Summary
Type B gelatine-based ontworpen nanovectors systeem (Gens) is ontwikkeld voor systemische genafgifte en transfectie in de behandeling van alvleesklierkanker. Door modificatie met epidermale groeifactor receptor (EGFR) specifieke peptide op het oppervlak van nanparticles, kunnen ze gericht zijn op de EGFR-receptor en laat plasmide onder reducerende omgeving, zoals een hoge intracellulaire glutathion-concentraties.
Abstract
Meer dan 32.000 patiënten gediagnosticeerd met alvleesklierkanker in de Verenigde Staten per jaar en de ziekte gaat gepaard met zeer hoge sterfte 1. Dringende behoefte bestaat aan de ontwikkeling van nieuwe klinisch-vertaalbare therapeutische strategieën die kunnen verbeteren op de sombere overleven statistieken van patiënten met pancreaskanker. Hoewel gentherapie in kanker heeft aangetoond een enorme belofte, de grootste uitdaging is in de ontwikkeling van veilige en effectieve levering systeem, wat kan leiden tot aanhoudende transgenexpressie.
Gelatine is een van de meest veelzijdige natuurlijke biopolymeer, veel gebruikt in voedingsmiddelen en farmaceutische producten. Eerdere studies in ons laboratorium hebben aangetoond dat type B gelatine kon fysieke DNA, die de dubbele helix structuur van het plasmide en verbeterde transfectie-efficiëntie bewaard gebleven bij de intracellulaire aflevering in te kapselen. Door thiolation van gelatine, kon de sulfhydrylgroepen geïntroduceerd worden in het polymeer en zou form disulfidebinding in nanodeeltjes, die het hele complex en een keer disulfidebinding stabiliseert is te wijten aan de aanwezigheid van glutathion in cytosol gebroken, zou payload worden vrijgegeven 2-5. Poly (ethyleenglycol) (PEG)-gemodificeerd Gens, wanneer het wordt toegediend in de systemische circulatie, biedt lange-circulatie tijden en bij voorkeur doelen om de tumor massa als gevolg van de hyper-doorlaatbaarheid van de neovasculatuur door de verbeterde doorlaatbaarheid en retentie effect 6. Studies hebben aangetoond over-expressie van de epidermale groeifactor receptor (EGFR) op PAnC-een menselijke pancreas adenocarcinoom cellen 7. Om actief alvleesklierkanker cellijn richten, EGFR specifieke peptide werd vervoegd op het deeltje oppervlak via een PEG-spacer. 8
De meeste anti-tumor gen-therapieën zijn gericht op het beheer van de tumor suppressor genen, zoals wild-type p53 (wt-p53), de pro-apoptotische functie in de cellen 9 herstellen 10. In alvleesklierkanker, de meeste cellen hebben mutaties in p53-eiwit, waardoor het verlies van de apoptotische activiteit. Met de introductie van wt-p53, kon de apoptose worden gerepareerd en verder triggers celdood in kankercellen 11.
Gebaseerd op de bovenstaande reden, hebben we speciaal EGFR gericht peptide-gemodificeerde gethioleerde gelatine nanodeeltjes voor wt-p53-gen levering en geëvalueerd levering efficiëntie en transfectie in PAnC-1 cellen.
Protocol
1. Voorbereiding van de Plasmide DNA Ingekapselde EGFR-gerichte Gelatine Nanodeeltjes
- Synthese van gethioleerde gelatine
- Gethioleerde gelatine werden gesynthetiseerd als de vorige methode 2-5, door covalente conjugatie met 2-iminothiolaan op primaire aminogroepen van type B gelatine. 1 gram gelatine werd opgelost in 100 ml gedeïoniseerd water en geïncubeerd met 20 mg twee-iminothiolaan hydrochloride bij kamertemperatuur gedurende 15 uur.
- Ongereageerde reagens werd verwijderd door dialyse tegen 5 mM HCl-oplossing, gevolgd door 1 mM HCl-oplossing voor elk 3 uur. Gezuiverd gethioleerde gelatine werd gevriesdroogd en opgeslagen bij 4 ° C voor verder gebruik.
- Voorbereiding van DNA-bevattende nanopartikels
- 200 mg gethioleerde gelatine is opgelost in water en de pH van de oplossing werd ingesteld op 7 door toevoeging van 0,2 M NaOH-oplossing. 1 mg DNA werd toegevoegd en voorzichtig gemengd met gelatine-oplossing.
- Chilled ethanol werd langzaam toegevoegd aan het mengsel, terwijlroeren oplossing bij hoge snelheid. Nanodeeltjes werden gevormd toen oplosmiddelsamenstelling veranderd naar 75% hydro-alcoholische oplossing.
- Nanodeeltjes werden verder verknoopt door langzame toevoeging van 0,1 ml 8% (v / v) glyoxal oplossing. Ongereageerd reagentia werden afgeschrikt met 0,5 ml 0,2 M glycine-oplossing.
- Nanodeeltjes werden ultra-gecentrifugeerd bij 16.000 rpm gedurende 30 minuten. Pellets werden gewassen met gedeïoniseerd water twee keer en gezuiverd nanodeeltjes werden gevriesdroogd en opgeslagen bij 4 ° C.
