Summary
GFP transgenik sıtma parazitleri ve bu organ içinde parazit hareketlilik ve kan akımının ölçülmesi ile dalak intravital mikroskobi gerçekleştirmek için yöntem gösteriyor.
Abstract
Parazit-konak etkileşimleri 1,2 bilgisine deneysel kemirgen sıtma modelleri intravital mikroskopi gelişiyle büyük ilerlemelere yol açmıştır. Böylece, deri lenf düğümleri 3, 4 cilt parazit tam gelişimi ve hepatosit-türevli merosome göçü sağlamak için bir oluşum içine öncesi eritrosit aşamaları sırasında, sıtma parazitleri in vivo görüntüleme aktif giriş parazitlerin ortaya . 5 kan akışı içine merozoites bırakın. Ayrıca, bireysel eritrositler parazitlerin gelişme son zamanlarda 4D görüntüleme ile belgelenir ve sıtma 6 protein ihracat meydan olmuştur . Böylece, intravital görüntüleme Plasmodium gelişiminde önemli olaylar bizim kökten değişmiştir. Ne yazık ki, dalak, önemli bir lenfoid organ aracılığıyla sıtma parazitleri dinamik geçiş çalışmaları zarif bulaşmış kırmızı b temizlemek için adaptelood hücreleri teknik kısıtlamaları nedeniyle eksiktir.
Balb / c farelerde sıtma Plasmodium yoelii fare modeli kullanılarak, dalak intravital görüntüleme uygulanması ve sırasında kırmızı hamuru fibroblastik kökenli bariyer hücreleri rapor diferansiyel şekillenmesi ve bağlılığı, parazitlenene kırmızı kan hücreleri (pRBCs ) P.yoelii 17XL ölümcül bir parazit hat 7 ile enfeksiyonlara karşı öldürücü olmayan parazit hat P.yoelii 17X ile enfeksiyon gibi. Bu sonuçlara ulaşmak için, ImageJ özgür yazılım kullanarak belirli bir metodoloji karakterizasyonu tek pRBCs hızlı üç boyutlu hareketi sağlamak için geliştirilmiştir. Bu protokol ile elde edilen sonuçlar, dalak parazitlerin hızı, yönlülük ve ikamet süresi belirlenmesinde izin, tüm parametreler in vivo olarak bağlılık adresleme . Buna ek olarak, kan akışını intravital mikroskopi kullanılarak kantifikasyon ve farklı kullanımı için metodoloji raporferent, karmaşık dalak mikrosirkulasyonu yapısını anlamak için renklendirme ajanları.
Etik bir bildirimde
Tüm hayvan çalışmaları Barcelona CEEA-UB (: 5429 Protokolü DMAH) Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylanmış kurallar ve protokoller uyarınca, Barselona Üniversitesi hayvan tesislerinde yapıldı. Charles River Laboratuvarları yaş 6-8 hafta Erkek Balb / c farelerde elde edilmiştir.
Protocol
Bu yöntem, 7 bildirilen araştırma kullanılmıştır .
1. Yeşil floresan proteini (GFP) transgenik parazitler Hayvan enfeksiyon
- 17XL ve 17X P. yoelii-GFP transgenik hatları, aynı vektörler kullanarak hedeflemesi stratejisine ve protokoller P. için başka yerlerde açıklandığı üretildi berghei 8. Onlar her yerde organizatörü P. altında GFP 9 mutant varyant 3 ifade tüm eritrosit içi gelişim döngüsü sırasında sitoplazmada parazit GFP kurucu ifade yönlendirir berghei uzaması faktör 1 (Pbeef1a).
- P. parazitlenene, kırmızı kan hücreleri (pRBCs) ile hayvanların intraperitoneal enjekte % 5-10 parasitemia donör farelerin kuyruk kandan elde edilen ve PBS içinde seyreltilmesi yoelii-GFP transgenik hatları 17XL ve 17X. % 1 gün 3-enfeksiyonu sonrası periferik parasitemia ulaşmak için 5x10 5 pRBCs / fare bir doz kullanın(pi).
- Aynı gün 3 pi, Giemsa boyama ve 100x petrol amacı ile hafif bir mikroskop altında gözlem ile takip kuyruk kan bir damla kan yayma yaparak, her iki parazit çizgiler ile enfekte farelerde bu parasitemia olup olmadığını kontrol edin. Parasitemia yaklaşık 300 eritrositlerde üç optik alanlarında, toplam eritrosit üzerinde pRBCs yüzdesi hesaplanarak tahmin ediliyor.
