Reproducerbar Mouse ischiasnerv krossa och påföljande bedömningen av Regeneration av Whole Mount Muscle Analys

Summary

I denna rapport beskriver vi en metod för att krossa musen ischiasnerven. Denna metod använder lättillgängliga hemostatiska pincett och enkelt och reproducerbart ger en fullständig ischiasnerven krossa. Dessutom beskriver vi en metod för att framställa muskelceller hela monteringar som är lämpliga för analys av nervregeneration efter ischiasnerven krossa.

Abstract

Regeneration i det perifera nervsystemet (PNS) har studerats både för dess relevans för sjukdomar hos människan och att förstå den robusta regenerativa responsen monteras av PNS nervceller och därmed eventuellt belyser bristerna i CNS regeneration ^1. Ischiasnerven krossa (axonotmesis) är en av de vanligaste modellerna av perifer nervskada hos gnagare ^2. Krossning avbryter alla axoner, men Schwann cell basala laminat bevaras så att förnyelse är optimal ^3,4. Detta tillåter forskaren att studera exakt förmågan hos en växande axon att interagera med både Schwann-cell-och basala laminat ^4. Råttor har i allmänhet varit föredragna djurmodeller för experimentell nerv krossa. De är allmänt tillgängliga och deras skadade ischiasnerven ger en rimlig uppskattning av de mänskliga nerv skador ^5,4. Även mindre i storlek än råtta nerv, har musen nerven många liknande kvaliteter. Viktigast dock, samförståndsavtalE-modellerna blir allt värdefulla på grund av den stora tillgången av transgena linjer ger nu en detaljerad dissektion av de individuella molekyler som är kritiska för nervregeneration ^{6, 7.} Tidigare utredare har använt flera olika metoder för att producera en nerv krossa eller skada inklusive enkla vinklade pincett, kyld griptänger hemostatiska griptänger vaskulära klämmor och forskardriven utformade byglar ^{8,9,10,11,12.} Utredarna har också använt olika metoder för att märka skada plats, inklusive sutur, kolpartiklar och fluorescerande pärlor ^13,14,1. Vi beskriver vår metod för att erhålla ett reproducerbart komplett ischiasnerven krossa med korrekt och ihållande märkning av krossa-webbplatsen med hjälp av en fin hemostatiska pincett och efterföljande kol kär plats märkning. Som en del av vår beskrivning av ischiasnerven krossa förfarande har vi också en relativt enkel metod för att muskeln helt montera vi använder för att sedan kvantifiera förnyelse.

Protocol

1. Djurobjekt

1,1. Behandling

1. Alla djur bör utföras med godkännande av den lokala institutionens Animal Care och etik och i enlighet med användning och kommittén och National Institutes of Health riktlinjer med åtgärder som vidtas för att minimera smärta och obehag.
2. Våra möss inrymt i temperatur-kontrollerade förhållanden på en 12-timmars back ljus och mörker, medan matade musfoder och vatten ad libitum.
3. För studier av vuxna förnyelse, bör möss vara minst 6 veckors ålder när ischiasnerven krossa utförs. Denna åldersgräns är bortom den tidpunkt vid vilken beskärning av polyneural neuromuskulära korsningar ske.
4. I dessa experiment använde vi 6-8 veckor gamla C57BL / 6 möss som förvärvats från Charles River. När man jämför återhämtning efter ischiasnerven kär (dvs. graden av Axon tillväxt) musstammar ska vara samma, eftersom skillnaderna i axonal regeneration har inte varitED mellan olika inavlade stammar ^15,16. Om genetiskt manipulerade möss ska användas, kullsyster kontrollerna är mest lämpliga.