- Oppervlakte modificatie van nanodeeltjes
- Nanodeeltjes werden gesuspendeerd in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4) met een concentratie van 10 mg / ml en geïncubeerd met 2 keer het gewicht van methoxy-PEG-succinimidyl carboxy methyl ester (MPEG-SCM, MW 2000 Da) of maleïmide-PEG-succinimidyl carboxy methylester (MAL-PEG-SCM, MW 2000 Da) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur langzaam roeren.
- GePEGyleerde nanodeeltjes werden verzameld met ultra-centrifugatie bij 16.000 omwentelingen per minuut gedurende 30 minutens. Pellets werden gewassen met gedeïoniseerd water twee keer en gezuiverd nanodeeltjes werden gevriesdroogd en opgeslagen bij 4 ° C.
- MAL-PEG-SCM gewijzigd nanodeeltjes werden gesuspendeerd in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 6,5) met een concentratie van 10mg/ml en geïncubeerd met 10% gewicht van EGFR specifieke peptide (YHWYGYTPQNVI-GGGGC) voor 6 uur bij kamertemperatuur met langzaam roeren.
- Peptide gewijzigd nanodeeltjes werden verzameld met ultra-centrifugatie bij 16.000 rpm gedurende 30 minuten. Pellets werden gewassen met gedeïoniseerd water twee keer en gezuiverd nanodeeltjes werden gevriesdroogd en opgeslagen bij 4 ° C.
2. Karakterisering van de EGFR-gerichte nanodeeltjes
- Deeltjesgrootte en zeta potentiaal metingen
Nanodeeltjes werden gesuspendeerd in water met een concentratie van 1mg/ml. Suspensie werd geanalyseerd met behulp van Zetasizer Nano (Malvern Inc). Deeltjesgrootte analyse werd uitgevoerd bij een verstrooiing hoek van 90 graden bij 25 °C. Zeta potentieel werd gemeten bij default parameters van de diëlektrische constante, brekingsindex en de viscositeit van water bij 25 ° C. - Scanning Electron Microscopy
Gevriesdroogde nanopartikels werden gemonteerd op aluminium monster montage en sputteren-bedekt met palladium om de geleidbaarheid te verbeteren en het minimaliseren van opbouw van de kosten. Monsters werden waargenomen voor oppervlaktemorfologie onder een Hitachi 4800 veldemissie scanning electronen microscoop op 3 kV. - Electron spectroscoop voor de chemische analyse (ESCA)
Gevriesdroogde formulering van controle werden gePEGyleerd en peptide gewijzigd nanodeeltjes geanalyseerd met behulp van ESCA. Het werd uitgevoerd in de Nationale ESCA en Surface Analysis Center voor Biomedische Problemen (NESAC / BIO), University of Washington (Seattle, WA).- Monsters werden geplaatst in ultrahoog vacuüm en blootgesteld aan lage-energie x-stralen, die een emissie van secundaire foto-elektronen geïnduceerde van het oppervlak.
- Door het plotten aantal gedetecteerde elektronen als functie van BinDing energie, waargenomen spectrum pieken werden toegewezen aan elke chemische componenten.
- Hoge-resolutie analyse van C1s spectra werd uitgevoerd om de exacte chemische samenstelling van de koolwaterstof (CC of CH op 285mV), ether (CO) op 286.4mV), en carbonyl (C = O op 288,1 mV), en de relatieve samenstelling van elke functionaliteit te bepalen werd bepaald door de oppervlakte onder de curve.
- Stabiliteit van ingekapselde plasmide
De stabiliteit van de ingekapselde plasmide DNA werd bevestigd door het uitvoeren van de geëxtraheerde DNA op pre-cast gels. De nanodeeltjes werden gedigereerd met 0,2 mg / ml protease met PBS (30 min bij 37 ° C) en 0,2 U / ml DNase (10 min. op kamertemperatuur) afzonderlijk, gelijktijdig of na elkaar. Monsters werden vervolgens geladen 1,2% agarose gel (GP) (E-Gel, Invitrogen, CA) bij een concentratie van 100ng/well in een 18μL volume per goed. Naakt plasmide werd geladen als controle en gel werd uitgevoerd bij 75 V gedurende 30 minuten. Kodak Digital X-ray Specimen (DXS) System werd gebruikt om b te visualiserenands met UV transluminescence. - Bepaling van het plasmide laden
Plasmide ingekapselde nanodeeltjes werden geschorst op 1mg/ml en gedigereerd met 0.2mg/ml protease bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Oplossing werd gecentrifugeerd bij 13.000 rpm gedurende 10 minuten en supernatant werd verzameld en getest op plasmide concentratie met Picogreen assay (Invitrogen). Encapsulation verhouding werd berekend door de ingekapselde plasmide concentratie met de initiële oplaaddosis 0,5% (w / w).
