עכבר לשחזור Sciatic עצב קראש והערכה לאחר ההתחדשות של ניתוח הר שלם שריר

Summary

בדו"ח זה אנו מתארים שיטה למחוץ העצב העכבר הנשה. שיטה זו משתמשת מלקחיים עוצר דמום זמינים ובקלות reproducibly מייצרת העצב המלא למחוץ הנשה. בנוסף, אנו מתארים שיטה להכין mounts שרירים שלמים מתאימים לניתוח של התחדשות עצבים אחרי למחוץ גיד הנשה.

Abstract

הדור הבא של מערכת העצבים ההיקפית (PNS) נלמדת באופן נרחב גם על הרלוונטיות שלה למחלות האדם להבין את התגובה משובי חזקים רכוב על ידי נוירונים PNS ובכך אולי שהאירו את הכישלונות של התחדשות מערכת העצבים המרכזית ^1. למעוך גיד הנשה (axonotmesis) הוא אחד המודלים הנפוצים ביותר של פגיעה עצבית היקפית במכרסמים ^2. ריסוק קוטע את כל האקסונים אלא רבדים שוואן התאים הבזליים נשמרים כך התחדשות כי הוא אופטימלי ^3,4. זו מאפשרת לחוקר לבחון דווקא את היכולת של האקסון הגוברת לקיים אינטראקציה עם התא הן שוואן ואת רבדים הבסיס ^4. החולדות היו בדרך כלל את הדגמים המועדפים על בעלי חיים למחוץ העצב ניסיוני. הם זמינים באופן נרחב ועל גיד הנשה lesioned שלהם מספק קירוב סביר של נגעים עצב אנושיים ^5,4. אם כי קטנים יותר מאשר עצב חולדה, עצב העכבר יש תכונות דומות רבות. והכי חשוב אם כי, mousמודלים אלקטרוניים הם בעלי ערך יותר ויותר בגלל הזמינות רחב של קווי מהונדס כעת מאפשרת לנתיחה מפורט של מולקולות בודדות קריטיים עבור התחדשות עצבים ^{6, 7.} חוקרים קודמים השתמשו בשיטות רבות כדי לייצר דלוקה עצב או פציעה כולל מלקחיים זווית פשוטים, מלקחיים, מלקחיים מצוננים עוצר דמום, Clamps כלי הדם, וכן החוקר מלחציים, שנועדו ^{8,9,10,11,12.} החוקרים השתמשו גם שיטות שונות של סימון האתר כולל פגיעה תפר, חלקיקי פחמן חרוזי ניאון ^13,14,1. אנו מתארים את השיטה שלנו להשיג דלוקה מלאה reproducibly גיד הנשה עם סימון מדויק ועקבי של האתר, למעוך בעזרת מלקחיים עוצר דמום דקים פחמן לאחר המדליקה האתר סימון. במסגרת תיאור שלנו הליך גיד הנשה למחוץ כללנו גם שיטה פשוטה יחסית של כל שריר לעלות לאחר מכן אנו משתמשים כדי לכמת התחדשות.

Protocol

1. בעלי חיים נושאים

1.1. טיפול

1. הנהלים כל בעלי החיים יש לבצע באישור בעלי חיים טיפול של מכון המקומית ועדת האתיקה ועל פי שימוש ו ועדת המכונים הלאומיים הנחיות בריאות, עם הצעדים שננקטו כדי למזער את הכאב ואי הנוחות.
2. העכברים שלנו שוכנו תחת בקרת טמפרטורה תנאי אור 12 שעות לאחור מחזור כהה, בעוד הפד לעכבר צ ו libitum מים המודעה.
3. ללימודים של התחדשות מבוגר, עכברים צריך להיות לפחות 6 שבועות בגיל כאשר למחוץ גיד הנשה מתבצע. בגיל זה הוא מעבר למועד שבו גיזום של צמתים neuromuscular polyneural להתקיים.
4. בניסויים אלה, היינו 6-8 בשבוע C57BL בן / 6 עכברים שנרכשו צ'ארלס ריבר. בהשוואת התחדשות לאחר למחוץ גיד הנשה (כלומר: קצב הצמיחה האקסון) זנים העכבר צריך להיות זהה, כמו הבדלים התחדשות axonal כבר לאאד בין זנים טהורים שונים ^15,16. אם מניפולציות גנטיות בעכברים הם לשימוש, פקדי להמלטה המתאימים ביותר.

