Reproduserbar Mouse hoftenervene Crush og påfølgende vurdering av Regeneration av Whole Mount Muscle Analysis

Summary

I denne rapporten beskriver vi en metode for å knuse mus hoftenervene. Denne metoden bruker lett tilgjengelige hemostatic pinsett og lett og reproduserbart produserer komplette hoftenervene knuse. I tillegg beskriver vi en metode for å forberede muskler hele mounts egnet for analyse av nerve foryngelse etter hoftenervene knuse.

Abstract

Regeneration i det perifere nervesystemet (PNS) er mye studert både for dens relevans for menneskelig sykdom og for å forstå den robuste regenerativ respons montert av PNS nevroner dermed muligens belysning av svikt i CNS regenerering ^en. Hoftenervene forelsket (axonotmesis) er en av de vanligste modellene av perifer nerveskade hos gnagere ^2. Knusing avbryter alle axoner men Schwann celle basal lamellene er bevart slik at gjenfødelse er optimal ^3,4. Dette gjør at undersøkeren å studere nettopp muligheten for en voksende axon å samhandle med både Schwann cellen og basal lameller ^4. Rotter har generelt vært de foretrukne dyremodeller for eksperimentell nerve klem. De er allment tilgjengelig og deres lesioned isjiasnerven gir en rimelig tilnærming til menneskelig nerve lesjoner ^5,4. Selv mindre i størrelse enn rotte nerve, har musen nerve mange lignende kvaliteter. Likevel, det viktigste enormte-modellene er stadig mer verdifull på grunn av store tilgjengeligheten av transgene linjer gjør det nå mulig for en detaljert disseksjon av de enkelte molekyler kritiske for nerve ^{6 gjenfødelse, 7.} Tidligere etterforskere har brukt flere metoder for å produsere en nerve forelsket eller skade inkludert enkle vinklede tang, kjølt tang, hemostatic tang, vaskulære klemmer, og etterforsker utformede klemmer ^{8,9,10,11,12.} Etterforskerne har også brukt ulike metoder for merking skade området inkludert sutur, karbon partikler og fluoriserende perler ^13,14,1. Vi beskriver vår metode for å få et reproduserbart komplett hoftenervene knuse med presis og vedvarende merking av trengselen-området med en fin hemostatic tang og påfølgende karbon forelsket stedet merking. Som en del av vår beskrivelse av isjiasnerven trengselen prosedyre har vi også inkludert en relativt enkel metode for muskel hel montering vi bruker til senere kvantifisere foryngelse.

Protocol

1. Dyr fag

1.1. Behandling

1. Alle dyr prosedyrer skal utføres med godkjenning av den lokale institusjonens Animal Care og etisk komité og i samsvar med bruk og komiteen og National Institutes of Health retningslinjer, med tiltak for å redusere smerte og ubehag.
2. Våre musene ble plassert i henhold til temperatur-kontrollerte forhold på en 12-timers revers lys og mørke-syklusen, mens fôret mus Chow og vann ad libitum.
3. For studier av voksen foryngelse, skal mus være minst 6 ukers alder når hoftenervene forelskelsen er utført. Denne alderen er hinsides det tidspunkt beskjæring av polyneural nevromuskulære veikryss finne sted.
4. I disse eksperimentene, brukte vi 6-8 uker gammel C57BL / 6 mus ervervet fra Charles River. Når man sammenligner foryngelse etter hoftenervene forelsket (dvs.: rate av axon vekst) musestammer bør være den samme, som forskjeller i aksonal regenerasjon har vært ikkeed mellom ulike innavlede stammer ^15,16. Hvis genetisk manipulert mus skal brukes, kullbror kontroller er mest hensiktsmessig.