3. In Vitro Transfectie Studies in PAnC-1 alvleesklierkankercellen
- Celcultuur condities
PAnC-1 en Capan-een pancreas adenocarcinoom cellijnen, werden SKOV3 ovariële adenocarcinoom cellijn en de NIH-3T3 muis fibroblast cellijn verkregen van ATCC. PAnC-1 en NIH-3T3 werden gekweekt met DMEM voorzien van L-glutamine, Pen-streptokok en 10% foetaal runderserum bij 37 ° C en 5% CO 2, terwijl Capan-1 vereist DMEM 20% foetaal runderserum geleverd.SKOV3 werd gekweekt in RPMI-1640 geleverd met 10% foetaal runderserum. - Western blot analyse voor EGFR-expressie
- Cellysaten werden verzameld van 2 miljoen cellen en geanalyseerd voor het totale eiwit concentratie met behulp van BCA assay (Pierce). NIH-3T3 werd gebruikt als negatieve controle en SKOV3 werd gebruikt als positieve controle voor EGFR expressie.
- 10 pg totaal eiwit extract werd uitgevoerd op pre-cast natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) systeem op 135V gedurende 90 minuten.
- Vervolgens werd gel overgebracht op PVDF-membraan door iBlot Dry Blotting System (Invitrogen).
- Membraan werd geblokkeerd met 5% niet-vette melk in Tween-bevattende Tris buffer zoutoplossing (TBS-t) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Membraan werd gesneden en geïncubeerd met 1:1000 verdunning van de primaire konijn beta-actine antilichamen en 1:1000 verdunning van de primaire konijn EGFR antilichamen apart overnacht bij 4 ° C.
- Membraan werd vervolgens tweemaal gewassen metTBS-t en geïncubeerd met 1:2.000 verdunningen van secundaire anti-konijn mierikswortelperoxidase-geconjugeerde IgG in TBS-t gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Na het spoelen overtollige antilichamen met TBS-t en water, werd 4 ml ECL substraat (Pierce, Rockford, IL, USA) toegevoegd en geïncubeerd met membranen voor 5 minuten.
- Chemiluminescentie banden werden vervolgens gevisualiseerd met behulp van Kodak Digital X-ray Specimen (DXS) System.
- Levensvatbaarheid van de cellen onderzoeken met verschillende formuleringen
- PAnC-1-cellen werden gekweekt in 96-well platen bij 10.000 cellen per putje in 200μL van aangevuld DMEM 's nachts.
- Groeimedium werd vervangen met serum vrije media met verschillende concentraties van nanodeeltjes met 0, 0,5, 1, 2, 4, 6 mg / ml. 1mg/ml PEI, een bekende cytotoxische kationisch polymeer, werd gebruikt als positieve controle.
- Cellen werden behandeld met 200μL nanodeeltjes voor 6 uur en daarna vervangen door 20μL MTS reagens en 100μL compleetcultuur media.
- Na het plaatsen incubatie gedurende 3 uur bij 37 ° C in 5% CO 2, de absorptie van formazanproduct werd gemeten bij 490nm met Biotek SynergyHT plaat lezer (Winooski, VT).
- Het percentage levensvatbaarheid van de cellen werd uitgedrukt als de verhouding van de absorptie van polymeer-behandelde cellen ten opzichte van negatieve controle (0mg/ml) vermenigvuldigd met 100 en uitgezet als functie van de polymeer-concentraties.
- Cel mensenhandel studies
- Rhodamine B isothiocyanaat (RBITC) werd gebruikt om op gethioleerde gelatine conjugaat door reactie met amine-groep. Na de dialyse en vriesdrogen, RBITC label gethioleerde gelatine gebruikt werd voor nanodeeltjes voorbereiding.
- Vóór desolvation, was 25μL PicoGreen gemengd met 1 mg plasmide voor 1 minuut en gelabeld plasmiden werden toegevoegd aan gelatine-oplossing. Verschillende formuleringen werd gemaakt na de vorige methode.
- PAnC-1-cellen werden gekweekt in 6-well platen bevattende glazen cover-slips met 200.000 cellen pER goed. Na een nacht groei werden 2 ml van gelabelde nanodeeltjes behandeld worden in elk putje met een concentratie van 1mg/ml in serum vrij medium.
- Na verschillende tijdstippen, van 15 minuten tot 6 uur werd het medium vervangen door kweekmedium dat 1μg/ml van Hoest 33,342 (Invitrogen) gedurende 15 minuten incubatie bij kamertemperatuur. 2 ml van 4% paraformaldehyde-oplossing werd vervangen in elk putje om cellen op te lossen. Cellen werden vervolgens gewassen met PBS twee keer.
- Coversilps werden gemonteerd op glas dia's. Laser scanning confocale fluorescentie microscopie is gebruikt om afbeeldingen van de vaste cellen nemen.
- Kwalitatieve bepaling van de transfectie-efficiëntie door middel van fluorescentie microscopie met pEGFP-N1 ingekapseld nanodeeltjes
- pEGFP-N1 plasmiden werden ingekapseld in nanodeeltjes en gesuspendeerd in serum vrije media met concentratie gelijk aan 10μg plasmiden per ml voor verdere behandelingen.
- PAnC-1-cellen werden gedurende de nacht gekweekt in 6-well platen contaiNing glazen cover-slips met 200.000 cellen per putje. 2 ml pEGFP-N1 plasmiden ingekapselde nanodeeltjes werden behandeld in elk putje. 20 microgram plasmiden werden gemengd met 20μl Lipofectin, kationische lipiden transfectie reagens, en het werd gebruikt als positieve controle, terwijl onbehandelde cellen werden gebruikt als negatieve controle.