- FITC işaretli eritrosit ile enjekte Kontrol hayvanları, bu hücrelerin, normal dalak hareketi karakterize etmek için kullanılabilir.
2. FITC ve enjeksiyon hayvanları kontrol etmek için kırmızı kan hücrelerinin Etiketleme
- 200 ul Balb / c fare kalp ponksiyonu ile toplayın, toplam kan 1 ml PBS içeren tetraasetik asit (EDTA) (100 g / L, pH 7.4) etilen diamin ve PBS / EDTA RBC pelet (0.1 g / yıkama L, pH 7.4) oda sıcaklığında (RT) için 300 xg (dk) 5 dakika santrifüj yoluyla.
- 300 ve 200 ul RBC pelet yeniden süspansemu, FITC (10 g / L) içeren PBS / EDTA (0.1 g / L, pH 8) ve yavaşça sallanarak karanlık oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe l. Bu süreden sonra, süpernatantı kaldırılır ve hücrelerin beş kez PBS / EDTA (0.1 g / L, pH 7.4) (300 xg, 5 dak, RT) yıkanır.
- In vivo deneyler için, dolaşımdaki% 1 FITC-eritrositlerde ulaşmak için 10 ul 200 ul PBS FITC etiketli RBC pelet sulandırmak ve Balb / c fare intravenöz enjekte.
3. Cerrahi işlemler
- 100 mg / Ketamin kg ve 5 mg / kg midazolam başına doz hayvanın ağırlığına göre oluşan enjektabl anestezi hazırlayın. Fare intraperitoneal tek doz anestezik enjekte edilir. Fare tam zamanlı anestezi sağlamak için her 30 dakikada bir dozun yarısı Readminister.
- Fare sıcak tutun ve fare (genellikle 5-20 dakika sonra) tamamen uyuşturuluyor geçmeden önce ayak pedi pinching olduğunu doğrulamak.
- IçinDeney sırasında maddelerin intravenöz kolaylaştırmak, 27G kanül kullanarak fare kuyruğu ven cannulate. Iğne, serum fizyolojik tampon 20-50 ul enjekte ederek iyi damar içine yerleştirilmiş olduğunu kontrol edin ve bant ile yapıştırın. Engellemek isteyen olursa, upstream ven kanülasyonu tekrarlayın. Hava kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olun.
- Cilt ve kas, hayvanın sol dorsal tarafında küçük bir kesi ile dalak alt parçası Açığa. Daha az nefes hareketi gözlenir dalak yerleştirin ve fare saç ve sulu temiz tutmak için maruz kalan yüzey PBS geçerlidir.
- Siyanoakrilat yapıştırıcı ile görselleştirme izin dalak çevreleyen cilt 60x24mm bir kapak kayma (Süper Tutkal-3 Loctite) Mühür.
4. Dalak yaşam parazitler görüntüleme
- Leica TCS-SP5 konfokal mikroskop (Leica intravital mikroskopi deneyleri yapılmıştırSun Microsystems, Heidelberg, Almanya), sıcaklık kontrolü ile bir kuluçka sistemi, APO 63x gliserol daldırma objektif lens (NA 1.3), 8000 satır / s ve bir Argon (488 nm) ve HeNe (594 nm, 633 nm) rezonans tarayıcı ile donatılmıştır lazerler. Mavi diyot (405 nm) ve diyot-pompa-solid state (561 nm) gibi ek lazerler, Tablo 1'de yer alan sondalar, uyarma için gerekli olabilir.
- Mikroskop sahnede hayvan kapak kaymış dalak hedefi aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Dalak mikrosirkulasyonu yapısı genel görünümü isteğe bağlı olarak 20x objektif kullanılarak görüntülendi olabilir. RBC yansıması kontrast, daha sonra yüksek büyütmeli görüntü farklı ilgi bölgeleri seçmek için yararlı olacaktır.
- Doku otofloresans kullanılarak 63x gliserol daldırma objektif lens ile ilgi seçilen bölgelere odaklanın. GFP parazitler dalak farklı alanlarda geçerken görülmektedir.
