Summary
Type B gelatine-baserede manipuleret nanovectors system (gensen) blev udviklet til systemisk gen levering og transfektion i behandlingen af kræft i bugspytkirtlen. Ved ændring med epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) specifikke peptid på overfladen af nanparticles, kunne de mål på EGFR receptor og frigivelse plasmid under reducerende miljø, såsom høj intracellulær glutathion koncentrationer.
Abstract
Mere end 32.000 patienter diagnosticeret med kræft i bugspytkirtlen i USA om året, og sygdommen er forbundet med meget høj dødelighed 1. Presserende behov for at udvikle nye klinisk-oversætbare terapeutiske strategier, der kan forbedre den triste overlevelse statistik over kræft i bugspytkirtlen patienter. Selv om genterapi i kræft har vist en enorm løfte, den største udfordring ligger i udviklingen af sikre og effektive levering system, hvilket kan føre til en vedvarende transgenet udtryk.
Gelatine er et af de mest alsidige naturlige biopolymer, i vid udstrækning anvendes i fødevarer og farmaceutiske produkter. Tidligere undersøgelser fra vores laboratorium har vist, at type B gelatine kunne fysisk indkapsle DNA, der bevarede den supercoiled struktur plasmid og forbedret transfektion effektivitet ved intracellulære levering. Ved thiolation af gelatine, kunne sulfhydryl grupper indføres i polymer og ville fOrm disulfid-bro inden for nanopartikler, der stabiliserer hele komplekset, og når disulfid-bro er brudt på grund af tilstedeværelsen af glutathion i cytosolen, ville nyttelast blive frigivet 2-5. Poly (ethylen glycol) (PEG)-modificeret Gens, når det administreres i det systemiske kredsløb, giver lang-cirkulation gange og fortrinsvis mål til svulsten masse på grund af den hyper-gennemtrængelighed af de nydannede kar gennem den øgede permeabilitet og fastholdelse virkning 6. Undersøgelser har vist, overekspression af den epidermale vækstfaktor receptor (EGFR) på Panc-1 menneskets bugspytkirtel adenocarcinom celler 7. For aktivt at målrette kræft i bugspytkirtlen cellelinie, EGFR specifikke peptid blev konjugeret på partikel overfladen gennem en PEG spacer. 8
De fleste anti-tumor genterapier er fokuseret på administration af tumor suppressor gener, såsom vildtype p53 (WT-p53), for at genoprette den pro-apoptotiske funktion i cellerne 9 10. Inden for bugspytkirtelkræft, har de fleste celler mutationer i p53-protein, der forårsager tab af apoptotiske aktivitet. Med introduktionen af WT-p53, kunne apoptose repareres og yderligere udløser celledød i kræftceller 11.
Baseret på ovenstående grundlag, har vi designet EGFR målrettet peptid-modificerede thiolated gelatine nanopartikler til WT-p53 genet levering og evalueret levering effektivitet og transfektion i Panc-1 celler.
Protocol
1. Udarbejdelse af Plasmid DNA Encapsulated EGFR-Målrettet Gelatine Nanopartikler
- Syntese af thiolated gelatine
- Thiolated gelatine blev syntetiseret som tidligere metode 2-5, ved kovalente konjugation med 2-iminothiolane på den primære amino grupper af type B gelatine. 1 gram af gelatine blev opløst i 100 ml deioniseret vand og inkuberet med 20 mg 2-iminothiolane hydrochlorid ved stuetemperatur i 15 timer.
- Ureageret reagens blev fjernet ved dialyse mod 5 mM HCl-opløsning, efterfulgt af 1 mM HCl-opløsning i 3 timer hver. Renset thiolated gelatine blev frysetørret og opbevaret ved 4 ° C til videre brug.
- Forberedelse af DNA-indeholder nanopartikler
- 200 mg thiolated gelatine blev opløst i vand og pH opløsning blev justeret til 7 ved tilsætning af 0,2 M NaOH opløsning. 1mg DNA blev tilføjet, og forsigtigt blandet med gelatine løsning.
- Nedkølet ethanol blev tilføjet langsomt ind i blandingen, mensomrøring løsning med høj hastighed. Nanopartikler blev dannet, da opløsningsmiddel sammensætning ændret til 75% hydro-alkoholiske løsning.
- Nanopartikler blev yderligere krydsbundet ved langsom tilsætning af 0,1 ml 8% (v / v) glyoxal løsning. Ureageret reagenser var slukkede med 0,5 ml 0,2 M glycin løsning.
- Nanopartikler er ultra-centrifugeres ved 16.000 rpm i 30 minutter. Piller blev vasket med demineraliseret vand to gange og renset nanopartikler blev frysetørret og opbevaret ved 4 ° C.