1,2. Kirurgisk beredning

1. Djuren bedövades djupt för kirurgi med användning av en cocktail av ketamin (100 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg) via intraperitoneal injektion. Varje djur erhåller också en subkutan injektion av meloxikam (10 mg / kg) för att minimera post-operativ smärta.
2. Båda bakbenen är noggrant rakade med hjälp av en kirurgisk Clippers (Roboz, RC-5903) och hårborttagning avslutas med Nair Hårborttagningscreme (finns på apoteket).
3. Huden är renad med sterila bomull spets applikatorer och Betadine kirurgiska buskmarker (Fisher Scientific, 19.066.452).
4. Oftalmisk salva (Fisher Scientific, 19.082.795) appliceras till ögonen med användning av sterila bomull spets applikatorer.
5. Musen placeras på en ren platta av rostfritt stål, enligt vilket har placerats en förvärmd homeothermic filt-systemet (Harvard Apparatus, 507222F). Djur Temperaturen hålles vid 37 ° C.
6. Alla lemmar är tejpade ner med omsorg för att placera bakbenen symmetriskt så att knäleden gör en rät vinkel med kroppen (Figur 1, panel A).
7. Det kirurgiska området är täckt med en steril duk. Alla instrument är steriliserade med autoklav eller varm pärla sterilisering (Fine Science Tools, 18.000-45) och kirurgen bär en mask, klänning, och sterila handskar.

2. Reproducerbar ischiasnerv Crush

1. Efter beredning är en halvcirkelformad snitt tvärs över mittlinjen (figur 1) görs i huden. Huden försiktigt skäras ut från den underliggande muskulatur, och viks över för att förbli ur vägen under förfarandet. Den hålls fuktig med tillämpningar av 0,1 ml steril koksaltlösning (Hospira, 0409-4888-20) under förfarandet.
2. Öppna fascian planet mellan gluteus maximus och den främre huvud biceps femoris avslöjar ischiasnerven (Figur 1, panel A). För en kirurgisk kontroll bör det kontralaterala ischiasnerven exponeras och mobiliseras, men lämnade intakt. Den gluteala muskulaturen sedan åter motsatte sig och sys med en 6-0 flätad silke, icke-absorberbara suturer (Roboz, SUT-1073-11).
3. Den experimentella ischiasnerven exponeras sedan på samma sätt, med upprullning på plats för att underlätta visualisering (figur 1, fält B). De upprullningsdon steriliseras före användning.
   Obs: även upprullningsdon system är kommersiellt tillgängliga, de är ofta ganska dyra. Vi kunde göra en tillfredsställande upprullningsdon system med billig hårdvara varor och insekter stift (se Material avsnitt).
4. Ischiasnerven därefter försiktigt fri från omgivande bindväv med användning Iridektomi sax.
5. Med en fin 5/45 (Fine Science Tools, 11.251-35) pincett är nerven placeras på nedre käken av en super-fin hemostatiska tång (Fine Science TooLS, 13.020-12). De tre fasciklar sekventiellt i linje, inte ovanpå varandra (figur 1, infälld B). De hemostatiska pincett har graverad med ett märke på 1,5 mm från sitt spets. Den yttersta delen av sciatic placeras i linje med detta varumärke före krossa. Detta säkerställer en kross med likformig bredd, och att nerven inte sträcker sig förbi käkarna av de hemostatiska tången när tillplattade på grund av den krosskraft. Om nerven sträcker sig utanför tång spetsen nerven kommer endast att delvis krossade.
6. Det krossade görs vinkelrätt mot nerven vid 45 mm från den tredje tån, mätt genom en tråd som approximerar den bana av ischiasnerven. Nerven krossas gång under 15 sekunder vid 3 klick av de hemostatiska pincett. Care att inte sträcka nerven. När peanger är åter öppnas, bör hela nerven vara genomskinlig på krossa platsen.
7. Ett andra par hemostatiska pincett (identisk med den första) som har pre-doppas ipulveriserat kol (Fisher Scientific, C272-500) används för att markera det krossade platsen. Nerven krossas på samma krossa plats i 15 sekunder vid 3 klick. Ingen koldioxid Märkningen bör sträcka sig längre än gränsen för den första förälskelse. Detta är särskilt viktigt om exakt markering av det krossade platsen krävs. Före användning är kolpulver steriliseras genom exponering för UV-ljus under två timmar, och därefter hanteras med användning av steril teknik.
   1. Att i förväg doppa tången i kol men utesluter utbredd kol vid det kirurgiska stället, är tången öppnas i pulveriserat kol, sedan försiktigt stängd (men inte klickas) stängs, och kolet på utsidan av de hemostater torkas bort med användning av steril gasväv . Tången kontrolleras enligt minst 3x förstoring för att verifiera att de krossningsytorna är jämnt belagd i pulveriserat kol. Om det behövs är de åter doppade och torkade.
8. Den gluteala muskelmassan åter mot och sutureras på samma sätt som den kontralaterala sidan.
9. Slutligen hudsnittet stängd med användning av 9 mm reflex klämmor (World Precision Instruments, 500346; anbringande: 500345). Om 9 mm reflex klipp finns att begränsa rörelse, mindre reflex klipp eller 6-0 suturer (Roboz, SUT-1073-11) kan användas i stället.