1.2. כירורגי הכנה

1. חיות הן בהרדמה עמוקה לניתוח באמצעות קוקטייל של קטמין (100 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג) באמצעות הזרקת intraperitoneal. כל חיה מקבלת גם זריקה תת עורית של meloxicam (10 מ"ג / ק"ג) כדי למזער את הכאב שלאחר הניתוח.
2. חלקו האחורי שניהם מגולח בקפידה באמצעות קוצץ כירורגית (Roboz, RC-5903) ו depilation הושלמה עם קרם שיער הסרת נאיר (נמצא בבית המרקחת המקומי).
3. העור הוא נקי באמצעות applicators כותנה סטריליים שקצהו ושיחים בבטאדין כירורגית (פישר סיינטיפיק, 19066452).
4. משחת עיניים (פישר סיינטיפיק, 19082795) על העיניים באמצעות applicators כותנה סטריליים שקצהו.
5. העכבר מונח על צלחת נקייה פלדה אל חלד, במסגרתה הושם homeot מראש מחוממתשמיכה מערכת hermic (הרווארד Apparatus, 507222F). הטמפרטורה בעלי חיים נשמר ב 37 ° C.
6. גפיים כל מוקלטות למטה, עם מטופל למצב הגפיים האחוריות באופן סימטרי, כך מפרק הברך גורם זווית ישרה עם הגוף (תרשים 1, לוח).
7. בתחום כירורגית מכוסה וילון סטרילית. כל המכשירים מעוקרים ידי החיטוי או חם עיקור חרוז (כלי מדעי יפות, 18000-45) ו המנתח לובש מסכה, גלימה, וכפפות סטריליות.

2. לשחזור גיד הנשה Crush

1. אחרי הכנה, חתך חצי עגול על פני קו האמצע (איור 1) הוא עשה בעור. העור הוא גזור בעדינות השרירים הבסיסית, ושילב מעל להישאר מהדרך במהלך ההליך. הוא כל הזמן לחות באמצעות יישומים של 0.1 מ"ל תמיסת מלח סטרילית (Hospira, 0409-4888-20) במהלך ההליך.
2. פתיחת המטוס fascial בין שרירי האגן ואת הראש הקדמי של שריר הזרוע femoriזה חושף את גיד הנשה (איור 1, פאנל). עבור הניתוח, עצב הנשה הנגדי יש לחשוף וגייסה, אך נותר בשלמותו. השרירים gluteal הוא מחדש לעומת ואת איחוי באמצעות משי 6-0 קלוע, ללא תפרים נספגים (Roboz, SUT-1073-1011).
3. עצב הנשה הניסוי נחשף אז באותו אופן, עם retractors במקום להקל להדמיה (תרשים 1, לוח ב '). Retractors הם מעוקרים לפני השימוש.
   הערה: למרות מערכות מפשק זמינים באופן מסחרי, הם בדרך כלל די יקר. הצלחנו ליצור מערכת מפשק מספקת באמצעות ציוד חומרה יקר וסיכות חרקים (ראה סעיף חומרים).
4. עצב הנשה לאחר מכן, שחרר בעדינות רקמות החיבור המקיף באמצעות מספריים iridectomy.
5. שימוש של 5/45 (כלים מדעיים יפות, 11251-35) מלקחיים עדינים, עצב מושם על הלסת התחתונה של סופר עדין מלקחיים עוצר דמום (מדע טוב מדיls, 13020-12). שלושת fascicles מיושרים ברצף, ולא על גבי זה (איור 1, B הבלעה). מלקחיים את עוצר דמום כבר חרוט עם סימן ב 1.5 מ"מ מקצה שלהם. בחלק החיצוני של הירך ממוקם בקו אחד עם סימן זה לפני למעוך. זה מבטיח מאוהבת של רוחב אחיד, כי העצב לא להרחיב מעבר מלתעותיו של מלקחיים עוצר דמום כאשר שיטחה בשל כוח מוחץ. אם העצב חורג עצה מלקחיים העצב רק להימחץ חלקית.
6. למעוך עשוי בניצב העצב על 45 מ"מ מן האצבע השלישית, כפי שהיא נמדדת על חוט השערה, כי הוא אומדן של דרך עצב הנשה. עצב נרמס פעם ב 3 קליקים של מלקחיים עוצר דמום למשך 15 שניות. הטיפול נלקח לא למתוח את העצב. כאשר הם hemostats נפתח מחדש, עצב כולו צריך להיות שקוף באתר מאוהבת.
7. זוג נוסף של מלקחיים עוצר דמום (זהה לראשון) כי כבר לפני טבולאבקת פחם (פישר סיינטיפיק, C272-500) משמש כדי לסמן את האתר דלוק. עצב נרמס במקום למחוץ אותו למשך 15 שניות ב 3 קליקים. לא פחמן סימון צריך להרחיב מעבר הגבול של ההתאהבות הראשונית. הדבר חשוב במיוחד אם סימון מדויק של האתר למחוץ נדרש. לפני השימוש, אבקת פחמן מעוקר על ידי חשיפה לאור UV למשך שעתיים, ולאחר מכן מתבצע באמצעות טכניקה סטרילית.
   1. מראש לטבול את מלקחיים בפחמן אבל ימנע פחמן נרחב באתר כירורגית, את מלקחיים נפתחים בפחמן אבקת וסגר בעדינות (אך לא לוחץ) עצומות, ואת הפחמן על החלק החיצוני של hemostats את הוא ניגב את בעזרת גזה סטרילית . מלקחיים נבדקים תחת הגדלה לפחות פי 3 כדי לוודא ריסוק משטחים מכוסים באופן שווה אבקת פחם. אם יש צורך, הם שוב טבל וניגב.
8. השרירים gluteal מחדש התנגדו ו שנתפרה באופן זהה בצד הנגדי.
9. לבסוף, החתך בעור נסגר באמצעות קליפים רפלקס 9 מ"מ (מכשירי העולם דיוק, 500346; Applier: 500345). אם 9 קליפים רפלקס מ"מ נמצאים פגיעה בחופש התנועה, קליפים רפלקס קטנים או 6-0 תפרים (Roboz, SUT-1073-1011) יכול לשמש במקום.