- Overfladebehandling af nanopartikler
- Nanopartikler blev suspenderet i 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,4) med koncentration på 10 mg / ml og inkuberet med 2 gange vægten af methoxy-PEG-succinimidyl carboxy methyl ester (MPEG-SCM, MW 2.000 Da) eller maleimide-PEG-succinimidyl carboxy methylester (MAL-PEG-SCM, MW 2.000 Da) i 2 timer ved stuetemperatur med langsom omrøring.
- PEGyleret nanopartikler blev indsamlet med ultra-centrifugering ved 16.000 rpm i 30 minutterS. Piller blev vasket med demineraliseret vand to gange og renset nanopartikler blev frysetørret og opbevaret ved 4 ° C.
- MAL-PEG-SCM modificerede nanopartikler blev suspenderet i 0,1 M fosfatbuffer (pH 6,5) med koncentration af 10mg/ml og inkuberes med 10% vægt af EGFR specifikke peptid (YHWYGYTPQNVI-GGGGC) i 6 timer ved stuetemperatur med langsom omrøring.
- Peptid modificeret nanopartikler blev indsamlet med ultra-centrifugering ved 16.000 rpm i 30 minutter. Piller blev vasket med demineraliseret vand to gange og renset nanopartikler blev frysetørret og opbevaret ved 4 ° C.
2. Karakterisering af EGFR-målrettede Nanopartikler
- Partikelstørrelse og zeta potentiale måling
Nanopartikler blev suspenderet i vand med koncentration af 1mg/ml. Suspension blev analyseret ved hjælp af Zetasizer Nano (Malvern Inc). Partikelstørrelse analyse blev foretaget på en spredning vinkel på 90 grader ved 25 °C. Zeta potentiale blev målt til standardparametre af dielektriske konstant, brydningsindeks og viskositeten af vand ved 25 ° C. - Scanning Electron Microscopy
Frysetørret nanopartikler blev monteret på aluminium prøve montere og sputter-belagt med palladium at øge ledningsevne og minimere ophobning af afgifter. Prøverne blev observeret for overfladen morfologi under en Hitachi 4800 felt emission scanning elektron mikroskop på 3 kV. - Electron spektroskopet til kemisk analyse (ESCA)
Frysetørret formulering af kontrol, var PEGyleret og peptid ændret nanopartikler analyseres ved ESCA. Det blev udført på Statens ESCA og Surface Analysis Center for Biomedical Problems (NESAC / BIO), University of Washington (Seattle, WA).- Prøverne blev placeret i Ultra vakuum og udsat til lav-energi x-ray stråle, hvilket fremkaldte en emission af sekundær fotoelektronerne fra overfladen.
- Ved at plotte antallet af afslørede elektroner som funktion af binDing energi, observerede spektrum toppe blev tildelt til hver kemiske komponenter.
- Høj opløsning analyse af C1s spektre blev udført for at bestemme præcise kemiske sammensætning af kulbrinte (CC eller CH på 285mV), ether (CO) på 286.4mV), og carbonyl (C = O til 288,1 mV), og den relative sammensætning af hver funktion, blev bestemt ved arealet under kurven.
- Stabilitet af indkapslet plasmid
Stabiliteten i de indkapslede plasmid DNA blev bekræftet ved at køre ekstraherede DNA på præ-cast geler. Nanopartikler blev fordøjet med 0,2 mg / ml protease indeholdende PBS (30 min ved 37 ° C) og 0,2 E / ml DNAse (10min ved stuetemperatur) hver for sig, samtidigt eller sekventielt. Prøverne blev derefter læsset på 1,2% agarosegel (GP) (E-Gel, Invitrogen, CA) ved en koncentration på 100ng/well i en 18μL mængde pr godt. Naked plasmid blev indlæst som kontrol og gel blev kørt ved 75 V for 30 minutter. Kodak Digital X-ray Specimen (DXS) System blev brugt til at visualisere bands med UV transluminescence. - Bestemmelse af plasmid læsning
Plasmid indkapslede nanopartikler blev afbrudt kl 1mg/ml og fordøjes med 0.2mg/ml protease ved 37 ° C i 30 minutter. Løsningen blev centrifugeres ved 13.000 rpm i 10 minutter, og supernatanten blev indsamlet og testet for plasmid koncentration med Picogreen assay (Invitrogen). Indkapsling ratio blev beregnet ved at dividere de indkapslede plasmid koncentration med den første læsning 0,5% (w / w).
3. In Vitro transfektion Studier i Panc-1 bugspytkirtelkræftceller
- Cellekultur betingelser
Panc-1 og Capan-1 pancreas adenocarcinom cellelinjer blev SKOV3 æggestokkene adenocarcinom cellelinie og NIH-3T3 murin fibroblast cellelinie fra ATCC. Panc-1 og NIH-3T3 blev dyrket med DMEM leveres med L-glutamin, Pen-STREP og 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C og 5% CO 2, mens Capan-1 kræves DMEM leverede 20% føtalt bovint serum.SKOV3 blev dyrket i RPMI-1640 leveres med 10% føtalt bovint serum. - Western blot analyse for EGFR
- Cellelysater blev indsamlet fra 2 millioner celler og analyseret for samlet proteinkoncentration ved hjælp af BCA assay (Pierce). NIH-3T3 blev brugt som negative kontrol, og SKOV3 blev brugt som positiv kontrol for EGFR.