3. Postoperativ vård

1. Genom att följa förfarandet placeras djuren på en värmedyna vid 37 ° C tills de uppvisar tecken på rörelse.
2. De flyttas sedan tillbaka till deras hem bur, där vatten och mat är lätt tillgängliga på golvet i form av hydrogelen och våta livsmedel.

4. Semi-Thin Preparation

1. Efter en överdos av pentobarbital (300 mg / kg) på benet muskulaturen avlägsnas för att exponera ischiasnerven *. Med nerven återstående in situ är bakdelen nedsänkt i 2% paraformaldehyd och 2% glutaraldehyd i 0,1 M fosfat-buffert på is under 30 minuter.
   * Om att fylla hela beredningen mount muskler, muskler är skördened innan du utsätter ischiasnerven.
2. Nerven är noggrant bort, med omsorg för att endast hantera den proximala änden. Då nerven är post-fixerad i samma fixativ för ytterligare tre timmar.
3. Efter fixering nerven sköljs tre gånger i 0,1 M fosfatbuffert.
4. Nerven är nedsänkt i 2% osmiumtetroxid i 0,1 M fosfatbuffert under en timme.
5. Nerven dehydratiseras därefter genom sekventiell nedsänkning i allt koncentrerad etanol (50%, 70%, 80%, 95%, 100%, 100%, 100%). Varje nedsänkning är 15 minuter.
6. Den dehydratiserade nerv inkuberas två gånger i propylenoxid under tre minuter vardera.
7. Därefter nerven är nedsänkt i en 1:1 blandning av propylenoxid och bädda 812 under minst 6 timmar (vanligen över natten).
8. Därefter nerven är nedsänkt i en 2:1 blandning av propylenoxid och bädda 812 natten.
9. Slutligen nerven nedsänkning i rent Inbäddad 812 i sex timmar, inbäddades sedan i den lämpliga formen och baked vid 60 ° C under 48 timmar.
10. 1,0 | im sektioner skars ut från den distala nervstumpen vid en inställd sträcka från det krossade materialet platsen med användning av en Ultracut UCT ultramikrotom (Leica) med en glas-kniv och färgades med toluidinblått. Tunna sektioner kan också framställas för undersökning av ultrastrukturen med elektronmikroskopi.