3. לאחר הניתוח טיפול

1. בעקבות ההליך, חיות מונחות על כרית חימום על 37 מעלות צלזיוס עד שהם מראים סימנים של תנועה.
2. הם עברו ואז בחזרה לכלוב ביתם, שם מים ומזון נגישים בקלות על הרצפה בצורה של Hydrogel ומזון wetted.

4. חצי דקה הכנה

1. בעקבות מנת יתר של pentobarbital (300 מ"ג / ק"ג) שרירי הרגל מוסר לחשוף * גיד הנשה. עם העצב שנותר באתרו, חלק אחורי שקוע paraformaldehyde 2% ו 2% gluteraldehyde במאגר M 0.1 פוספט על קרח במשך 30 דקות.
   * אם סיום הכנת כל שריר הר, השרירים הם הקציראד לפני חשיפת גיד הנשה.
2. העצב מוסר בזהירות, בזהירות נלקח לטפל רק קצה פרוקסימלי. ואז העצב הוא שלאחר קבוע מקבע אותו במשך שלוש שעות נוספות.
3. לאחר קיבוע העצב הוא שטף שלוש פעמים במאגר M 0.1 פוספט.
4. העצב הוא שקוע בתוך tetroxide אוסמיום 2% במאגר M 0.1 פוספט למשך שעה אחת.
5. העצב הוא אז מיובש על ידי טבילה רציף באתנול מרוכז יותר ויותר (50%, 70%, 80%, 95%, 100%, 100%, 100%). הטבילה היא כל 15 דקות.
6. העצב הוא מיובש מודגרות פעמיים שלוש דקות כל אחד ב פרופילן אוקסיד.
7. ואז העצב הוא שקוע בתוך תערובת 01:01 של פרופילן אוקסיד ו שבץ 812 לפחות 6 שעות (לילה בדרך כלל).
8. ואז העצב הוא שקוע בתוך תערובת 02:01 של פרופילן אוקסיד ו שבץ 812 לילה.
9. לבסוף, העצב הוא שקוע בתוך הטבע טהור 812 במשך שש שעות, ולאחר מכן מוטבע בדפוס ראשון מתאיםked על 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
10. סעיפים 1.0 מיקרומטר נחתכים מתוך גדם העצב הדיסטלי במרחק להגדיר מאתר למעוך באמצעות uct Ultracut ultramicrotome (לייקה) בסכין זכוכית צבעונית עם toluidine כחול. חלקים דקים עשויים גם להיות מיוצר לבחינת ultrastructure ידי מיקרוסקופית אלקטרונים.