- Cellen werden geïncubeerd met verschillende formuleringen voor 6 uur.
- Medium werd vervangen door kweekmedium en werden de cellen getransfecteerd post-voor 24, 48, 72 en 96 uur.
- Na het post-transfectie werd het medium vervangen door kweekmedium dat 1μg/ml van Hoest 33342 (Invitrogen) en geïncubeerd met cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Dekglaasjes werden gemonteerd op glazen dia's en expressie van GFP in de cellen werd waargenomen door de fluorescentie microscoop. Differentieel interferentie contrast (DIC) en fluorescentie beelden die met behulp van Olympus BX61 microscoop en digitale beelden werden verwerkt met Image J-software.
- pEGFP-N1 plasmiden werden ingekapseld in nanodeeltjes en gesuspendeerd in serum vrije media met concentratie gelijk aan 10μg plasmiden per ml voor verdere behandelingen.
- PAnC-1-cellen werden gedurende de nacht gekweekt in 6-well platen met 200.000 cellen per putje. 2 ml pEGFP-N1 plasmiden ingekapselde nanodeeltjes werden behandeld in elk putje. 20 microgram plasmiden werden gemengd met 20μl Lipofectin, kationische lipiden transfectie reagens, dat gebruikt werd als positieve controle en onbehandelde cellen werden gebruikt als negatieve controle.
- Cellen werden geïncubeerd met verschillende formuleringen voor 6 uur.
- Medium werd vervangen door kweekmedium en werden de cellen post-geïncubeerd voor 24, 48, 72 en 96 uur.
- Na het post-transfectie werden cellysaten verzameld uit elk putje en geanalyseerd voor het totale eiwit concentratie met behulp van BCA assay (Pierce).
- well plaat was coaTed met 100μl van 1:1000 verdunningen van monoklonale anti-GFP antilichamen in elk putje. Na 2 uur incubatie werd plaat gewassen met PBS-0.5% (w / v) Tween-80 voor 4 keer.
- 300μl TBS blokkeren buffers werden toegevoegd aan elk putje en geïncubeerd gedurende 2 uur. Daarna plaat werd daarna gewassen met PBS-0.5% (w / v) Tween-80 voor 4 keer.
- 30μg van eiwitten van elke groep werden toegevoegd aan de plaat en geïncubeerd overnacht bij 4 °. Daarna plaat werd daarna gewassen met PBS-0.5% (w / v) Tween-80 voor 4 keer.
- 100μl van 1:2400 verdunningen van secundaire anti-GFP-antilichamen ten opzichte van alkalische fosfatase werd aan elk putje toegevoegd en geïncubeerd gedurende 1 uur. Daarna plaat werd daarna gewassen met PBS-0.5% (w / v) Tween-80 voor 4 keer.
- 100μl alkalische fosfatase substraten werden aan elk putje toegevoegd en geïncubeerd gedurende 30 minuten tot 1 uur. Plaat werd gemeten met BioTek Synergy HT plaat-lezer voor absorptie bij 405 nm.
- Uitgedrukt GFP concentratie werd gerapporteerd als nanogram per milligrams totaal eiwit.
- Wt-p53 plasmiden werden ingekapseld in nanodeeltjes en gesuspendeerd in serum vrije media met concentratie gelijk aan 10μg plasmide per ml voor verdere behandelingen.
- PAnC-1-cellen werden gedurende de nacht gekweekt in 6-well platen met 200.000 cellen per putje. 2 ml wt-p53 plasmiden ingekapselde nanodeeltjes werden behandeld in elk putje. 20 microgram plasmiden werden gemengd met 20μl Lipofectin, kationische lipiden transfectie reagens, dat gebruikt werd als positieve controle en onbehandelde cellen werden gebruikt als negatieve controle.
- Cellen werden geïncubeerd met verschillende formuleringen voor 6 uur.
- Medium werd vervangen door kweekmedium en werden de cellen post-geïncubeerd gedurende 48 uur.
- mRNA werden geëxtraheerd uit elk putje met behulp van High Pure RNA isolatie kit (Roche, Indianapolis, IN) en gemeten met Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Wilminton, DE).
- RT-PCR werd uitgevoerd met behulp van QIAGEN een stap RT-PCR kit (Qiagen, Valencia, CA). Primers voor p53, Bax, Bcl-2, Beta-actine, DR5, Apaf-1, PUMA, werden survivine gesynthetiseerd door Eurofins MWG Operon (Huntsville, AL).
- PCR-producten werden geëvalueerd met gel elektroforese en de pixels van cDNA bands werden geanalyseerd met ImageJ software.
- Wt-p53 plasmide werd ingekapseld in nanodeeltjes en gesuspendeerd in serum vrije media met concentratie gelijk aan 10μg plasmiden per ml voor verdere behandeling.
- PAnC-1-cellen werden gedurende de nacht gekweekt in 6-well platen met 200.000 cellen per putje. 2 ml wt-p53 plasmiden ingekapselde nanodeeltjes werden behandeld in elk putje. 20 microgram plasmiden werden gemengd met 20μl Lipofectin, kationische lipiden transfectie reagens, dat gebruikt werd als positieve controle en onbehandelde cellen werdengebruikt als negatieve controle.