- Floresans iki farklı cha3.0 Airy birimleri iğne deliği ile nnels (FITC / GFP ve doku otofloresans 488/570-630 nm eksitasyon / emisyon dalga boyu 488/505-580 nm). Kan damarsal (bkz. Tablo 1) etiket floresan boyalar ile birlikte RBC yansıması (488/480-495 nm), görüntülü ve kan akışını deneyler aşağıda açıklanan bölge hakkında ek bilgi almak için kullanılır.
- 8 kHz hızında organ üç boyutluluğu nedeniyle 8 mm derinliği kapsayan Z-yığınlar, 1.5 dakika videoları oluşturmak için beş üzerinden görüntü yakalayın.
- Kantitatif analiz için dalak farklı bölgeleri Video kaydetme.
5. Dalak ve kan akışını ölçmek için görüntü elde mikrovaskuleterini intravital mikroskopi
- Izotonik serum fizyolojik içinde çözünmüş Vital floresan problar damarsal ve kazanç içgörü dalak yapıya görüntü için deney sırasında kuyruk ven enjekte edilebilir. Bir listeTablo 1 10 problar ve bunların uygulama sunulmaktadır.
- Floresan dekstran ile vasküler sistem etiketlemek için, dekstran tuzlu tampon 100 ul Texas Kırmızı ile etiketli 70 kDa 1 mg hazırlar.
- Görüntülü hayvan floresan dekstran enjekte kanüllü kuyruk ven kullanın.
- Optik alanında rotasyon (hızını etkileyen), lazer tarama yönünü, gemilerin yatay olarak ayarlayın. Geminin merkezi lümeninde tarama modları xy ve xt hattı kullanın. 512x512 piksel görüntü elde etmek için 8 kHz hızında bir hat 32 ortalama ile çift yönlü tarama kullanın.
- Üç farklı kanal (uyarma / emisyon dalga boyu 488/505-580 nm, 594/605-660 nm FITC / GFP, dekstran-Texas Red ve eritrosit yansıması, sırasıyla 488/480-495 nm) gemiler görüntüler elde.
- Dalgalanmaları telafi etmek için farklı çaplarda ve kalp döngüsü içinde farklı aşamaları ile gemilerin görüntüleri çekmek. Bu görüntülerde, hareketli hücreler kaynaklanan çizgiler, kan akışını 11 ölçmek için kullanılır .
6. Görüntü işleme ve ImageJ yazılımı kullanarak parazit hareketlilik kantitatif analizi
- ImageJ yazılımı (sürüm 1.39o, Wayne Rasband, NIH, kullanılarak oluşturulan görüntü sırası bir gerçek zamanlı video oluşturun www.macbiophotonics.ca ).
- "Xyzct" dizisi ve ayrılan kanallar tutmak ImageJ "lif" dosyasını açın.
- DblvoxelX-voksel genişliği dblvoxelY-voksel yükseklikte, dblvoxelZ-voksel derinlemesine ve ardışık Z-kare arasında ve yığınlar arasında çerçeve aralığı: meta veri dosyası bazı faydalı bilgiler kayıt olun. Bu bilgiler, kalibrasyon için kullanılır.
- Çıkart otofloresans GFP-parazit görüntüleri (kanal 1) (kanal 2). Gaussian Blur = 1 ile görüntüleri Filtresi. Lütfen görüntüler gaussian blur filtre kullanarak YAYINLAR için ilan gerektiğini hatırlamakns. "Animal1_m1_substract.seq" dosyasını kaydedin.
- A dan Z ye renk kodlu video, hızlı hareket eden parçacıklar ve Z-hareket karakterizasyonu tek parçacık belirlenmesini kolaylaştıracaktır olarak parazit hareketlilik kantitatif analiz için destekleyici materyal olarak oluşturulur.
- Zaman Z ve dördüncü boyut olan üçüncü boyutun, Resim 5D yığını dönüştürün. Her Z ve kaplama için farklı bir renk verin.
- Z-renk kodlu video oluşturmak için tüm zaman dilimlerinde üzerinde maksimum şiddeti kullanarak tüm Z Projesi. "Animal1_m1_Z_color.avi" olarak kaydedin.
- Ikamet kare sayısı (1'den 10) göre ilk 10 kare video görünür tüm parçacıkların sınıflandırılması ve etiket. Her video, 20 parçacıklar elde edilen oranlarda izlenir. Toplam 120 parazitler altı video / hayvan dalak farklı bölgeleri temsil eden kullanarak, 3 hayvan sayısal olacaktır.
- Her Z ikamet çerçeveleri Raporuve sayısal olmak için tüm parçacıklar için tüm film boyunca.