5. הכנת כל הר שריר

1. העכברים הראשונים מוקרבים עם מנת יתר של pentobarbital (300 מ"ג / ק"ג) ואת הגפיים האחוריות מוסרים ברכיים.
2. ארבעה שרירי הגפיים האחוריות מוסרים לניתוח: tibialis הקדמי (ת"א), extensor digitorum longus (אדי), soleus ו longus peroneus.
3. כל השרירים מוסרים באמצעות דיסקציה זהירה והצמיד באמצעות רקמת החיבור שלהם sylgard שחור (פישר סיינטיפיק, NC9492579) צלחת מצופה. הם ושטף PBS, ותיקנו אז paraformaldehyde 4% למשך 30 דקות.
4. ת"א היא שטפה אז PBS, מוטבע אוקטובר (פישר סיינטיפיק, 14-373-65), ולהקפיא במהירות באמבט של קרח אצטון ויבש.
   1. הוא מאוחסן ב -80 ° C עבור חתך דק במקרה כל ההכנות בהר נכשל. באופן כללי, ת"א עבה מדי עבור mounts מלאים מספיקים.
5. אדי, soleus ו longus peroneus הם שטפה במשך 3 x 10 דקות PBS, להציב 0.1 מ '* גליצין (פישר סיינטיפיק, AC12007-0010; מדולל PBS) במשך 30 דקות, ושטף 3 x 10 דקות ב PBS שוב. הם הרווה אז מתנול קרח 100% בדיוק 5 דקות ב -20 ° C, שטף 3 x 10 דקות ב PBS, ו רחץ מצומדות fluorescently אלפא bungarotoxin (דילול 1:200 ב PBS) במשך 30 דקות. השרירים שטפה במשך 3 x 10 דקות PBS, ואחריו גוש 1-BSA שעה ב 2% (KPL, 50-61-00) ו 0.2% טריטון X-100 (דוט מדעי Incorporated, 9002-93-1) ב PBS *, ו מודגרות לילה תוך מתנדנד על 4 מעלות צלזיוס קוקטייל של נוגדנים ראשוניים בדילול בבלוק 2% באותו טריטון BSA/0.2%.
   * Glycine פתרונות לחסימת נעשים באותו יום כמו קצירת שרירים ובחש עבור 30-60 דקות בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
   1. לרגל אקסונים וסינפסות neuromuscular, אנו משתמשים בשילוב של סמן העכבר neurofilament חד שבטיים (Covance, SMI-312R, בדילול מלא 1:1000), עכבר חד שבטי סמן שלפוחית ​​סינפטית (SV2 DSHB, בדילול 1:1000), ו אלפא rhodamine מצומדות -bungarotoxin (Sigma-Aldrich, מדולל 1:200). לרגל תגובתי תאים שוואן אנו משתמשים הארנב נגד GAP-43 (נובוס ביולוגיות, NB300-143, בדילול 1/500). את הנוגדנים העיקריים הם דמיינו עם IgG1 תת סוג מסוים נוגדנים fluorescein מצומדות עז נגד העכבר DyLight משני 649 מצומדות חמור נגד ארנב (ImmunoResearch ג'קסון, מדולל 1:200).
6. למחרת השרירים ושטף PBS למשך 3 x 10 דקות, מודגרות ב נוגדנים משניים מדולל 1:200 (בפתרון 2% טריטון BSA/0.2% חסימה). הם שטופים אז 2 x 10 דקות ב PBS, הופllowed על ידי טבילה של 5 דקות ב DAPI (Invitrogen, D3571, מדולל ל 300 ננומטר במים deionized), ועוד 10 דקות ולשטוף ב PBS.
7. כל שריר הוא גזור ואילך sylgard שחור (פישר סיינטיפיק, NC9492579) מצופה צלחת פטרי. בתחילה הגידים מוסרים בנקודות הכניסה שלהם לתוך השריר, ולאחר מכן את השרירים דליל על ידי קילוף סיבי שריר הפנים (איור 3, לוחות AC). הטיפול נלקח לשמור על פני השטח החיצוני של שריר, כולל להקות endplate (איור 3, לוחות DF). השרירים וכתוצאה מכך הם רכובים על שקופיות ועוד (פישר סיינטיפיק, 12-550-15) עם vectashield (וקטור מעבדות, H-1000) ו - 22 x 40 מ"מ זכוכית coverslips (פישר סיינטיפיק, 12-548-5C) חתומים על ידי ברור לק על שני הצדדים. כאשר מותקן כראוי בשקופית את הלהקה הקשר endplate coverslip.