5. Hela monteringen Muskel Framställning

1. Första möss offras med en överdos av pentobarbital (300 mg / kg) och bakbenen tas bort vid knäna.
2. Fyra muskler i bakbenet avlägsnas för analys: den främre tibialis-(TA), extensor digitorum longus (EDL), soleus och peroneus longus.
3. Alla muskler är avlägsnas via noggranna dissekering och fästs genom sin bindväv till en svart Sylgard (Fisher Scientific, NC9492579) belagd maträtt. De sköljs i PBS och fixerades sedan i 4% paraformaldehyd under 30 minuter.
4. TA sköljs sedan i PBS, bäddades in i OCT (Fisher Scientific, 14-373-65), och frystes snabbt i ett bad av aceton och torris.
   1. Den lagras vid -80 ° C för tunna sektionering i fall helt berget förberedelser misslyckas. I allmänhet är TA för tjock för lämpliga hela monteringar.
5. EDL, soleus och peroneus longus sköljs under 3 x 10 minuter i PBS, placerades i 0,1 M glycin * (Fisher Scientific, AC12007-0010; utspädd i PBS) under 30 minuter och sköljdes 3 x 10 minuter i PBS igen. De är sedan släcktes i iskall 100% metanol under exakt 5 minuter vid -20 ° C, sköljdes 3 x 10 minuter i PBS, och badades i fluorescent konjugerad alfa-bungarotoxin (utspädd 1:200 i PBS) under 30 minuter. Musklerna sköljs under 3 x 10 minuter i PBS, följt av en 1-timmes blockering i 2% BSA (KPL, 50-61-00) och 0,2% Triton X-100 (Dot Scientific Incorporated, 9002-93-1) i PBS *, och inkuberades över natten medan gungning vid 4 ° C i en cocktail av primära antikroppar utspädda i samma 2% BSA/0.2% Triton-block.
   * Glycine och blockerande lösningar görs på samma dag som muskel skörd och omrördes under 30-60 minuter vid rumstemperatur före användning.
   1. För att markera axoner och neuromuskulära synapser, använder vi en kombination av en mus-monoklonal neurofilament markör (Covance, SMI-312R, utspädd 1:1000), en monoklonal mus synaptisk blåsa markör (SV2 DSHB, efter utspädning 1:1000) och rodamin konjugerad alfa -bungarotoxin (Sigma-Aldrich, späddes 1:200). För att märka reaktiva Schwann-celler har vi använda kanin-anti-GAP-43 (Novus Biologicals, NB300-143, späddes 1/500). De primära antikropparna visualiseras med en lgG1-subtyp specifik fluorescein-konjugerad get anti-mus sekundär antikropp och DyLight 649 konjugerad åsne-anti-kanin (Jackson ImmunoResearch, späddes 1:200).
6. Följande dag, musklerna sköljdes i PBS under 3 x 10 minuter, och inkuberades i sekundära antikroppar späddes 1:200 (i 2% BSA/0.2% Triton blockeringslösning). De sköljdes därefter 2 x 10 minuter i PBS, followed med en 5-minuters nedsänkning i DAPI (Invitrogen, D3571, utspätt till 300 nM i avjoniserat vatten), och en annan 10-minuters sköljning i PBS.
7. Varje muskel dissekeras sedan på en svart Sylgard (Fisher Scientific, NC9492579) belagda petriskål. Initialt senor avlägsnas vid sina införande poäng till muskeln, och sedan musklerna tunnas genom att dra bort inre muskelfibrerna (figur 3, paneler AC). Försiktighet tas för att bevara utsidan av muskeln, inklusive ändskivan banden (figur 3, paneler DF). De resulterande muskler är monterade på plus diabilder (Fisher Scientific, 12-550-15) med vectashield (Vector Laboratories, H-1000) och 22 x 40 mm täckglas (Fisher Scientific, 12-548-5C) förseglats av tydliga nagellack på två sidor. När rätt monterad på bilden för ändskivan bandet i kontakt med täckglaset.

6. Mätning Regenerering

1. Regeneration kan uppskattas i alla tre muskler (peroneus, EDL och soleus). Vi ex oftaamin regenerering fjorton dagar efter nerv krossa, en tidpunkt vid vilken en väsentlig andel av NMJs återanvänds innerverad. Både tidigare och senare tidpunkter är också lämpliga, beroende på den vetenskapliga fråga som ställs. I varje muskel, på nytt innervation av hela ändskivan bandet undersökas. Endast en face ytan NMJs poängsätts. På detta sätt kan åtminstone 200 NMJs per muskel snabbt undersökas.
2. Gör mål muskler re-innervation vi bestämma en "re-innervation ratio". Nämnaren är antalet denerverade neuromuskulära korsningar som märkta av α-bungarotoxinbindning och Schwann cell GAP-43 immunreaktivitet. Täljaren är antalet re-innerverade NMJs som märkta med neurofilament/SV2 immunreaktivitet. Vid behov kan NMJs klassificeras som antingen delvis (ofullständig täckning av α-bungarotoxin med SV2) eller helt (fullständig täckning av α-bungarotoxin med SV2) re-innerveras. För exempel på re-innerverade och denerverade NMJs se figur 3, panel G och H.