- Cellen werden geïncubeerd met verschillende formuleringen voor 6 uur.
- Medium werd vervangen door kweekmedium en werden de cellen post-geïncubeerd voor 24, 48, 72 en 96 uur.
- Chromatine condensatie / membraanpermeabiliteit / Dead Cell Apoptosis Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) werd gebruikt om apoptotische cellen, necrotische cellen en levende cellen met verschillende kleurstoffen label.
- iCys Onderzoek Imaging Cytometer uit CompuCyte (Westwood, MA) werd gebruikt om te analyseren en te vergelijken met het niveau apoptose na de behandeling. Op basis van de fluorescentie microscopische beelden, was de intensiteit van alle kleuren opgenomen en uitgezet tegen de tellingen en de percentages voor de verschillende populaties werden berekend.
- In vergelijking met de negatieve controle, wat betekent dat er geen behandeling voor de cellen, werden de apoptotische cellen fold veranderingen berekend uit en opgenomen in de grafiek.
- 3.8.8 Apo-ONE Homogene caspase-3 / 7 Assay kit (Promega, Madison, WI) werd gebruikt om de p onderzoekenro-apoptotische activiteit na transfectie van wt-p53 plasmide. 1mg/ml PEI werd gebruikt als een negatieve controle voor alle apoptotische activiteit te elimineren. Na het post-transfectie werden de cellen behandeld met rhodamine 110, bis-(N-CBZL-aspartyl-L-glutamyl-L-valyl-L-asparaginezuur amide, Z-DEVD-R110), dat is een substraat van caspase 3 / 7, voor maximaal 18 uur.
- Plaat werd gemeten met BioTek Synergy HT plaat-lezer voor fluorescentie bij 490/520 nm. Op basis van de intensiteit van de groene fluorescentie, kunnen pro-apoptotische activiteit worden geëvalueerd.
4. Representatieve resultaten
1. Synthese en Chatacterization van de EGFR-gerichte nanodeeltjes
EGFR gericht op peptide-gemodificeerde nanodeeltjes werden gesynthetiseerd als de regeling bleek in figuur 1. De nanodeeltjes opgesteld door desolvation werden gekenmerkt voor deeltjesgrootte en zeta potentieel. De gemiddelde grootte en oppervlakte lading van de deeltjes bereid uit gethioleerde gelatinesmet verschillende graden van thiolation staan vermeld in tabel 1. De gemiddelde deeltjesdiameter van verschillende nanodeeltjes werden tussen de 150 tot 250 nm. Gethioleerde nanodeeltjes zijn kleiner in vergelijking met gelatine nanodeeltjes, kan door het disulfide brug vorming binnen deeltjes. Met verschillende oppervlakmodificaties, hebben afmetingen van nanodeeltjes toegenomen. Het zeta potentieel van verschillende formuleringen waren ongeveer -20 mV. Met de SEM analyse werden de maten, oppervlakte morfologie en sferische vorm van nanodeeltjes waargenomen en die overeenkomt met Zetasizer resultaat. DNA laden van efficiëntie in gelatine nanodeeltjes en gethioleerde gelatine nanodeeltjes waren hoger dan 95% (tabel 1).
Figuur 1. Chemical Reaction Scheme, ter illustratie van oppervlakte modificatie van gethioleerde gelatine nanodeeltjes met epidermale groei factor receptor (EGFR) bindende peptide door middel van een poly (ethyleenglycol) (PEG) spacer.
Karakterisering van nanodeeltjes
| Formulering | Nanodeeltjes Diameter (nm) | Zeta Potentieel (mV) | Plasmide DNA wordt geladen Efficiency (%) |
| Gel NP | 151,4 ± 23,5 | -17,1 ± 5,23 | 95,6 ± 2,2 |
| SH-Gel NP | 132,6 ± 17,9 | -24,6 ± 5,16 | 97,0 ± 3,8 |
| SH-Gel-PEG | 179,0 ± 30,9 | -22,3 ± 9,50 | 95,8 ± 6,5 |
| SH-Gel PEG Peptide | 230,8 ± 41,5 | -18,1 ± 4,02 | 94,8 ± 5,1 |
TaBLE 1. deeltjesgrootte, oppervlakte lading, en plasmide DNA inkapseling efficiëntie van de controle en EGFR-gerichte gelatine en gelatine gethioleerde nanodeeltjes.
Hoge-resolutie C 1S scans van elektronen spectroscopie voor chemische analyse (ESCA) werd gebruikt om het oppervlak van de component gethioleerde gelatine (SH-Gel NP), PEG-gemodificeerde gethioleerde gelatine (SH-Gel PEG) en de EGFR gericht peptide-gemodificeerde gethioleerde gelatine te analyseren nanodeeltjes (SH-Gel PEG Peptide). De resultaten in tabel 2 blijkt piek intensiteiten van de CH (koolwaterstof), CO (ether), en C = O (carbonyl) groepen op 285,0, 286,3, 288,1 en eV, respectievelijk. De ether CO signaal is toegenomen na de PEG modificatie en verlaagd na peptide conjugatie. Terwijl de stikstof samenstelling is afgenomen na de PEG modificatie en toegenomen na peptide wijziging, die de aanwezigheid van EGFR-gerichte peptide bevestigd op de nanodeeltjes. ESCA analyse heeft verder bevestigd PEG en peptide oppervlakte modificatie.