6. מדידת הדור הבא

1. התחדשות ניתן להעריך בכל שלושת השרירים (peroneus, אדי, ו soleus). אנו לעיתים קרובות לשעבראמין התחדשות ארבעה עשר ימים לאחר למחוץ העצב, המועד בו אחוז ניכר של NMJs הם מעוצבבים מחדש. שתי נקודות קודמות וזמן מאוחר יותר מתאימים גם, בהתאם לשאלה המדעית מתבקש. בשריר זה, מחדש העצבוב של הלהקה endplate כל נבחן. רק צמודי קרקע NMJs פנים מקבלים נקודות. באופן זה, לפחות 200 NMJs לכל שריר יכול להיבחן במהירות.
2. להבקיע השריר מחדש העצבוב אנו קובעים "מחדש העצבוב יחס". המכנה הוא מספר צמתים neuromuscular denervated כפי שכותרתו של GAP-43-α bungarotoxin תא מחייב שוואן immunoreactivity. המונה הוא מספר מחדש מעוצבבים NMJs שכותרתו כפי immunoreactivity neurofilament/SV2. במידת הצורך, NMJs יכול להיות מסווגת או באופן חלקי (כיסוי חלקי של bungarotoxin-α ידי SV2) או מלא (כיסוי מלא של bungarotoxin-α ידי SV2) מחדש מעוצבבים. לדוגמאות של NMJs מחדש מעוצבבים ו denervated ראה איור 3, לוחות G ו-H.

7. נציג תוצאות

באיור 1. סכמטי של אנטומיה גפה אחורית חשוב למעוך העצב. א חתך חצי עגול העור נעשה חושף השרירים הבסיסית. ב השרירים gluteal כבר נפרדו, גיד הנשה גילה (שלב 2.4 לעיל). החץ מציין את האתר למחוץ המשוער. מיקום מפשק מוצג כמדריך בכלל, מותאם במהלך ניתוח זה כדי להקל על ויזואליזציה של הירך ואת הגישה של מלקחיים עוצר דמום עבור מאוהבת ב '(השיבוץ). המיקום של הירך על הלסת התחתונה של מלקחיים עוצר דמום רק לפני למחוץ (שלב 2.5 לעיל). Fascicles נפרדים מסומנים על מנת להוכיח כי הם סמוכים אופקית, אך לא בצורה אנכית, במהלך הדוחק. למרות 3 fascicles מסומנים בתרשים זה, ניתן גם לראות fascicle 4, סניף במפרק של peroneal. עבור ציור אנטומי מפורט יותר של דפוסי הסתעפות של עצב הנשה fascicles דיסטלי עד כדי למעוך, עיין האנטומיה של גרין של עכברוש, איור 188 ^17.

איור 2. באתר פחמן מסומן למחוץ באתרו ו toluidine כחול מוכתם, חצי דקה קטעי גיד הנשה כתוש. א למשל של אתר דלוק באתרו (איבר האחורית משמאל). פחמן שחור מציין האתר למעוך. כוכבית מסמנת ענף של העצב הטיביאלי כי innervates שרירי הירך ומהווה ציון דרך שימושי במהלך הניתוח מאוהבת. חטיבת השוקה של עצב השת המתואר כחול, peroneal בירוק, ואת sural בצהוב. ב חצי דקה סעיפים הוכחת דלוקה המלא הופיע עם כוח עוצר דמוםPS. ג חצי דקה סעיפים הוכחת למחוץ שלם הופיע עם מלקחיים בזווית. בתמונות הן המתנוונת פרופילים המיאלין מסומנים ראשי חץ. בלוח החצים ג לסמן דוגמאות של פרופילים המיאלין משומרים ו מצרר של אקסונים בחיים. סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר.