7. Representativa resultat

Figur 1. Schematisk i bakbenen anatomi viktigt att nerven krossa. A. En halvcirkelformad hudsnitt har gjorts avslöjar underliggande muskulatur. B. gluteala muskulatur har separerats och ischiasnerven visade (steg 2,4 ovan). En pil anger den ungefärliga krossa webbplatsen. Upprullningsdon placering visas som en allmän vägledning och justeras under varje operation för att underlätta visualisering av sciatic och inriktningen av hemostatiska tången för krossa B (infälld). Placering av ischiasnerven på den nedre käken av hemostatiska tången precis innan krossa (steg 2.5 ovan). Separata fasciklar är märkta för att visa att de är intill horisontellt, men inte vertikalt under krossa. Även tre FASCicles märks i detta diagram kan man se även fjärdedel fascicle den artikulära gren av peroneal. För en mer detaljerad anatomisk teckning av de förgrenade mönster av ischiasnerven fasciklar distalt om krossa punkten hänvisas till Greenes Anatomy of the Rat, figur 188 ^17.

Figur 2. En kol-märkt kross plats in situ och toluidinblå-färgad, halvfasta tunna sektioner av krossad ischiasnerven. A. Ett exempel på en kross plats in situ (till vänster bakben). Kimrök anger krossa webbplatsen. Asterisken markerar en gren av tibiala nerv som innerverar lår muskulatur och fungerar som en användbar landmärke under krossa kirurgi. Den tibiala uppdelningen av ischiasnerven beskrivs i blått, den peroneal i grönt och Sural i gult. B. Semi-tunna sektioner visar en komplett förälskad utförs med hemostatisk kraftps. C. Semi-tunna sektioner visar en ofullständig krossa utförs med vinklade pincett. I båda bilderna degenererande myelin profiler är markerade med pilar. I panel C pilar markerar exempel på bevarade myelin profiler och ett kluster av besparats axoner. Skala bar är 10 nm.

Figur 3 Hel fästet muskel schematisk och NMJs representativa AC:.. Utsmält bilder av EDL (A), peroneus longus (B), och soleus (C) muskler efter avlägsnande från bakbenet. Visas muskler är från höger bakben. Knä och fotled anatomiska orienteringen ingår också som referens. Senor är färgade vita och beskrivs i en solid svart linje när det sitter på toppen av muskeln. De beskrivs i en streckad svart linje när de sträcker sig under muskeln. Cuts visas i rött streckade linjer.Muskel skalas bort från kapningsställen, såsom indikeras av pilarna blå, och därefter förtunnas. Efter gallring är muskeln separeras från stiften genom att skära kring vad som återstår av den stiftförsedda senor DF. Renderade bilder från hela mount musklerna efter avlägsnande av bindväv och efterföljande gallring. De ändskivan banden beskrivs på varje muskel GH. Soleus Hela mount muskeln fjorton dagar efter ischiasnerven krossa visar åter innerverade (G) och denerverad (H) neuromuskulära korsningar. I dessa paneler, NMJs och axoner och Schwann-celler framkallas som beskrivits ovan i avsnittet 5.5.1. Acetylkolinreceptorer är röda, axoner grönt och Schwann cell bearbetar blå. I panel G, pilarna indikerar områden av NMJ som har åter-innerverade av en axon. I panel H pilspetsar visar GAP-43 positiva Schwann cell processer. Notera avsaknaden av axoner. Skala bar är 10 nm.

Discussion

Vi har presenterat en metod för att erhålla ett tillförlitligt komplett ischiasnerven krossa med exakt markering av krossa webbplatsen. Som tidigare nämnts är ischiasnerven krossa en gemensam modell av perifer nervskada hos möss och råttor. Även om varje metod för att krossa har sina fördelar och nackdelar, fann vi denna metod fram en komplett förälskad som lätt var märkt med ett minimum av särskild utrustning (t.ex. särskilda klämmor etc).

Krossa Metoder

Den vanligaste instrument som används för mus ischiasnerven krossa är nr 5 vinklade pincett. Även om det är möjligt att få en komplett förälskad med den här metoden, fann vi att detta instrument fram en variabel förälskad (för lite kraft som lämnar skonas axoner eller för stora att riva sönder nerven), särskilt i händerna på en ny användare.