1.2. Kirurgisk Forberedelse

1. Dyr er dypt bedøvet for kirurgi ved hjelp av en cocktail av ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) via intraperitoneal injeksjon. Hvert dyr får også en subkutan injeksjon av meloksikam (10 mg / kg) for å minimere postoperativ smerte.
2. Begge bakbena blir nøye barbert bruker et kirurgisk clippers (Roboz, RC-5903) og hårfjerning er fullført med Nair hårfjerning krem ​​(finnes på apoteket).
3. Skin er renset ved bruk av sterile bomull tipped applikator og Betadine kirurgisk kratt (Fisher Scientific, 19066452).
4. Ophthalmic salve (Fisher Scientific, 19082795) brukes i øynene ved hjelp av sterile bomull tipped applikatorer.
5. Musen er plassert på en ren rustfri plate under som har blitt plassert en forvarmet homeothermic teppe system (Harvard Apparatus, 507222F). Animal temperaturen holdes på 37 ° C.
6. Alle lemmer er teipet ned, med omtanke for å plassere baklemmene symmetrisk slik at kneleddet gjør en rett vinkel med kroppen (Figur 1, panel A).
7. Den kirurgiske feltet er dekket med en steril drapere. Alle instrumenter blir sterilisert av autoklav eller varm perle sterilisering (Fine Science Verktøy, 18000-45) og kirurgen bærer en maske, kappe, og sterile hansker.

2. Reproduserbar hoftenervene Crush

1. Etter forberedelse, er en semi-sirkulær snitt over midtlinjen (figur 1) laget i huden. Huden er forsiktig dissekert fra den underliggende muskulatur, og foldet over å være ute av veien under prosedyren. Det holdes fuktig bruker programmer på 0,1 ml sterilt saltvann (Hospira, 0409-4888-20) under prosedyren.
2. Åpning av fascial flyet mellom gluteus maximus og fremre hodet av biceps femoris avslører hoftenervene (Figur 1, panel A). For en kirurgisk kontroll, bør det kontralaterale hoftenervene bli utsatt for og mobiliseres, men intakt. Den gluteal muskulaturen blir deretter re-motarbeidet og sutureres med en 6-0 flettet silke, ikke-absorberbare suturer (Roboz, SUT-1073-1011).
3. Den eksperimentelle isjiasnerven blir eksponert på samme måte, med haker på plass for å lette visualisering (Figur 1, panel B). De sårhaker er sterilisert før bruk.
   Merk: Selv om automatisk inntrekking systemer er kommersielt tilgjengelig, de er ofte ganske dyre. Vi var i stand til å foreta en tilfredsstillende retractor systemet med billig maskinvare forsyninger og insekt pinner (se Materialer avsnitt).
4. Hoftenervene blir deretter forsiktig frigjort fra omkringliggende bindevev hjelp iridectomy saks.
5. Med en fin 5/45 (Fine Science Verktøy, 11251-35) tang, blir nerven plassert på bunnen kjeven av en super-fine hemostatic tang (Fin Science Tools, 13020-12). De tre fascicles er sekvensielt justert, ikke på toppen av hverandre (Figur 1, innfelt B). De hemostatic tang har blitt inngravert med et merke på 1,5 mm fra tuppen deres. Den ytterste delen av sciatic er plassert i tråd med dette merket før trengselen. Dette sikrer en forelsket av uniform bredde, og at nerve ikke utover kjevene til hemostatic tang når flat på grunn av knusing kraft. Dersom nerve strekker seg utover tang spissen nerve vil bare bli delvis knust.
6. Forelskelsen er gjort vinkelrett på nerve ved 45 mm fra den tredje tåen, som målt ved en tråd som tilsvarer banen hoftenervene. Det nerve er knust en gang for 15 sekunder på 3 klikk på hemostatic tang. Care tas ikke strekke nerve. Når hemostats blir gjenåpnet, skal hele nerve være gjennomskinnelig på trengselen stedet.
7. Et annet par hemostatic tang (identisk med den første) som har vært pre-dyppet ipulverisert karbon (Fisher Scientific, C272-500) brukes til å markere knuse nettstedet. Det nerve er knust på samme trengselen området i 15 sekunder på 3 klikk. Ingen karbon merking bør strekke seg utover grensen for den første forelskelsen. Dette er spesielt viktig hvis presis merking av trengselen området er nødvendig. Før bruk, er karbonpulver steriliseres ved eksponering for UV lys i to timer, og deretter blir håndtert ved hjelp steril teknikk.
   1. Å pre-dypp tang i karbon, men utelukker utbredt karbon ved det kirurgiske området, blir pinsett åpnet i pulverisert kull, deretter forsiktig lukket (men ikke klikket) stengt, og karbon på utsiden av hemostats tørkes av med steril kompress . De tang blir kontrollert under minst 3x forstørrelse for å kontrollere at den knusende overflater er jevnt belagt i pulverisert kull. Om nødvendig har de re-dyppet og tørkes.
8. Den gluteal muskulaturen er re-motarbeidet og sutureres på samme måte som motsatt side.
9. Endelig er huden snittet lukkes med 9 mm refleks klipp (World presisjonsinstrumenter, 500346; applier: 500345). Hvis 9 mm refleks klipp er funnet å begrense bevegelsen, mindre refleks klipp eller 6-0 sting (Roboz, SUT-1073-1011) kan brukes i stedet.