Electron Spectroscopy voor de chemische analyse van nanodeeltjes samenstelling van het oppervlak
| Formulering | C 1s (%) | O 1s (%) | N 1s (%) |
| SH-Gel NP | 59,3 ± 0,8 | 22,9 ± 0,5 | 12,9 ± 0,1 |
| SH-Gel-PEG | 58,2 ± 0,6 | 28,0 ± 1,2 | 9,5 ± 0,7 |
| SH-Gel PEG Peptide | 56,7 ± 0,8 | 25,9 ± 0,7 | 12,3 ± 0,6 |
| Formulering | CC (%) | CO, N (%) | C = O (% ) |
| SH-Gel NP | 51,5 | 26,6 | 21,9 |
| SH-Gel-PEG | 17,1 | 63,1 | 19,8 |
| SH-Gel PEG Peptide | 33,1 | 42,8 | 24,1 |
Tabel 2. C 1S hoge-resolutie scans van elektronen spectroscopie voor chemische analyse (ESCA)
Met het oog op de stabiliteit van de ingekapselde plasmide te onderzoeken, werden nanodeeltjes behandeld met protease of DNAse afzonderlijk, simuntaneously of opeenvolgend. Na elektroforese, zijn de resultaten in figuur 2 blijkt dat plasmide DNA ingekapseld in alle nanodeeltjes zijn beschermd door nanodeeltjes en stabiele, te vergelijken met naakt plasmide DNA. Bestudeerde deze hebben aangetoond dat al deze nanodeeltjes kunnen vatten en het behoud van het plasmide-structuur na het inkapselen.
/ Files/ftp_upload/3612/3612fig2.jpg "/>
Figuur 2. Stabiliteit van plasmide DNA ingekapseld in gethioleerde gelatine, PEG-gemodificeerde gethioleerde gelatine, en EGFR peptide-gemodificeerde gethioleerde gelatine nanodeeltjes door agarose gel elektroforese. De nanodeeltjes werden behandeld met 0,2 mg / ml protease om plasmide DNA inkapseling binnen de nanodeeltjes matrix te bewijzen
2. Baseline EGFR Expressie in alvleesklierkankercellen
Twee menselijke pancreas adenocarcinoom cellijnen (PAnC-1 en Capan-1) werden geanalyseerd door western blot voor EGFR expressie. Human ovariële adenocarcinoom (SKOV3) and murine fibroblasten ((NIH-3T3) cellen werden gekozen als positieve en negatieve controles, respectievelijk. Beta-actine werd geanalyseerd als eiwit laden van controle. PAnC-1-cellen hebben aangetoond hogere EGFR-expressie in vergelijking met Capan-1 en deze cellijn werd vervolgens gebruikt voor de volgende in-vitro-studies
3. Cytotoxiciteit van Control en Surface-Modified gethioleerde Gelatine Nanodeeltjes
Met het oog op de cellulaire interactie van nanodeeltjes te beoordelen, werden cytotoxiciteit testen uitgevoerd na de behandeling met nanodeeltjes. Op basis van de resultaten in figuur 3, zowel de controle en de oppervlakte-gemodificeerde nanodeeltjes waren relatief veilig en biocompatibel in PAnC-1 cellen, zelfs bij hoge concentraties, met een vergelijking met PEI. De volgende studies werden uitgevoerd met 1mg/ml nanodeeltjes.
Figuur 3. Percentage cellevensvatbaarheid als een functie van nanopartikelformulering concentraties in PAnC-1 cellen, zoals geëvalueerd door tetrazolium kleurstof (MTS) test
4. Receptor gemedieerde cel Opname in PAnC-1-cellen
Om te bevestigen oppervlak toegankelijkheid van EGFR-targeting peptide en receptor-gemedieerde endocytotische opname van nanodeeltjes, werd een systeem ontworpen door etikettering van elke component met verschillende fluorescentie voor de visualisatie van nanodeeltjes opname en de handel in cellen. Met deze etikettering, kan plasmide DNA, nanodeeltjes en celkern worden geïdentificeerd. Laser scanning confocale fluorescentie microscopie werd gebruikt om foto's te nemen op verschillende tijdstippen, van 15 minuten tot 6 uur. Door het vergelijken van de beelden van verschillende formuleringen, peptide geconjugeerd gelatine nanodeeltjes liet de snelle opname en plasmide-versie binnen 30 minuten. Dit resultaat verder bewezen dat EGFR peptide-geconjugeerde nanodeeltjes gefaciliteerd endocytose onderging met snelle interactie tussen de EGFR specifieke peptide en EGFR receptoren op het celoppervlak, die was veel sneller, in vergelijking met andere nanodeeltjes, die niet-specifieke endocytose onderging.