- 10 mikrog af total proteinekstrakt blev kørt på præfabrikerede natrium dodecyl sulfat-polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) system på 135V i 90 minutter.
- Efterfølgende blev gel overføres til PVDF membranen ved iBlot Dry Blotting System (Invitrogen).
- Membranen blev blokeret med 5% fedtfri mælk i Tween-holdige Tris buffer saltvand (TBS-T) i 1 time ved stuetemperatur.
- Membrane blev skåret og inkuberes med 1:1,000 fortynding af primære kanin beta-aktin antistoffer og 1:1,000 fortynding af primære kanin EGFR-antistoffer separat natten over ved 4 ° C.
- Membrane blev derefter vasket to gange medTBS-t og inkuberes med 1:2,000 fortyndinger af sekundært anti-kanin peberrod peroxidase-konjugeret IgG i TBS-T i 1 time ved stuetemperatur.
- Efter skylning overskydende antistoffer med TBS-t og vand, var 4 ml ECL substrat (Pierce, Rockford, IL, USA) tilsættes og inkuberes med membraner i 5 minutter.
- Kemiluminescens bands blev derefter visualiseret ved hjælp af Kodak Digital X-ray Specimen (DXS) System.
- Cellelevedygtighed studier med forskellige formuleringer
- Panc-1 celler blev dyrket i 96-brønds plader ved 10.000 celler per brønd i 200μL af suppleret DMEM natten.
- Vækstmedie blev erstattet med serum frie medier, der indeholder forskellige koncentrationer af nanopartikler med 0, 0,5, 1, 2, 4, 6 mg / ml. 1mg/ml PEI, en kendt cytotoksisk kationiske polymer, blev brugt som positiv kontrol.
- Cellerne blev behandlet med 200μL nanopartikler i 6 timer og derefter erstattet med 20μL MTS reagens og 100μL kompletdyrkningsmedier.
- Når undersøgelsen efter inkubation i 3 timer ved 37 ° C i 5% CO 2, blev absorbansen for formazan produkt målt ved 490nm med BIOTEK SynergyHT pladelæseren (Winooski, VT).
- Den procent levedygtigheden af celler blev udtrykt som forholdet mellem absorbansen af polymer behandlede celler i forhold til negativ kontrol (0mg/ml) ganget med 100 og plottet som funktion af polymer koncentrationer.
- Cell menneskehandel undersøgelser
- Rhodamine B isothiocyanat (RBITC) blev brugt til at konjugat på thiolated gelatine ved reaktion med amin gruppe. Efter dialyse og frysetørring, mærket RBITC thiolated gelatine blev brugt til nanopartikler forberedelse.
- Før desolvation blev 25μL PicoGreen blandet med 1mg plasmidet i 1 minut og mærket plasmider blev føjet til gelatine løsning. Forskellige formuleringer blev foretaget efter den tidligere metode.
- Panc-1 celler blev dyrket i 6-samt plader, der indeholder glas dække-sedlerne med 200.000 celler pis godt. Efter natten vækst blev 2 ml mærket nanopartikler behandlet i hver brønd med koncentration af 1mg/ml i serum frit medie.
- Efter forskellige tidspunkter, fra 15 minutter til 6 timer var medium erstattet med kultur medium, der indeholder 1μg/ml af Hoest 33.342 (Invitrogen) i 15 minutters inkubation ved stuetemperatur. 2 ml 4% paraformaldehyd Løsningen blev udskiftet i hver brønd for at løse celler. Cellerne blev derefter vaskes med PBS to gange.
- Coversilps blev monteret på objektglas. Laser scanning konfokal fluorescens mikroskopi blev brugt til at tage billeder af faste celler.
- Kvalitativ bestemmelse af transfektion effektivitet ved fluorescensmikroskopi med pEGFP-N1 indkapslet nanopartikler
- pEGFP-N1 plasmider blev indkapslet i nanopartikler og suspenderet i serum frie medier med koncentration svarende til 10μg plasmider pr ml for yderligere behandlinger.
- Panc-1 celler blev dyrket natten over i 6-godt plader contaiNing glasafdækning-sedlerne med 200.000 celler per brønd. 2 ml pEGFP-N1 plasmider indkapslet nanopartikler blev behandlet i hver brønd. 20μg af plasmider blev blandet med 20μl Lipofectin, kationisk lipid transfektion reagens, og den blev brugt som positiv kontrol, mens ubehandlede celler blev brugt som negativ kontrol.