3. Postoperativ behandling

1. Etter prosedyren, blir dyrene plassert på en varmepute ved 37 ° C inntil de viser tegn til bevegelse.
2. De blir deretter flyttet tilbake til sine hjem buret, hvor vann og mat er lett tilgjengelig på gulvet i form av Hydrogel og fuktede mat.

4. Semi-tynn Forberedelse

1. Etter en overdose av pentobarbital (300 mg / kg) beinet muskulaturen er fjernet for å utsette hoftenervene *. Med nerve gjenværende in situ, er bakparten nedsenket i 2% paraformaldehyde og 2% gluteraldehyde i 0,1 M fosfatbuffer på is i 30 minutter.
   * Hvis fullfører hele mount muskel forberedelse, musklene er høsted før utsette hoftenervene.
2. Det nerve er omhyggelig fjernet, med omtanke for å bare håndtere den proksimale enden. Da nerve er post-fast i den samme bindemiddel for ytterligere tre timer.
3. Etter fiksering nerve skylles tre ganger i 0,1 M fosfatbuffer.
4. Det nerve er nedsenket i 2% osmium tetroxide i 0,1 M fosfatbuffer i én time.
5. Det nerve er da dehydrert ved sekvensiell nedsenking i stadig konsentrert etanol (50%, 70%, 80%, 95%, 100%, 100%, 100%). Hver nedsenking er 15 minutter.
6. Den dehydrert nerve inkuberes to ganger i propylen oksid i tre minutter hver.
7. Da nerve er nedsenket i en 1:1 blanding av propylen oksid og Embedde 812 i minst 6 timer (vanligvis over natten).
8. Da nerve er nedsenket i en 2:1 blanding av propylen oksid og Embedde 812 over natten.
9. Endelig er nerve nedsenket i ren Embed 812 for seks timer, deretter nedfelt i den aktuelle formen og baked ved 60 ° C i 48 timer.
10. 1.0 mikrometer seksjoner er kuttet fra det distale nerve stubben på en angitt avstand fra trengselen nettstedet ved hjelp av en Ultracut UCT ultramicrotome (Leica) med ett glass kniv og beiset med toluidine blå. Tynne snitt kan også bli produsert for undersøkelse av ultrastructure ved elektronmikroskopi.

