马鱼斑马鱼研究人员Freimann生命科学中心和中心。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
| 3-mm diameter paddle electrodes | Protech International, Inc. | CUY 650-P3 | |
| Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
| 2-Phenoxyethanol | Sigma-Aldrich | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
| Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments, Inc. | 14095 | Any #5 tweezers with work |
| Dumont #5B tweezers with angled tips | World Precision Instruments, Inc. | 500234 | Used to enucleate eye following euthanasia |
| Sapphire blade, double edge lance, 1 mm wide, with Sapphire knife handle | World Precision Instruments, Inc. | Blade: 500314 Handle: 500317 | |
| Hamilton syringe with removable 33 gauge blunt-end needle | Hamilton Co | Syringe: 87930 Needle: 7762-06 | Remove needle that comes with syringe and replace with 33-gauge blunt-end needle |
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