- 4D (x, y, z, t) MTrackJ eklentisi (E. Meijering tarafından yazılmış) kullanarak parçacıkların manuel izleme yapın. Resim 5D olarak "animal1_m1_substract.seq" dosyasını açın ve piksel genişliği, yüksekliği, derinliği (mikron) ve yığın aralığı (sn) önce kayıtlı bilgileri kullanarak görüntü özelliklerini ayarlayabilirsiniz. Parça ayarlarını aşağıdaki gibi yapılandırın: "bir dahaki sefere taşımak" ve "geçerli yerel imleç parlak centroid/25x25pixel". Görüntüleyerek yapılandırın: "menşe göstermek", "show görüntü", "aktif parça görünümünü göstermek", "şimdiki zaman noktasında izlemek sadece göstermek", "mevcut kanalların mevcut sadece parça göster".
- Her bir partikül için bir parça eklemek. Deplasman 6 mikron (bir pRBC için ortalama çapı) daha yüksek olması durumunda Z-ekseni hareketi düşünün. En fazla 100 kare bir parçacık izleyin.
- X, y, z ve parça "animal1_m1_p1" olarak ölçülen t koordinatları. Xls kaydedin.
- Deplasman için Önlemler (D = SQRT ((x son-X örneğe cilalama) 2 + (y-y son örneğe cilalama) 2 + (z final z örneğe cilalama) 2), yol uzunluğu (P = Σ n = 0 → son SQRT ((x n +1-x n) 2 + ( y n 1 y n) 2 + (n her pozisyon paletli belirten z n +1-z n) 2), ortalama hız ve ikamet zamanı, x, y, değerleri kullanılarak hesaplanabilir z, t kalibre takip koordinatları kayıtlı verilere göre parçacıkların Directionality 1 belirten yönettiği hareketi ve 0 belirten ölçülü hareket 12 yakın değerlerine yakın değerlere sahip, deplasman vs yol uzunluğu bölüm olarak tanımlanır. hesaplamalar için bir şablon içine kolaylaştırılır.
7. Hacimsel kan akışının hesaplanması
- Volumetrik kan akımı Q = V * π * V D v 2 / 4, eritrosit hızı üzerinde kesit bir olarak tahmin edilmektedir.nd D v lümen damar çapı 11.
- V hesaplamak için, parlak bir yansıması (RBC) ve ImageJ yazılımı kullanarak her xt görüntü yeşil floresan (pRBC GFP) gösteren dört parçacık çizgiler gösteren beş parçacık çizgiler açıları (θ) ölçer. Ölçü lümen xy görüntü damar çapı.
- Hız olarak ifade edilir V = 1/tan (θ) * D e / D eritrosit (D e = 6 mm) ve lümen damar çapları normale v.
- Sayısal olarak her gemi için farklı çaplarda ve beş xt görüntüleri en az üç damar.
8. İstatistiksel analiz
- Istatistiksel analiz, arsa yönlülük için, hız ve yoğunluk dağılımları olarak ikamet süresi ortalama ve iki parazit çizgiler arasındaki farklılıkları değerlendirmek için STATA (IC10)-eşitlik-medyan testi kullanın.
9 - Temsilcisi Sonuçlar
Intravital imadalak, GFP parazitlerin ging hareketlilik parazitler iki suşları arasındaki farklılıkları ortaya koymuştur. Tek parazit hareketlilik parametrelerinin nicel analizi, hız, yönlülük eksikliği ve parazitlerin 17X suşu ile enfekte fareler artar kalma süresi azalır belirtti. Ayrıca, hacimsel damarlarında kan akımını suşları 7 arasında değişmemiştir. Teknik prosedürü Şekil 1A sunulmaktadır. Şekil 1B kırmızı hamuru içine zoom ve bir gemi (Şekil 1B, sırasıyla 1 ve 2, yakınlaştırma) için başka bir ile FITC işaretli eritrosit ile enjekte edilen bir fare normal bir dalak bir genel görünümdür. Damarları, 70 kDa Dextran-Texas Red ile birlikte eritrosit yansıması kontrast enjekte edilerek kanıtlanmıştır. Tablo 1'de özetlenmiştir diğer floresan boyalar Hoechst (Şekil 1C, 1D) gibi görüntülü organı hakkında bilgi elde etmek için kullanılabilir.