Cel mensenhandel Study
Figuur 4. Confocale fluorescentie microscopie eenALYSE van DNA-ingekapseld nanodeeltjes opname en de handel in PAnC-1 cellen. (Rood = rhodamine-label nanodeeltjes, groen = PicoGreen-gelabeld plasmide DNA, en blauw = DAPI-gelabeld nucleus). De laser macht was zeven keer minder in de laatste vier cijfers van onderste paneel.
5. Kwalitatieve en kwantitatieve In Vitro Transfectie met Enhanced Green Fluorescent Protein
ELISA in Figuur 5 en fluorescentie microscopische analyse in figuur 6 werden gebruikt om kwalitatieve en kwantitatieve GFP tranfection efficiëntie te meten in PAnC-1 cellen na toediening van niet-gemodificeerde, PEG-gemodificeerde en EGFR peptide-gemodificeerde gethioleerde gelatine nanodeeltjes. Plasmiden geleverd door EGFR-gerichte nanodeeltjes resulteerde in de hoogste niveau van GFP expressie na 48 uur ten opzichte van andere controles, met inbegrip Lipofectin-complex DNA.
Figuur 5. GFP expressie eennalyzed door ELISA uitgezet als functie van de tijd na de toediening van plasmide DNA in controle en EGFR-gerichte nanodeeltjes.
Fluorescentie Microscopische Analyse voor GFP transfectie
Figuur 6. Kwalitatieve analyse van groen fluorescerend eiwit expressie in PAnC-1 cellen door epifluoresence microscopie na 24, 48, 72 en 96 uur na de transfectie met EGFP-N1. Lipofectin-DNA-complex werd gebruikt als een positieve controle.
6. In Vitro Tranfection met wild-type p53 plasmide in PAnC-1-cellen
Wild-type p53 plasmiden Porf-hp53, met EF-1α / HTLV hybride promoter werden uit E. coli en ingekapseld in nanodeeltjes om de apoptotische therapeutisch effect te bestuderen. PAnC-1-cellen werden behandeld met deeltjes voor 6 uur en post-getransfecteerd voor extra 24, 48, 72, en 96 uur.
Sinds p53 kan apoptose in cellen te induceren en om deze functie te bereiken, zouden veel stroomafwaarts transcriptiefactoren betrokken worden en direct geregeld door expressie van wt-p53. Onder hen, zou Bax, caspase-3, caspase-9, DR5, PUMA en Apaf-een up-gereguleerd door expressie van p53 en terwijl Bcl-2, survivine zou worden down-gereguleerd. Om de niveaus van deze transcriptiefactoren te onderzoeken, werd mRNA geëxtraheerd uit PAnC-1-cellen na 48 uur na transfectie en gebruikt voor RT-PCR. De producten werden geëvalueerd met gel elektroforese en bands werden geanalyseerd met ImageJ. Op basis van de resultaten bleek in figuur 7, survivine significant afgenomen met de behandeling van EGFR gerichte gethioleerde gelatine nanodeeltjes in vergelijking met andere behandelingen, was er geen duidelijke verandering te zien in Bcl-2, Bax en expressie van caspase-3, caspase-9, DR5, PUMA en Apaf-1increased nanodeeltjes met gerichte behandeling.
les/ftp_upload/3612/3612fig7.jpg "/>
Figuur 7. MRNA niveaus van de downstream-factoren van wt-p53 expressie werden vergeleken met RT-PCR na 48 uur na transfectie.
Na wt-p53 transfectie, was chromatine condensatie / membraanpermeabiliteit / Dead Cell Apoptosis kit gebruikt om apoptotische cellen, necrotische cellen en levende cellen met verschillende kleurstoffen onderscheiden. iCys Onderzoek Imaging Cytometer uit CompuCyte (Westwood, MA) werd gebruikt om te analyseren en te vergelijken met het niveau apoptose na de behandeling. In vergelijking met de negatieve controle werden apoptotische cellen fold veranderingen berekend uit en opgenomen in figuur 8. EGFR-gerichte gethioleerde gelatine nanopaticles hebben aangetoond de hoogste apoptotische cellen bevolking na post-transfectie. Analyse van caspase 3 / 7 activiteit toonde ook aan dat EGFR-gerichte nanodeeltjes snelle internalisatie en hoogste niveau van apoptotische activiteit in PAnC-1-cellen had.
Figuur 8. Cytometrische analyse van de pro-apoptotische activiteit in de controle wt-p53 getransfecteerde PAnC-1-cellen met behulp van iCys ° Imaging Cytometer
Discussion
Controle en EGFR gerichte gethioleerde gelatine nanodeeltjes werden bereid met een efficiënte DNA-inkapseling en stabiliteit. De deeltjesgrootte van al deze systemen in het bereik van 150-250 nm in diameter. Zeta potentieel heeft bewezen dat dit systeem is een licht negatief systeem. Met de SEM-analyse, de grootte van nanodeeltjes waren hetzelfde met Zetasizer resultaat. ESCA analyse kan bevestigen PEG en peptide oppervlaktemodificatie.
Western blot analyse toonde aan dat PAnC-1-cellen een hoge EGFR expressie had en deze cellijn werd gebruikt voor de in vitro studies. Zowel de controle en de oppervlakte-gemodificeerde nanodeeltjes werden relatief minder cytotoxisch in PAnC-1 cellen ten opzichte van PEI.