- Cellerne blev inkuberet med forskellige formuleringer i 6 timer.
- Medium blev erstattet med dyrkningsmedium og celler blev efter transficeret i 24, 48, 72 og 96 timer.
- Efter post-transfektion, var medium erstattet med kultur medium, der indeholder 1μg/ml af Hoest 33.342 (Invitrogen) og inkuberes med celler i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Dækglas blev monteret på objektglas og udtryk af GFP i cellerne blev observeret af fluorescens mikroskop. Differential interferens kontrast (DIC) og fluorescens billeder erhverves ved hjælp af Olympus BX61 mikroskop og digitale billeder blev behandlet med Image J software.
- pEGFP-N1 plasmider blev indkapslet i nanopartikler og suspenderet i serum frie medier med koncentration svarende til 10μg plasmider pr ml for yderligere behandlinger.
- Panc-1 celler blev dyrket natten over i 6-godt plader med 200.000 celler per brønd. 2 ml pEGFP-N1 plasmider indkapslet nanopartikler blev behandlet i hver brønd. 20μg af plasmider blev blandet med 20μl Lipofectin, kationisk lipid transfektion reagens, som blev brugt som positiv kontrol og ubehandlede celler blev brugt som negativ kontrol.
- Cellerne blev inkuberet med forskellige formuleringer i 6 timer.
- Medium blev erstattet med dyrkningsmedium og celler blev efterfølgende inkuberet i 24, 48, 72 og 96 timer.
- Efter post-transfektion blev cellelysater indsamlet fra hver brønd og analyseret for total proteinkoncentration ved hjælp af BCA assay (Pierce).
- brønds plade blev CoATED med 100μl af 1:1000 fortyndinger af monoklonale anti-GFP antistoffer i hver brønd. Efter 2 timers inkubation, var pladen vaskes med PBS-0,5% (w / v) Tween-80 til 4 gange.
- 300μl TBS blokering buffere blev tilføjet i hver brønd og inkuberes i 2 timer. Så pladen blev derefter vasket med PBS-0,5% (w / v) Tween-80 til 4 gange.
- 30μg af proteiner i hver gruppe blev føjet ind i pladen og inkuberes natten over ved 4 °. Så pladen blev derefter vasket med PBS-0,5% (w / v) Tween-80 til 4 gange.
- 100μl af 1:2400 fortyndinger af sekundært anti-GFP antistoffer i forhold til alkalisk fosfatase blev føjet til hver brønd og inkuberes i 1 time. Så pladen blev derefter vasket med PBS-0,5% (w / v) Tween-80 til 4 gange.
- 100μl alkalisk fosfatase substrater blev føjet til hver brønd og inkuberes i 30 minutter til 1 time. Plate blev målt med BIOTEK Synergy HT pladelæser for absorbans ved 405nm.
- Udtrykt GFP koncentration blev rapporteret som nanogram per milligrams af total protein.
- WT-p53 plasmider blev indkapslet i nanopartikler og suspenderet i serum frie medier med koncentration svarende til 10μg plasmidet pr ml for yderligere behandlinger.
- Panc-1 celler blev dyrket natten over i 6-godt plader med 200.000 celler per brønd. 2 ml af WT-p53 plasmider indkapslet nanopartikler blev behandlet i hver brønd. 20μg af plasmider blev blandet med 20μl Lipofectin, kationisk lipid transfektion reagens, som blev brugt som positiv kontrol og ubehandlede celler blev brugt som negativ kontrol.
- Cellerne blev inkuberet med forskellige formuleringer i 6 timer.
- Medium blev erstattet med dyrkningsmedium og celler blev efterfølgende inkuberet i 48 timer.
- mRNA blev udvundet fra hver brønd ved hjælp af High Pure RNA isolation kit (Roche, Indianapolis, IN), og måles med Nanodrop 2000 (Thermo Videnskabelige, Wilminton, DE).
- RT-PCR blev gjort ved hjælp af Qiagen One-step RT-PCR (Qiagen, Valencia, CA). Primere til p53, Bax, Bcl-2, beta-actin, DR5, Apaf-1, PUMA, blev Survivin syntetiseret af Eurofins MWG operon (Huntsville, AL).
- PCR-produkter blev evalueret med gel elektroforese og pixel af cDNA bands blev analyseret med ImageJ software.
- WT-p53 plasmid blev indkapslet i nanopartikler og suspenderet i serum frie medier med koncentration svarende til 10μg plasmider pr ml for yderligere behandling.
- Panc-1 celler blev dyrket natten over i 6-godt plader med 200.000 celler per brønd. 2 ml af WT-p53 plasmider indkapslet nanopartikler blev behandlet i hver brønd. 20μg af plasmider blev blandet med 20μl Lipofectin, kationisk lipid transfektion reagens, som blev brugt som positiv kontrol og ubehandlede celler varanvendes som negativ kontrol.