5. Hele Mount Muscle Forberedelse

1. Første mus er ofret med en overdose av pentobarbital (300 mg / kg) og baklemmene er fjernet i knærne.
2. Fire musklene i bakbenet lem blir fjernet for analyse: tibialis anterior (TA), extensor digitorum longus (EDL), soleus, og peroneus longus.
3. Alle muskler blir fjernet via forsiktig disseksjon og festet gjennom deres bindevev til en svart sylgard (Fisher Scientific, NC9492579) belagt parabolen. De er skyllet i PBS, og deretter fiksert i 4% paraformaldehyde i 30 minutter.
4. TA er så skylles i PBS, innebygd i oktober (Fisher Scientific, 14-373-65), og raskt frosset i et bad av aceton og tørris.
   1. Det lagres ved -80 ° C for tynn seksjonering i tilfelle hele Mount forberedelse mislykkes. Generelt er det TA for tykk for tilstrekkelige hele mounts.
5. EDL, soleus, og peroneus longus skylles i 3 x 10 minutter i PBS, plassert i 0,1 M glysin * (Fisher Scientific, AC12007-0010, fortynnet i PBS) i 30 minutter, og skylte 3 x 10 minutter i PBS igjen. De blir deretter slukket i iskaldt 100% metanol i nøyaktig fem minutter ved -20 ° C, skylt 3 x 10 minutter i PBS, og badet i fluorescently konjugert alpha-bungarotoxin (fortynnet 1:200 i PBS) i 30 minutter. Musklene blir skyllet i 3 x 10 minutter i PBS, etterfulgt av en 1-times blokk i 2% BSA (KPL, 50-61-00) og 0,2% Triton X-100 (Dot Scientific Incorporated, 9002-93-1) i PBS *, og inkubert over natten mens hun gynger ved 4 ° C i en cocktail av primære antistoffer fortynnet i den samme 2% BSA/0.2% Triton blokk.
   * Glycine og blokkerer løsninger er gjort på samme dag som muskel høsting og rørte i 30-60 minutter i romtemperatur før bruk.
   1. For å markere axoner og nevromuskulære synapser, bruker vi en kombinasjon av et monoklonalt neurofilament markør (Covance, SMI-312R, fortynnet 1:1000), monoklonalt synaptisk vesikkel markør (SV2 DSHB, fortynnet 1:1000), og rhodamine konjugert alfa -bungarotoxin (Sigma-Aldrich, fortynnet 1:200). For å markere reaktive Schwann celler vi bruker kanin anti-GAP-43 (Novus Biologicals, NB300-143, fortynnet 1/500). De primære antistoffer er visualisert med en IgG1 subtype spesifikk fluorescein konjugert geit anti-mus sekundært antistoff og DyLight 649 konjugert esel anti-kanin (Jackson ImmunoResearch, fortynnet 1:200).
6. Dagen etter, musklene skylles i PBS i 3 x 10 minutter, og inkubert i sekundære antistoffer fortynnet 1:200 (i 2% BSA/0.2% Triton blokkerer løsning). De blir deretter skylles 2 x 10 minutter i PBS, FOllowed av en 5-minutters nedsenking i DAPI (Invitrogen, D3571, fortynnet til 300 nM i avionisert vann), og en annen 10-minutters skylling i PBS.
7. Hver muskel er så dissekert på en svart sylgard (Fisher Scientific, NC9492579) belagt petriskål. Opprinnelig senene blir fjernet ved sine innsettingspunktene inn i muskelen, og deretter vil musklene tynnet med løsner interiør muskelfibre (figur 3, paneler AC). Care er tatt for å bevare utvendig overflate av muskelen, inkludert de gavl band (figur 3, paneler DF). De resulterende musklene er montert på pluss lysbilder (Fisher Scientific, 12-550-15) med vectashield (Vector Laboratories, H-1000) og 22 x 40 mm glass Dekkglass (Fisher Scientific, 12-548-5C) forseglet av klar neglelakk på to sider. Når riktig montert på lysbildet de gavl bandet kontakter dekkglass.

6. Måling Regeneration

1. Regeneration kan estimeres i alle tre muskler (peroneus, EDL, og soleus). Vi ofte examin foryngelse fjorten dager etter nerve klem, en tid hvor en betydelig andel av NMJs er re-innerverte. Både tidligere og senere punkter er også egnet, avhengig av vitenskapelige spørsmålet blir stilt. I hver muskel, blir re-innervasjon av hele gavl bandet undersøkt. Bare en face overflate NMJs blir scoret. På denne måten kan minst 200 NMJs per muskel raskt undersøkt.
2. Å score muskel re-innervasjon vi bestemme en "re-innervasjon ratio". Nevneren er antall denerveres nevromuskulære veikryss som er merket av α-bungarotoxin bindende og Schwann celle GAP-43 immunoreaktivitets. Telleren er antall re-innerverte NMJs som er merket med neurofilament/SV2 immunoreaktivitets. Ved behov kan NMJs bli klassifisert som enten delvis (ufullstendig dekning av α-bungarotoxin av SV2) eller fullstendig (komplett dekning av α-bungarotoxin av SV2) re-innerverte. For eksempler på re-innerverte og denerveres NMJs se figur 3, paneler G og H.