Gerçek zamanlı görüntüleme, 17XL ve 17X gerginlik parazitlerin Filmler 1 ve 2'de sunulmuştur.Bazı 17X-pRBC yuvarlanma daire davranışı gösteren (Video 2). Hareketlilik parametrelerinin Kantitatif analiz Z kodlu renkli görüntüler yardımı ile bireysel parazitlerin izleme yoluyla elde edildi. Şekil 2A çevrilidir parçacık farklı düzlemlerde hareket görünen bir Z kodlu renk yığını, Z-projeksiyon gösterir. Şekil 2B ve 2C, sırasıyla, 17X ve 17XL enfeksiyon farklı parazitler için parçalarını temsil eder. Yönlülük ve sayısal tüm parçacıkların ikamet süresi, 2D ve 2E Şekil parazit nüfusun sırasıyla bir yoğunluk dağılımı haritası, olarak sunulmaktadır. Intravital mikroskopi kullanılarak dalak kan akışını izlemek için eritrosit hareketi sonucu damarların merkezi lümen xt görüntüleri elde çizgiler hızı 11 hesaplamak için ölçüldü. Görüntüler ilgili xt line-scan (Şekil 2G) ile bir geminin xy tarama (Şekil 2F).
| Floresan Probe | Yerelleştirme | 1 foton Tahrik olma (nm) | 2 foton Tahrik olma (nm) | Algılandı emisyon (nm) | Miktar / fare ağırlığı |
| Hoechst 33.342 | Membran-permeant DNA bağlayıcı prob. İntravenöz enjeksiyondan sonra (canlı ve cansız) tüm hücrelerin çekirdekleri etiketler. | 405 | 800 | 410-480 | 12.5 g / Kg |
| Propidium iyodür | Membran geçirgenliği olmayan DNA-bağlayıcı prob. Bu tehlikeye membran (apoptotik ve nekrotik hücreler) hücrelerinin çekirdekleri etiketler. | 561 | 800 | 570-650 | 250 mg / Kg |
| 70.000 mol wt Dextran-Floresan (FITC, Texas Kırmızı) | Akışkan-faz plazma aksine artırır işaretleyici. | FITC 488 Texas Red 594 | 800 | 500-540 600-650 | 50 mg / Kg |
| Sodyum floresein | Plazma kontrastı Dökme sıvı-fazlı albümin işaretleyici. | 488 | 800 | 500-540 | 2 mmol / Kg |
| Evans Blue | Plazma kontrastı Dökme sıvı-fazlı albümin işaretleyici. | 633 | nd | 645-700 | 20 mg / Kg |
| Rodamin R6 | Vital prob aktif mitokondri birikir. Intravenöz enjeksiyon sonrası endotelin ve dolaşımdaki beyaz hücreler etiketler. | 561 | 800 | 570-650 | 25 mg / Kg |
| Fluospheres-1micron çapı | Boncuk fagositik aktiviteye sahip hücreler tarafından uptaken. | 488 | 800 | 500-540 | nd |
| Alexa488 etiketli fibrin IIβ zincir spesifik antikor | Prob bu etiketler fibrin IIβ zinciri | 488 | 800 | 500-540 | 0.3 mg / Kg |
Tablo 1 intravital mikroskopi için Floresan problar. , In vivo olarak dalak etiketlemek için kullanılan farklı lokalizasyonu ile Vital floresan boyalar. Tahrik olma / emisyon (Exc / em), tek foton (ya da iki-foton mikroskopi) ile kullanılmak üzere değişmektedir. Belirtilen doz 0.1-0.2 ml serum fizyolojik tampon çözülür ve fare kuyruğu vene enjekte edilir. [Nd: Bu çalışmada belirlenmiştir.
Şekil 1 dalak intravital mikroskopi. A. Leica TCS-SP5 konfokal mikroskop mikroskop sahne üzerine yerleştirilen tek bir fare ile. Fare maruz kalan ve mühürlü bir kapak kayma ile dalak alt parçası vardır. B. FITC işaretli eritrosit ile enjekte olmayan enfekte hayvanın dalak bir temsilcisi alanı Resim veDamarsal görselleştirmek için 70 kDa Dextran-Texas Red. Yansıma (sarı), Dextran'ın (mavi) ve FITC-eritrosit (yeşil) gösterilmiştir. Blow-up beyaz kutular açık dolaşımı (1) ve yakın dolaşımı (2) alanları temsil eder. Açık dolaşım (C) ve 70 kDa dekstran (kırmızı) ve Hoechst 33.342 (mavi) ile boyandı yakın dolaşımı (D).