- Cellerne blev inkuberet med forskellige formuleringer i 6 timer.
- Medium blev erstattet med dyrkningsmedium og celler blev efterfølgende inkuberet i 24, 48, 72 og 96 timer.
- Kromatin Kondens / membranpermeabilitet / Dead Cell Apoptose Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) blev anvendt til at mærke apoptotiske celler, nekrotiske celler og levende celler med forskellige farvestoffer.
- iCys Forskning Imaging cytometer fra CompuCyte (Westwood, MA) blev anvendt til at analysere og sammenligne apoptose niveauer efter behandling. Baseret på fluorescens mikroskopiske billeder, var intensiteten af alle farver registreres og afsættes mod tæller og procenterne for beregnede forskellige populationer var.
- Sammenlignet med den negative kontrol, hvilket betyder at der ikke var nogen behandling for cellerne blev apoptotiske celler fold ændringer beregnet ud og opført i grafen.
- 3.8.8 Apo-ONE Homogen caspase-07/03 Assay kit (Promega, Madison, WI) blev anvendt til at undersøge pro-apoptotiske aktivitet efter transfektion af WT-p53 plasmid. 1mg/ml PEI blev brugt som en negativ kontrol for at fjerne alle de apoptotiske aktivitet. Efter post-transfektering, blev cellerne behandlet med rhodamine 110, bis-(N-CBZL-aspartylprotease-L-glutamyl-L-valyl-L-asparaginsyre amid, Z-DEVD-R110), som er et substrat af caspase 3 / 7, i op til 18 timer.
- Plate blev målt med BIOTEK Synergy HT pladelæser til fluorescens ved 490/520 nm. Baseret på intensiteten af grøn fluorescens, kunne pro-apoptotiske aktivitet blive evalueret.
4. Repræsentative resultater
1. Syntese og Chatacterization af EGFR målrettede Nanopartikler
EGFR målrettet peptid-modificerede nanopartikler blev syntetiseret da ordningen har vist i figur 1. Nanopartiklerne er udarbejdet af desolvation var præget af partikelstørrelse og zeta potentiale. Den gennemsnitlige størrelse og overflade opladning af partiklerne tilberedt af thiolated gelatinemed forskellige grader af thiolation er anført i tabel 1. Den gennemsnitlige partikel diametre på forskellige nanopartikler var mellem 150-250 nm. Thiolated nanopartikler har mindre størrelse i forhold til gelatine nanopartikler, måske på grund af disulfid-bro dannelsen indeni partikler. Med forskellige overflader modifikationer, har størrelser af nanopartikler steget. Den Zeta potentialerne i forskellige formuleringer var omkring -20 mV. Med SEM analysen blev størrelserne, overflade morfologi og kugleform nanopartikler observeret og svarer til Zetasizer resultat. DNA-loading effektivitet i gelatine nanopartikler og thiolated gelatine nanopartikler var højere end 95% (Tabel 1).
Figur 1. Reaktionsteknik Scheme, der illustrerer overfladebehandling af thiolated gelatine nanopartikler med epidermal vækst factor receptor (EGFR) bindende peptid gennem en poly (ethylen glycol) (PEG) spacer.
Karakterisering af nanopartikler
| Formulering | Nanopartikel Diameter (nm) | Zeta Potential (mV) | Plasmid DNA Loading Virkningsgrad (%) |
| Gel NP | 151,4 ± 23,5 | -17,1 ± 5,23 | 95,6 ± 2,2 |
| SH-Gel NP | 132,6 ± 17,9 | -24,6 ± 5,16 | 97,0 ± 3,8 |
| SH-Gel-PEG | 179,0 ± 30,9 | -22,3 ± 9,50 | 95,8 ± 6,5 |
| SH-Gel PEG peptid | 230,8 ± 41,5 | -18,1 ± 4,02 | 94,8 ± 5,1 |
TaBLE 1. Partikel størrelse, overflade opladning, og plasmid DNA indkapsling effektiviteten af kontrol og EGFR-målrettede gelatine og thiolated gelatine nanopartikler.
Høj opløsning C 1S scanninger af elektron spektroskopi til kemisk analyse (ESCA) blev brugt til at analysere overfladen del af thiolated gelatine (SH-Gel NP), PEG-modificerede thiolated gelatine (SH-Gel PEG) og EGFR målrette peptid-modificeret thiolated gelatine nanopartikler (SH-Gel PEG peptid). Resultaterne i tabel 2 viste peak intensiteten af CH (kulbrinte), CO (ether), og C = O (carbonyl) grupper på 285,0, 286,3 og 288,1 eV, hhv. Æteren CO signalet er steget efter PEG modifikation og faldt efter peptid konjugation. Mens kvælstof sammensætning er faldet efter PEG modifikation og steg efter peptid ændring, som bekræftede tilstedeværelsen af EGFR-targeting peptid på nanopartikler. ESCA analyse har yderligere bekræftet, PEG og peptid overflade modifikation.