Cel mensenhandel studies toonden een snelle opname en plasmide release van EGFR-gerichte nanodeeltjes in PAnC-1 cellen. Levering van reporter plasmiden DNA uiten met EGFR-gerichte nanodeeltjes resulteerde in de hoogste niveaus van deGFP expressie ten opzichte van andere controles, met inbegrip Lipofectin-complex DNA. Met hetzelfde systeem, transfectie met wt-p53 plasmide veroorzaakt de downstream apoptotische route en geïnduceerde apoptose in een snelle PAnC-1 cellen.
Deze voorlopige resultaten suggereren dat de EGFR-gerichte gethioleerde gelatine nanodeeltjes kan dienen als een veilige en efficiënte DNA-systeem voor de gentherapie als een behandeling voor pancreaskanker.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door Alliance het National Cancer Institute in Nanotechnologie voor Centrum voor Kanker Kanker Nanotechnologie Excellence (CCNE) subsidie U54-CA151881.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type B gelatin, Bloom 225 | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| 2-iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Elim Biopharm | N/A | |
| pORF-hp53 E. coli | Invitrogen | porf-hp53 | |
| Glyoxal solution (40wt. % in H2O) | Sigma-Aldrich | 128465 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225-250G | |
| QIA filter Plasmid Mega kit | Qiagen | 12281 | |
| Beckman LE 80K Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | N/A | |
| FreeZone 6 Liter Console Freeze Dry Systems | Labconco Corp. | 7753020 | |
| mPEG-SCM, MW 2,000 Da | Laysan Bio Inc. | mPEG-SCM-2K-1g | |
| MAL-PEG-SCM, MW 2,000 Da | Jenkem Technology | A5001-1 | |
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments | Zetasizer Nano ZS | |
| Hitachi 4800 field emission scanning electron microscope | Hitachi | S-4800 UHR FE-SEM | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits | Invitrogen | P7589 | |
| Lipofectin Transfection Reagent | Invitrogen | 18292011 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10 013 CM | |
| RPMI | Mediatech, Inc. | 50 020 PB | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 | |
| iBlot Dry Blotting System | Invitrogen | IB1001 | |
| XCellSureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark | Invitrogen | EI0002 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 32109 | |
| Kodak Digital X-ray Specimen (DXS) System | Kodak | N/A | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega Corp. | G3580 | |
| BioTek SynergyHT plate reader | BioTek | N/A | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | N/A | |
| One-step RT-PCR kit | Qiagen | 210212 | |
| Chromatin Condensation/Membrane Permeability/Dead Cell Apoptosis Kit | Invitrogen | V23201 | |
| Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay kit | Promega Corp. | G7790 | |
| Hybaid PCR Sprint Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, Inc. | N/A | |
| EGF Receptor Antibody | Cell Signaling Technology | 2232 | |
| β-Actin Antibody | Cell Signaling Technology | 4967 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| Mouse Monoclonal GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-597 | |
| Goat Polyclonal GFP antibody (Alkaline Phosphatase) | Novus Biologicals | NB600-1502 | |
| Phosphatase Substrate Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 37620 |
References
- Vimalachandran, D. Genetics and prevention of pancreatic cancer. Cancer. Control. 11, 6-14 (2004).
- Kommareddy, S., Amiji, M. Preparation and evaluation of thiol-modified gelatin nanoparticles for intracellular DNA delivery in response to glutathione. Bioconjug. Chem. 16, 1423-1432 (2005).
- Kommareddy, S., Amiji, M. Poly(ethylene glycol)-modified thiolated gelatin nanoparticles for glutathione-responsive intracellular DNA delivery. Nanomedicine. 3, 32-42 (2007).
- Kommareddy, S., Amiji, M. Antiangiogenic gene therapy with systemically administered sFlt-1 plasmid DNA in engineered gelatin-based nanovectors. Cancer. Gene. Ther. 14, 488-498 (2007).
- Kommareddy, S., Amiji, M. Biodistribution and pharmacokinetic analysis of long-circulating thiolated gelatin nanoparticles following systemic administration in breast cancer-bearing mice. J. Pharm. Sci. 96, 397-407 (2007).
- Kaul, G., Amiji, M. Tumor-targeted gene delivery using poly(ethylene glycol)-modified gelatin nanoparticles: in vitro and in vivo studies. Pharm. Res. 22, 951-961 (2005).
- Bardeesy, N., DePinho, R. A. Pancreatic cancer biology and genetics. Nat. Rev. Cancer. 2, 897-909 (2002).
- Li, Z. Identification and characterization of a novel peptide ligand of epidermal growth factor receptor for targeted delivery of therapeutics. FASEB. J. 19, 1978-1985 (2005).
- McCormick, F. Cancer gene therapy: fringe or cutting edge. Nat. Rev. Cancer. 1, 130-141 (2001).
- Green, D. R., Kroemer, G. Cytoplasmic functions of the tumour suppressor p53. Nature. 458, 1127-1130 (2009).
- Barton, C. M. Abnormalities of the p53 tumour suppressor gene in human pancreatic cancer. Br. J. Cancer. 64, 1076-1082 (1991).