Şekil 2 parazit hareketlilik ve kan akımı AC Kantitasyonu. Parçacık hareketi dört boyutlu (4D) kantitatif analiz, renk kodlu görüntü işleme kullanarak kolaylaştırılır A. Takip beş farklı derinliklerde maksimum yoğunluğu projeksiyon kullanılarak temsil Z kodlu renkli görüntüler, derinlemesine bilgi ile yapıldı . Beyaz dikdörtgen bir zaman noktasında farklı Z aynı parçacık temsil eder. Farklı pozisyonları satın alınması arasındaki zaman ihmaller nedeniyleFarklı bir Z görüntüler. Derinlik kodu: sarı (0 mikron), portakal (2 mikron), pembe (4 mikron), mavi (6 mikron), yeşil (8 mikron) B parçacık hareketi, her zaman aralığı ile C. Zaman projeksiyonları renkli: gri (0-2,4 sn), camgöbeği (2,4-4,8 sn), kırmızı (4,8-7,0 sn), kırmızı (7,0-9,4 sn) ve sarı (9,4-11,8 sn). Beyaz çizgi MTrackJ D, E. yönlülük değerleri (D), GFP parçacıkların yoğunluğu Dağıtım ve 17X (11,8 s) (B) ve 17XL (4,8 sn) (C) GFP parazitler parçacıkların 4D manuel izleme temsil kalma süresi (E). Veri-medyan eşitlik-testi ile analiz üç bağımsız deneyler parazitler ve 100 FITC etiketli eritrositlerde her satırı 120 parçacıklara tekabül etmektedir. 17X/17XL/FITC-RBCs medyan 0.53/0.75/0.85 (D) ve 4.61/0.67/0.9 sn (E) iki çizgi arasındaki farklar
Filmler 1 ve 2 17XL (1) veya 17X ile enfekte fare dalak Time-lapse intravital mikroskopi görüntüleri (2) 10% parasitemia GFP-transgenik parazitler (Z maksimum projeksiyon). Parazit ve doku otofloresans sırasıyla yeşil ve kırmızı olarak gösterilmiştir. Ölçek çubuklar 10 mikron temsil eden ve zaman aralığı sn.
v "> Movie 1 izlemek için buraya tıklayın.
Film 2 izlemek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu kemirgen sıtma modeli dalak intravital mikroskopi uygulanması olasılığı şu ana kadar teknik değerlendirmeler için bir "kara kutu" nedeniyle kabul edilmiştir bu organ sayesinde dinamik geçiş parazitleri araştıran açtı. Burada, büyük bir çaba, tek ve nüfus düzeyleri farklı parazit hatları karşılaştırmalı analizi sağlayan kantitatif bir yöntem uyarlamak için konulmuştur. Hızlı ve yavaş önce sıtma 3,5 görüntülenmiştir diğer doku ve hücrelerinin aksine, görüntüleme yoluyla pRBCs dalak geçit organın üç boyutluluğu ve bölümlendirme, farklı dolaşım varlığı dikkate almak gerekiyor akı 13, yanı sıra hızlı eritrosit hızları. Bu amaçla, online bulunabilirlik ImageJ yazılımı kullanarak belirli bir metodoloji populatio satırları arasındaki tek parazit izleme, hareketlilik analizi ve karşılaştırma sağlamak için geliştirilmiştirn seviyesi. Ancak, bu bağlamda tek parazit tespiti ve izleme çözer otomatik yazılım uygulama hala ihtiyaç vardır. Notu, parazit hareketlilik tanımlamak için kullanılan parametreler daha önce lenfosit işe alma ve in vivo 12,14,15 yapışma rapor diğer çalışmalarda tarif edilmiştir. Böylece, bu yöntem ve parametreler malarya bağlılığın in vivo çalışmalar için yeni bir araç olarak düşünülmelidir. Gelecekte, floresan muhabiri genleri farklı hücrelerde eksprese eden transgenik farelerin görüntüleme enfeksiyon ve parazit-dalak hücre etkileşimleri Immunobiology içgörü kazanmak için bu teknolojiyi kullanır. Ayrıca, bu modelde görüntü çift enfeksiyonlara GFP dışında floresan belirteçler ifade transgenik parazitlerin nesil birlikte kullanıldığında olabilir.