Elektronspektroskopi til kemisk analyse af nanopartikler Surface sammensætning
| Formulering | C 1s (%) | O 1s (%) | N 1s (%) |
| SH-Gel NP | 59,3 ± 0,8 | 22,9 ± 0,5 | 12,9 ± 0,1 |
| SH-Gel-PEG | 58,2 ± 0,6 | 28,0 ± 1,2 | 9,5 ± 0,7 |
| SH-Gel PEG peptid | 56,7 ± 0,8 | 25,9 ± 0,7 | 12,3 ± 0,6 |
| Formulering | CC (%) | CO, N (%) | C = O (% ) |
| SH-Gel NP | 51,5 | 26,6 | 21,9 |
| SH-Gel-PEG | 17,1 | 63,1 | 19,8 |
| SH-Gel PEG peptid | 33,1 | 42,8 | 24,1 |
Tabel 2. C 1S høj opløsning scanninger af elektron spektroskopi til kemisk analyse (ESCA)
For at undersøge stabiliteten af indkapslet plasmid, blev nanopartikler behandlet med protease eller DNAse separat, simuntaneously eller sekventielt. Efter elektroforese, har resultaterne i figur 2 vist, at plasmid DNA indkapslet i alle nanopartikler er beskyttet af nanopartikler og stabil, kan sammenlignes med nøgen plasmid DNA. Studeret disse har vist, at alle disse nanopartikler kan indkapsle og bevare plasmid struktur efter indkapsling.
/ Files/ftp_upload/3612/3612fig2.jpg "/>
Figur 2. Stabilitet af plasmid DNA indkapslet i thiolated gelatine, thiolated PEG-modificerede gelatine, og EGFR peptid-modificerede thiolated gelatine nanopartikler af agarose gel elektroforese. Nanopartikler blev behandlet med 0,2 mg / ml af protease at bevise plasmid DNA indkapsling i nanopartikel matrix
2. Baseline EGFR i bugspytkirtelkræftceller
To menneskets bugspytkirtel adenokarcinom cellelinier (Panc-1 og Capan-1) blev analyseret ved Western Blot for EGFR. Menneskelige æggestokkene adenokarcinom (SKOV3) og murine fibroblast ((NIH-3T3-celler) blev valgt som positive og negative kontroller, hhv. Beta-actin blev analyseret som protein loading kontrol. Panc-1 celler har vist højere EGFR i forhold til Capan-1 og denne cellelinie blev derefter brugt til følgende in vitro-undersøgelser
3. Cytotoksicitet af Kontrol og Surface-Modified Thiolated Gelatine Nanopartikler
For at vurdere den cellulære interaktion af nanopartikler blev cytotoksicitet analyser udført efter behandling med nanopartikler. Baseret på resultaterne i figur 3, både kontrol og overfladen-modificerede nanopartikler var forholdsvis sikker og biokompatible i Panc-1 celler selv ved høje koncentrationer, med sammenligning med PEI. Følgende undersøgelser blev udført med 1mg/ml nanopartikler.
Figur 3. Procent cellernes levedygtighed som en funktion af nanopartikel formulering koncentrationer i Panc-1 celler, som evalueres ved tetrazolium farvestof (MTS) assay
4. Receptor medieret Cell Optagelse i Panc-1 celler
For at bekræfte overflade tilgængeligheden af EGFR-targeting peptid og receptor-medieret endocytotic optagelse af nanopartikler, var et system designet af mærkning hver component med forskellige fluorescens til visualisering af nanopartikler optagelse og handel med celler. Med dette mærkningssystem kunne plasmid-DNA, nanopartikler og cellekerne kan identificeres. Laser scanning konfokal fluorescens mikroskopi blev brugt til at tage billeder på forskellige tidspunkter, fra 15 minutter til 6 timer. Ved at sammenligne billederne af forskellige formuleringer, viste peptid konjugeret gelatine nanopartikler den hurtige optagelse og plasmid frigivelse inden for 30 minutter. Dette resultat endvidere bevist, at EGFR peptid-konjugeret nanopartikler undergik lettet endocytose med hurtig interaktion mellem EGFR specifikke peptid og EGFR-receptorer på celleoverfladen, hvilket var meget hurtigere, sammenlignet med andre nanopartikler, der gennemgik en non-specifikke endocytose.
Cell Trafficking Study
Figur 4. Konfokal fluorescens mikroskopi enalysis af DNA-indkapslet nanopartikel optagelse og handel med Panc-1 celler. (Rød = rhodamine-mærkede nanopartikler, grøn = PicoGreen-mærkede plasmid DNA, og blå = DAPI-mærket kerne). Laseren magt var 7 gange mindre i sidste fire cifre i nederste panel.