איור 3 הר שלם שרירים סכמטי ו NMJs נציג AC:.. תמונות המוצג של אדי (א '), longus peroneus (ב'), ו soleus (C) בניכוי שרירי הגפיים האחוריות מ. שרירי המוצגים הם מענף האחורית הימנית. הברך אנטומי אוריינטציה הקרסול כלולים גם לעיון. הגידים הם בצבע לבן התווה קו שחור מוצק כשהוא מוצב על גבי השרירים. הם מתוארים בקו מקווקו שחור כאשר הם להאריך מתחת לשריר. קיצוצים מוצגים קווים מקווקווים אדומים.השריר הוא התקלף מאתרים חתוכים, כפי שצוין על ידי חיצים כחולים, דליל לאחר מכן. לאחר דילול, שרירים מופרד הסיכות על ידי חיתוך סביב מה שנותר הגידים שתלו: DF. תמונות שניתנו מתאריך השרירים הר שלמים לאחר הסרה של רקמת חיבור ובעקבות דליל. להקות endplate מפורטים על כל שריר GH:. שרירים Soleus כל הר ארבעה עשר ימים לאחר למחוץ גיד הנשה הוכחת מחדש מעוצבבים (G) denervated (ח) צמתים התוקפת. על לוחות אלה, NMJs, אקסונים, תאים שוואן הם דמיינו כמתואר לעיל בסעיף 5.5.1. קולטני אצטילכולין אדומות, אקסונים ירוק, תא שוואן מעבד כחול. בלוח G, החצים מצביעים על תחומי NMJ כי כבר מחדש מעוצבבים על ידי האקסון. בלוח ראשי חץ ח עולה GAP-43 חיוביות סלולריים תהליכים שוואן. הערה העדר אקסונים. סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר.

Discussion

הצגנו שיטה להשיג דלוקה מלאה ומהימנה גיד הנשה עם סימון מדויק של אתר דלוק. כאמור, למעוך גיד הנשה הוא מודל נפוץ של פגיעה עצבית היקפית בעכברים וחולדות. למרות כל שיטה של ​​התאהבות יש יתרונות וחסרונות, מצאנו שיטה זו הופק דלוקה שלמה סומן בקלות עם מינימום של ציוד מיוחד (מלחציים מיוחדים למשל, וכו ').

למחוץ שיטות

הכלי הנפוץ ביותר המשמש למחוץ העצב העכבר הנשה הוא ב -5 מלקחיים מספר בזווית. למרות שניתן להשיג דלוקה מלאה בשיטה זו, מצאנו כי הכלי הזה הפיק דלוקה משתנה (גם כוח קטן האקסונים היוצאים שחסכו או גדולים מדי לקרוע את העצב), בעיקר בידי המשתמש החדש.

שיטות פחות נפוצים אחרים המשמשים לייצור למחוץ כוללים קטעי מפרצת קטנים, מלקחיים קפואים בחנקן נוזלי, speciall Y מיוצרים, מכויל, לא משוננים מהדק ^9,12,5,7. כל המכשירים הללו יכולים לייצר באופן מהימן דלוקה מלאה. בחרנו מלקחיים עוצר דמום כי המכשיר קל להשיג, מייצרת דלוקה אמין, ומאפשר סימון ברור של אתר דלוק. חסרון אחד של מלקחיים עוצר דמום היא שאנחנו לא יכולים בקלות למדוד את הכוח הנוצר במהלך ההתאהבות. עם זאת, נבדק פעם אחת, מלקחיים עוצר דמום יהיה אמין לייצר דלוקה מלאה, והוא יכול בקלות להיות מוחלף על ידי כ מלקחיים זהים אם מלקחיים להתקלקל.

לא משנה השיטה שנבחרה לבצע למעוך, אולי החלק הכי קריטי של הליך ההתאהבות היא לוודא שלמות של התאהבות העצב. זה חשוב במיוחד בידי המשתמש רומן. חצי דקה של עצב ניתוח דיסטלי למקום הפגיעה (איור 2) מספק שיטה פשוטה לעשות את זה והוא יכול לחשוף את דלוקה שלמה (איור 2, לוח ב ') או למעוך חלקית (איור 2, לוח ג).