Andra mindre vanliga metoder som används för att framställa krossa innefatta små aneurysmklämmor, tänger kyldes i flytande kväve och specially tillverkas, kalibrerade, icke-tandade klämmor ^9,12,5,7. Var och en av dessa instrument kan säkert ge en hel förälskad. Vi valde hemostatiska tång eftersom instrumentet är lätt att få, ger en tillförlitlig krossa, och möjliggör tydliga markering av trängseln webbplatsen. En nackdel med de hemostatiska tången är att vi inte lätt kan mäta den kraft som produceras under kross. Men när provas, en hemostatiska tång ger ett tillförlitligt sätt en komplett krossa, och kan lätt bytas ut av en identisk pincett om pincetten skadas.

Oavsett den valda metoden för att utföra en krossa, kanske den mest kritiska delen av krossade förfarandet är att kontrollera fullständigheten av nerv krossa. Detta är särskilt viktigt i händerna på en roman användare. Semi-tunna analys av nerv distalt om skadan webbplats (figur 2) ger en enkel metod att göra det och kan avslöja en hel förälskad (figur 2, panel B) eller en ofullständig krossa (figur 2, panel C).

18. Men längre krossa gånger eller krossar som väsentligt försämrar Schwann cell endoneurium kommer att förändra hastigheten och / eller framgång av förnyelse.

Märkningsmetoder

De två fungerande metoder för kross plats märkning än pulveriserat kol är en 10-0 suturen genom epineurium av ischiasnerven ^13,19 och FluoSpheres produceras av Molecular Probes, Eugene, OR ¹ in vivo regenerering i YFP muslinjer ^1. För våra syften vi hittade kolet märkningen tillräcklig och billig, med den extra fördelen av att vara lätt ses i efterföljande semi-tunna eller elektronmikroskop utvärdering. Dessutom har vi funnit att kol-märkning kvarstår i minst sex veckor vilket gör den lämplig för längre varaktighet experiment.

Analys av återhämtning efter Crush

En fullständig undersökningning av post krossa förnyelse kombinerar funktionella, elektrofysiologisk och morfologiska bedömningar ^5,16. Morfologiska bedömningar efter förnyelse är kanske den vanligaste. Dessa bedömningar kan delas upp i dem som bedömer latens av tillväxt, graden av axonal tillväxt och specificitet reinnervation ^16. I denna rapport har vi presenterat en hel fäste muskel förfarande som kan användas för att snabbt bedöma morfologisk regenerering (Figur 3). I denna analys denerverade NMJs märkta av alfa-bungarotoxin och Schwann cell GAP-43 kvantifieras och jämförs med nytt innerverade korsningar som märkta av neurofilament, SV2, och alfa-bungarotoxin. GAP-43 markant uppregleras av Schwann celler efter denervering och trevligt identifierar denerveras terminal Schwann celler vid den neuromuskulära förbindelsen ^20. Även GAP-43 uttrycks av axoner, skiljer samtidig användning av neurofilament lätt GAP-43 positiva axoner från Schwann celler. Vidareeftersom NMJs djupt i muskeln inte kan lätt märkas genom antikropp (jämfört med den lilla molekylen alfa-bungarotoxin) Schwann-cell GAP-43-immunoreaktivitet bekräftar allt den denerverade statusen av en neuromuskulära förbindelsen och förbättrar noggrannheten vid räkning denerverade NMJs.

Denna metod ger en enkel och effektiv metod för att bedöma reinnervering statusen för hela muskeln ändskivan bandet på en gång. Andra har använt din-1-fiskeripolitiken (23) / S100-GFP möss som uttrycker cyan fluorescerande protein i axoner och GFP i Schwann-celler att följa re-innervation av de främre tibialis efter ischiasnerven krossa ^2. En varning bör noteras, dock. Denna metod förlitar sig neurofilament och SV2 immunoreaktivitet för att kvantifiera åter innervation. Det är möjligt att Axon utväxt kan ske utan hinder, men efterföljande uttryck SV2 kan fördröjas ^21. Därför, i vissa experiment är det viktigt att bekräfta att fördröjd regenerering och inte d.elayed presynaptisk uttryck för SV2 (dvs. presynaptisk differentiering) står för en observerad fenotyp.