5. Kvalitative og kvantitative In Vitro transfektion med Enhanced Green Fluorescent Protein
ELISA i figur 5 og fluorescens mikroskopisk analyse i Figur 6 blev brugt til at måle kvalitative og kvantitative GFP tranfection effektivitet i Panc-1 celler ved administration af umodificerede, PEG-modificerede og EGFR peptid-modificerede thiolated gelatine nanopartikler. Plasmider leveret af EGFR-målrettede nanopartikler resulterede i det højeste niveau af GFP udtryk efter 48 timer i forhold til andre kontroller, herunder Lipofectin-kompleks DNA.
Figur 5. GFP udtryk ennalyzed med ELISA plottet som en funktion af tiden efter administration af plasmid DNA i kontrol og EGFR-målrettede nanopartikler.
Fluoresens Mikroskopisk Analyse for GFP transfektion
Figur 6. Kvalitativ analyse af grønne fluorescerende protein udtryk i Panc-1 celler ved epifluoresence mikroskopi efter 24, 48, 72 og 96 timer efter transfektion med EGFP-N1. Lipofectin-DNA komplekset blev brugt som positiv kontrol.
6. In Vitro Tranfection med Wild-type p53 Plasmid i Panc-1 celler
Vildtype p53 plasmider pORF-hp53, med EF-1α / HTLV hybrid promotor blev udvundet fra E. coli og indkapslet i nanopartikler til at studere de apoptotiske terapeutiske effekt. Panc-1 celler blev behandlet med partikler i 6 timer og efter transficeret for yderligere 24, 48, 72, og 96 timer.
Siden p53 kunne inducere apoptose i celler og for at opnå denne funktion, ville mange downstream transkriptionsfaktorer være involveret og direkte reguleret af ekspression af WT-p53. Blandt dem, ville Bax, caspase-3, caspase-9, DR5, PUMA og Apaf-1 er opreguleret ved ekspression af p53 og mens Bcl-2, ville survivin være nedreguleret. For at undersøge niveauet af disse transskriptionsfaktorer, blev mRNA udvundet Panc-1 celler efter 48 timer efter transfektion og brugt til RT-PCR. Produkterne blev evalueret med gelelektroforese og bands blev analyseret med ImageJ. Baseret på resultaterne viste i figur 7, survivin faldt betydeligt med behandling af EGFR målrettede thiolated gelatine nanopartikler i forhold til andre behandlinger, var ingen tydelig ændring set i Bcl-2, Bax og udtryk for caspase-3, caspase-9, DR5, PUMA og Apaf-1increased med målrettede nanopartikler behandling.
les/ftp_upload/3612/3612fig7.jpg "/>
Figur 7. MRNA niveauer af downstream faktorer WT-p53 udtryk, blev sammenlignet med RT-PCR efter 48 timer efter transfektion.
Efter WT-p53 transfektion, blev Chromatin Kondens / membranpermeabilitet / Dead Cell Apoptose kittet bruges til at differentiere apoptotiske celler, nekrotiske celler og levende celler med forskellige farvestoffer. iCys Forskning Imaging cytometer fra CompuCyte (Westwood, MA) blev anvendt til at analysere og sammenligne apoptose niveauer efter behandling. Sammenlignet med den negative kontrol, blev apoptotiske celler fold ændringer beregnet ud og er angivet i Figur 8. EGFR målrettede thiolated gelatine nanopaticles har vist den højeste apoptotiske cellepopulation efter post-transfektion. Analyse af caspase 3 / 7 aktivitet, viste også, at EGFR-målrettede nanopartikler var hurtige internalisering og højeste niveau af apoptotiske aktivitet i Panc-1 celler.
Figur 8. Cytometrianalyse af pro-apoptotiske aktivitet i kontrol WT-p53 transficeret Panc-1 celler ved hjælp af iCys ° Imaging cytometer
Discussion
Kontrol og EGFR målrettede thiolated gelatine nanopartikler blev udarbejdet med effektive DNA indkapsling og stabilitet. De partikler af alle disse systemer var i intervallet 150-250 nm i diameter. Zeta potentiale har bevist, at dette system er en anelse negativ system. Med SEM analysen blev de størrelser af nanopartikler det samme med Zetasizer resultat. ESCA analyse kunne bekræfte PEG og peptid overflade modifikation.
Western blot analyse viste, at Panc-1 celler havde en høj EGFR niveauer, og dette cellelinie blev anvendt til in vitro-undersøgelser. Både kontrol og overflade-modificerede nanopartikler var relativt mindre cytotoksiske i Panc-1 celler i forhold til PEI.