"Jove_content"> השיקול הסופי בשיטת למחוץ הוא משך הדוחק. בדקנו את משך שהייתי דלוקה עליו 15 שניות ל -60 שניות של זמן למחוץ מוחלט, ללא הבדל של השקיפות של העצב או שמירה על סיבי myelinated. זה עולה בקנה אחד עם התצפיות של גשר ועמיתיו, שהשוו מוחץ של משך 15-60 2 בעצב עכברוש הנשה באמצעות מלקחיים של חנות תכשיטים לא מצאו משמעותיים מורפולוגיים, היסטולוגית, הבדלים אלקטרו, או תפקודית בין התאהבות אחרת המשכים ^18. פעמים למחוץ עם זאת, יותר או שמועכת באופן משמעותי לבזות endoneurium תא שוואן תשנה את קצב ו / או הצלחה של התחדשות.

שיטות סימון

שתי השיטות מעשית עבור אתר למחוץ לציון מלבד פחמן אבקת הם תפר 10-0 באמצעות epineurium של עצב הנשה ^13,19, ו FluoSpheres המיוצר על ידי בדיקות מולקולריות, יוג'ין או ¹ ב-vivo הדמיה התחדשות בקווים YFP העכבר ^1. לענייננו מצאנו פחמן סימון נאותה ולא יקר, עם יתרון נוסף של שיראו בקלות בהערכה מיקרוסקופית לאחר חצי דקה או אלקטרונים. בנוסף, מצאנו כי פחמן סימון נמשכת לפחות שישה שבועות מה שהופך אותו מתאים ניסויים משך זמן ארוכים יותר.

ניתוח של הדור הבא אחרי קראש

שלמה investigation של התחדשות למחוץ הודעה משלב הערכות תפקודיות, אלקטרו, ו מורפולוגי ^5,16. הערכות מורפולוגיים בעקבות התחדשות הם אולי הנפוץ ביותר. הערכות אלו ניתן לחלק את אלה להעריך את זמן האחזור של צמיחה, קצב הצמיחה axonal, וספציפיות של ¹⁶ reinnervation. בדו"ח זה, הצגנו הליך שרירים כל הר, שניתן להשתמש בהם כדי להעריך במהירות התחדשות מורפולוגי (איור 3). בניתוח זה NMJs denervated שכותרתו ידי bungarotoxin אלפא תא שוואן GAP-43 הם לכמת ולעומת מחדש מעוצבבים צמתים כפי שכותרתו ידי neurofilament, SV2, ו אלפא bungarotoxin. GAP-43 הוא שהוגברו במידה ניכרת על ידי תאים שוואן לאחר denervation ו יפה מזהה denervated מסוף תאים שוואן בצומת neuromuscular ^20. למרות GAP-43 מתבטא אקסונים, השימוש קשורה של neurofilament בקלות מבדיל GAP-43 אקסונים חיוביות מתאי שוואן. יתר על כן,כי NMJs עמוק בתוך השריר לא יכול להיות מתויג בקלות על ידי נוגדנים (לעומת מולקולה קטנה אלפא bungarotoxin) GAP-43 שוואן תא immunoreactivity חשוב מאשר מצב denervated לצומת neuromuscular ומשפר דיוק כאשר ספירת NMJs denervated.

שיטה זו מספקת שיטה פשוטה ויעילה על מנת להעריך את מצב reinnervation של הלהקה שרירים endplate כולו בבת אחת. אחרים השתמשו שלך-1-CFP (23) / S100-GFP עכברים אקספרס ציאן חלבון פלואורסצנטי של אקסונים בתאי שוואן GFP לעקוב מחדש העצבוב של tibialis הקדמי לאחר למחוץ גיד הנשה ^2. אזהרה אחת יש לציין, אם כי. שיטה זו מסתמכת על neurofilament ו SV2 immunoreactivity לכמת מחדש עצבוב. ייתכן כי תוצאה האקסון עשוי להיות ללא הפרעה, אך הביטוי הבאות של SV2 עשויה להתעכב ^21. על כן, בניסויים מסוימים זה יהיה חשוב לאשר התחדשות מאוחרת ולא Delayed ביטוי presynaptic של החשבון (כלומר מראש הסינפטי בידול) SV2 על הפנוטיפ הנצפה.