7. Representative Resultater

Figur 1. Skjematisk av hind lemmer anatomi viktig å nerve klem. A. En semi-sirkulær hud innsnitt er gjort avsløre den underliggende muskulatur. B. gluteal muskulaturen har blitt separert, og hoftenervene avslørt (trinn 2.4 ovenfor). En pil angir omtrentlig trengselen nettstedet. Retractor plassering er vist som en generell guide, og justeres i løpet av hver operasjon for å lette visualisering av sciatic og tilnærming av hemostatic tang for knuse B (innfelt):. Plassering av sciatic på underkjeven av hemostatic tang like før forelskelse (trinn 2,5 over). Separate fascicles er merket for å vise at de er tilstøtende horisontalt, men ikke vertikalt, under trengselen. Selv om tre servicesentericles er merket i dette diagrammet, kan man også se en kvart fascicle, articular grenen av peroneal. For en mer detaljert anatomisk tegning av den forgrenede mønstre av hoftenervene fascicles distalt for trengselen punktet, henvises det til Greenes Anatomy of the Rat, 188 Figur ^17.

Figur 2. En karbon-merket knuse nettstedet in situ og toluidin blå-farget, semi-tynne snitt av knust isjiasnerven. A. Et eksempel på en forelsket nettsted i situ (venstre bakben lem). Svart karbon betegner trengselen nettstedet. Stjernen markerer en gren av tibial nerve som innervates lår muskulaturen og fungerer som en nyttig landemerke under knuse kirurgi. Den tibial delingen av hoftenervene er skissert i blått, den peroneal i grønt, og det Sural i gult. B. Semi-tynne snitt viser en komplett forelsket utført med hemostatic kraftps. C. Semi-tynne snitt som viser en ufullstendig forelsket utført med vinklede tang. I begge bildene degenereres myelin profiler er markert med pilspisser. I panel C piler markere eksempler på bevarte myelin profiler og en klynge av spart axoner. Scale bar er 10 mikrometer.

Figur 3 Whole mount muskel skjematisk og representative NMJs AC:.. Ytet bilder av EDL (A), peroneus longus (B), og soleus (C) musklene etter fjerning fra hind lem. Muskler som vises er fra høyre bakben lem. Kne og ankel anatomisk orientering er også inkludert for referanse. Sener er farget hvitt og skissert i en solid svart linje når plassert på toppen av muskelen. De er skissert i en svart stiplet linje når de går under muskelen. Kutter er vist i røde stiplede linjer.Muscle er skrellet vekk fra cut-områder, som angitt av blå piler, og senere tynnet. Etter tynning er muskel skilt fra pinnene ved å kutte rundt hva gjenstår av de festede sener DF:. Utførte bilder fra hele mount muskler etter fjerning av bindevev og påfølgende tynning. De gavl band er beskrevet på hver muskel GH:. Soleus hele mount muskel fjorten dager etter at isjiasnerven forelsket demonstrere igjen innerverte (G) og denerveres (H) nevromuskulære veikryss. I disse panelene, NMJs og aksoner og Schwann celler er visualisert som beskrevet ovenfor i avsnitt 5.5.1. Acetylkolinreseptorer er rød, aksoner grønn, og Schwann celle behandler blå. I panelet G, pilene indikerer områder av NMJ som har blitt re-innerverte av en axon. I panelet H pilspisser indikere GAP-43 positive Schwann celleprosesser. Legg merke til fravær av axoner. Scale bar er 10 mikrometer.

Discussion

Vi har presentert en metode for å få en pålitelig komplett hoftenervene forelsket med presis merking av trengselen nettstedet. Som tidligere nevnt, er isjiasnerven knuse en felles modell av perifer nerveskade hos mus og rotter. Selv om hver metode av trengselen har sine fordeler og ulemper, fant vi denne metoden produsert et komplett forelsket som ble lett markert med et minimum av spesialutstyr (f.eks spesielle klemmer osv.).

Crush Metoder

Den vanligste instrument som brukes for mus hoftenervene forelsket er nr. 5 vinklede tang. Mens det er mulig å få en fullstendig forelsket hjelp av denne metoden, fant vi at dette instrumentet produsert en variabel forelsket (for lite kraft forlater spart aksoner eller altfor store rivende nerve), spesielt i hendene på en ny bruker.