Cell handel undersøgelser viste hurtige optagelse og plasmid frigivelse af EGFR-målrettede nanopartikler i Panc-1 celler. Levering af journalist plasmider DNA udtrykke med EGFR-målrettede nanopartikler resulterede i højeste niveauer afGFP udtryk i forhold til andre kontroller, herunder Lipofectin-kompleks DNA. Med det samme system, udløste transfektion med WT-p53 plasmid downstream-apoptotiske pathway og inducerede hurtige apoptose i Panc-1 celler.
Disse foreløbige resultater tyder på, at EGFR-målrettede thiolated gelatine nanopartikler kan tjene som et sikkert og effektivt DNA levering system til genterapi som en behandling for kræft i bugspytkirtlen.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af National Cancer Institute Alliance i nanoteknologi for Cancer Center for Cancer Nanoteknologi Excellence (CCNE) indrømme U54-CA151881.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type B gelatin, Bloom 225 | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| 2-iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Elim Biopharm | N/A | |
| pORF-hp53 E. coli | Invitrogen | porf-hp53 | |
| Glyoxal solution (40wt. % in H2O) | Sigma-Aldrich | 128465 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225-250G | |
| QIA filter Plasmid Mega kit | Qiagen | 12281 | |
| Beckman LE 80K Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | N/A | |
| FreeZone 6 Liter Console Freeze Dry Systems | Labconco Corp. | 7753020 | |
| mPEG-SCM, MW 2,000 Da | Laysan Bio Inc. | mPEG-SCM-2K-1g | |
| MAL-PEG-SCM, MW 2,000 Da | Jenkem Technology | A5001-1 | |
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments | Zetasizer Nano ZS | |
| Hitachi 4800 field emission scanning electron microscope | Hitachi | S-4800 UHR FE-SEM | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits | Invitrogen | P7589 | |
| Lipofectin Transfection Reagent | Invitrogen | 18292011 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10 013 CM | |
| RPMI | Mediatech, Inc. | 50 020 PB | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 | |
| iBlot Dry Blotting System | Invitrogen | IB1001 | |
| XCellSureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark | Invitrogen | EI0002 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 32109 | |
| Kodak Digital X-ray Specimen (DXS) System | Kodak | N/A | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega Corp. | G3580 | |
| BioTek SynergyHT plate reader | BioTek | N/A | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | N/A | |
| One-step RT-PCR kit | Qiagen | 210212 | |
| Chromatin Condensation/Membrane Permeability/Dead Cell Apoptosis Kit | Invitrogen | V23201 | |
| Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay kit | Promega Corp. | G7790 | |
| Hybaid PCR Sprint Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, Inc. | N/A | |
| EGF Receptor Antibody | Cell Signaling Technology | 2232 | |
| β-Actin Antibody | Cell Signaling Technology | 4967 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| Mouse Monoclonal GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-597 | |
| Goat Polyclonal GFP antibody (Alkaline Phosphatase) | Novus Biologicals | NB600-1502 | |
| Phosphatase Substrate Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 37620 |
References
- Vimalachandran, D. Genetics and prevention of pancreatic cancer. Cancer. Control. 11, 6-14 (2004).
- Kommareddy, S., Amiji, M. Preparation and evaluation of thiol-modified gelatin nanoparticles for intracellular DNA delivery in response to glutathione. Bioconjug. Chem. 16, 1423-1432 (2005).
- Kommareddy, S., Amiji, M. Poly(ethylene glycol)-modified thiolated gelatin nanoparticles for glutathione-responsive intracellular DNA delivery. Nanomedicine. 3, 32-42 (2007).
- Kommareddy, S., Amiji, M. Antiangiogenic gene therapy with systemically administered sFlt-1 plasmid DNA in engineered gelatin-based nanovectors. Cancer. Gene. Ther. 14, 488-498 (2007).
- Kommareddy, S., Amiji, M. Biodistribution and pharmacokinetic analysis of long-circulating thiolated gelatin nanoparticles following systemic administration in breast cancer-bearing mice. J. Pharm. Sci. 96, 397-407 (2007).
- Kaul, G., Amiji, M. Tumor-targeted gene delivery using poly(ethylene glycol)-modified gelatin nanoparticles: in vitro and in vivo studies. Pharm. Res. 22, 951-961 (2005).
- Bardeesy, N., DePinho, R. A. Pancreatic cancer biology and genetics. Nat. Rev. Cancer. 2, 897-909 (2002).
- Li, Z. Identification and characterization of a novel peptide ligand of epidermal growth factor receptor for targeted delivery of therapeutics. FASEB. J. 19, 1978-1985 (2005).
- McCormick, F. Cancer gene therapy: fringe or cutting edge. Nat. Rev. Cancer. 1, 130-141 (2001).
- Green, D. R., Kroemer, G. Cytoplasmic functions of the tumour suppressor p53. Nature. 458, 1127-1130 (2009).
- Barton, C. M. Abnormalities of the p53 tumour suppressor gene in human pancreatic cancer. Br. J. Cancer. 64, 1076-1082 (1991).