In vivo görüntüleme, ev sahipleri içinde parazitlerin dinamik etkileşimi incelemek için güçlü bir araçtır . Ancak, eskihücre hareketliliği etkileyen, dikkate alınması gereken ist çeşitli faktörler. Farklı Plasmodium suşları ile enfeksiyona yanıt olarak mimari dokusu değişiklikler, hücre, doku 7,16 ve kırmızı kan hücreleri, hem de hematokrit veya diğer hematolojik parametrelerde değişiklikler reolojik özellikleri ile geçiş ve etkileşim değiştirebilirsiniz, kan akışını etkileyebilir. ve dolayısıyla hücrelerin doku ile etkileşimi. Bu nedenle, biz öngörülen prosedüre damar kan akışını analiz etmek önerilir. Hematokrit, reticulocytemia ve parazit tropizm enfeksiyonları 7 hem de karşılaştırılabilir herhangi bir karıştırıcı etkileri önlemek için, biz bir zaman noktasında bulaşmış farelerin dalak görüntülenmiş.
Bu tekniğin çözünürlük erken zaman noktalarında (<% 1 parasitemia) dalak geçerek tek floresan hücrelerin gözlem sağlar. Ancak, parazitlerin dinamik davranışı kantitatif analizi yapıldı% 1 parasitemia, pRBCs, yeterli sayıda, tek bir hücre hareketi izlenmesine izin süresi sona erdikten dalak geçerek gözlendi. % 10 parasitemia hayvan karşılık gelen 1 ve 2, sinema, dalak her enfeksiyon yoluyla parazit pasajın genel bir model gösterdi; Ancak, burada tek hareketli hücreler kantitatif analiz,% 1 parasitemia hayvan filmleri yapıldı hücreleri kolayca takip edilmektedir. Bulaşmış kırmızı kan hücrelerinin hızlı bir şekilde üç boyutlu hareketi nedeniyle, farklı floresan yoğunlukları, lazer farklı derinliklerde veya delinebilirliğine isnat edilebilir olarak, parazitin gelişim evreleri arasında ayrım yapamaz olabilir.
Bu işlem ile, floresan hücreler dalak subkapsüler bölgesi, ağırlıklı olarak kırmızı pulpa 17 oluşan görüntülenebilir. Plazma boyalar kullanarak, kırmızı hamuru / hızlı, açık ve kapalı / yavaş dolaşım arasındaki ayırt olabilir. Diğer çalışmalarson teklif daha fazla doku penetrasyonu ile konfokal 18 veya iki foton mikroskopi 19 ile beyaz kağıt hamuru, T-hücrelerine floresan görüntüleme sahip. Bu, off-line analiz ve görüntülü bölge ex vivo karakterizasyonu verileri doğru yorumlamak için önemli bir faktördür. Böylece, dalak mikrosirkulasyonu yapısının yanı sıra, belirli hücreleri ve yapıları etiketi probların gelişimi aydınlatmak için çabalar, parazit-konak etkileşimleri çalışmayı kolaylaştırmak için önem arz etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
A. Bosch (Konfokal Birimi, CCIT-UB, IDIBAPS), GFP transgenik parazitler bağış J. Burns, S. Graewe ve V. Heussler sıtma parazitleri intravital mikroskopi başlangıç eğitimi ve sürekli giriş için özellikle teşekkür ediyoruz görüntü analizi ve teknik yardım için ölçümlerini ve P. Astola yardım. Biz R. Tous I. Caralt ve video üretimi için teşekkür ederiz. MF Katalonya Genellik bir yüksek lisans bursu bir alıcı. HAP bir ICREA araştırma profesörü. HAP laboratuvar, hibe anlaşması N çerçevesinde Avrupa Topluluğu Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) ° 242.095, Özel Vakfı Cellex (Katalonya, İspanya) ve İspanyol Bilim ve Yenilik Bakanlığı (tarafından finanse edilmektedir SAF2009-07760).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
| Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer Pharma GmbH | 631028 | |
| Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
| 70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | |
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
| Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |
References
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
- Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).
- Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. Imaging malaria sporozoites. in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).
- Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).
- Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids. Science. 313, 1287-1290 (2006).
- Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions. Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).
- Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape. Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).
- Linden, M. vander, R, A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein. 173, 33-38 (1996).
- Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Bowdler, A. J. The complete spleen. , Totowa. Humana Press. (2002).
- Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).
- Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).
- Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier. Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen. J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).
- Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