Andre mindre vanlige metoder for å produsere knuse inkludere små aneurisme klipp, tenger kjølt i flytende nitrogen, og specially produsert, kalibrert, ikke-taggete klemmer ^9,12,5,7. Hver av disse instrumentene kan sikkert produsere en komplett forelsket. Vi valgte hemostatic tang fordi instrumentet er lett å få tak i, gir et pålitelig forelsket, og åpner for tydelig merking av trengselen nettstedet. En av ulempene med hemostatic tang er at vi ikke kan lett måle kraften som produseres i løpet av forelskelse. Men når testet, vil en hemostatic tang pålitelig produsere en komplett forelsket, og kan lett erstattes av en identisk tang hvis pinsett blir skadet.

Uansett hvilken metode valgt å utføre en klem, kanskje den mest kritiske delen av trengselen prosedyren er å verifisere fullstendigheten av nerve knuse. Dette er spesielt viktig i hendene på en roman bruker. Semi-tynn analyse av nerve distalt for skaden området (figur 2) gir en grei metode å gjøre det, og kan avsløre en komplett forelsket (figur 2, panel B) eller en ufullstendig forelsket (figur 2, panel C).

18. Men lengre knuse tider eller knuser som vesentlig forringer Schwann cellen endoneurium vil endre hastighet og / eller suksess regenerering.

Merkemetoder

De to levedyktige metoder for forelskelsen nettstedet merking annet enn pulverisert kull er en 10-0 sutur gjennom epineurium av hoftenervene ^13,19, og FluoSpheres produsert av molekylære prober, Eugene, OR ¹ i-vivo regenerering i YFP mus linje ^1. For vårt formål fant vi karbon merking tilstrekkelig og rimelig, med den ekstra fordelen av å være godt synlig i påfølgende semi-tynne eller elektron mikroskopisk vurdering. I tillegg har vi funnet at karbon merking vedvarer i minst seks uker gjør det egnet for lengre varighet eksperimenter.

Analyse av Regeneration etter Crush

En fullstendig etterforskningsjon av post knuse regenerasjon kombinerer funksjonelle, elektrofysiologiske og morfologiske vurderinger ^5,16. Morfologiske vurderingene etter regenerering er kanskje den vanligste. Disse vurderingene kan deles inn i de som vurdere ventetid for vekst, graden av aksonal vekst, og spesifisitet reinnervation ^16. I denne rapporten har vi presentert en hel mount muskel prosedyre som kan brukes til å raskt vurdere morfologiske regenerering (figur 3). I denne analysen denerveres NMJs merket med alfa-bungarotoxin og Schwann celle GAP-43 er kvantifisert og sammenlignet med re-innerverte veikryss som er merket med neurofilament, SV2, og alfa-bungarotoxin. GAP-43 er markert oppregulert ved Schwann celler etter denervering og pent identifiserer denerveres terminal Schwann celler ved nevromuskulære krysset ^20. Selv om GAP-43 uttrykkes av axoner, skiller samtidig bruk av neurofilament lett GAP-43 positive axoner fra Schwann celler. Viderefordi NMJs dypt i muskelen kan ikke være lett merket med antistoff (i forhold til den lille molekylet alfa-bungarotoxin) Schwann celle GAP-43 immunoreaktivitets bekrefter viktigere denerveres status en nevromuskulær knutepunkt og forbedrer nøyaktigheten når man teller denerveres NMJs.

Denne metoden gir en enkel og effektiv metode for å vurdere reinnervation status for hele muskelen gavl bandet på en gang. Andre har brukt din-1-CFP (23) / S100-GFP mus som uttrykker cyan fluorescerende protein i axoner og GFP i Schwann celler til å følge re-innervasjon av fremre tibialis etter isjiasnerven knuse ^to. En påminnelse må bemerkes, though. Denne metoden er avhengig av neurofilament og SV2 immunoreaktivitets å kvantifisere re-innervasjon. Det er mulig at axon utvekst kan uhindret men senere uttrykk for SV2 kan bli forsinket ^21. Derfor, i noen eksperimenter vil det være viktig å bekrefte at forsinket foryngelse og ikke delayed presynaptisk uttrykk for SV2 (dvs. presynaptiske differensiering) står for en observert fenotype.