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Bioengineering

जीन और मानव अग्नाशय के कैंसर epidermal वृद्धि कारक का उपयोग कक्ष में डिलिवरी अभिकर्मक जिलेटिन आधारित इंजीनियर Nanovectors रिसेप्टर - लक्षित

doi: 10.3791/3612 Published: January 4, 2012

Summary

प्रकार बी जिलेटिन आधारित इंजीनियर nanovectors प्रणाली (Gens) प्रणालीगत जीन और अग्नाशय के कैंसर के इलाज में प्रसव अभिकर्मक के लिए विकसित किया गया था. Epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर (EGFR) nanparticles की सतह पर विशिष्ट पेप्टाइड के साथ संशोधन करके, वे EGFR रिसेप्टर पर लक्षित और पर्यावरण को कम करने जैसे उच्च intracellular glutathione सांद्रता के तहत प्लाज्मिड रिहाई सकता है.

Protocol

1. प्लास्मिड डीएनए तैयार EGFR - लक्षित जिलेटिन नैनोकणों समझाया

  1. Thiolated जिलेटिन के संश्लेषण
    1. Thiolated जिलेटिन पिछले 2-5 2 iminothiolane के साथ ग्रुप बी जिलेटिन के प्राथमिक एमिनो समूहों पर सहसंयोजक संयुग्मन विधि द्वारा, के रूप में संश्लेषित किया गया. 1 ग्राम जिलेटिन की 100 मिलीलीटर विआयनीकृत जल में भंग कर दिया गया था और 15 घंटे के लिए 20 मिलीग्राम 2 कमरे के तापमान पर iminothiolane हाइड्रोक्लोराइड साथ incubated.
    2. Unreacted अभिकर्मक 5 मिमी एचसीएल समाधान, 3 घंटे के लिए प्रत्येक 1 मिमी एचसीएल समाधान द्वारा बाद के खिलाफ डायलिसिस द्वारा हटा दिया गया था. शुद्ध thiolated जिलेटिन सूखे और 4 बजे ° आगे उपयोग के लिए सी संग्रहीत फ्रीज किया गया था.
  2. डीएनए युक्त नैनोकणों तैयार
    1. 200 मिलीग्राम thiolated जिलेटिन पानी और समाधान के पीएच में भंग कर दिया गया था 0.2 एम NaOH समाधान के अलावा द्वारा 7 करने के लिए समायोजित किया गया था. 1mg डीएनए जोड़ा था और धीरे जिलेटिन समाधान के साथ मिश्रित.
    2. धीरे धीरे ठंडा इथेनॉल मिश्रण में जोड़ा गया है, जबकिउच्च गति पर सरगर्मी समाधान. नैनोकणों जब विलायक संरचना 75 पन शराबी समाधान% करने के लिए बदल गठन किया गया.
    3. नैनोकणों आगे 0.1 मिलीलीटर 8% (v / v) glyoxal समाधान की धीमी अलावा द्वारा Crosslinked थे. Unreacted अभिकर्मकों 0.5 मिलीलीटर 0.2 एम ग्लाइसिन समाधान के साथ quenched थे.
    4. नैनोकणों 30 मिनट के लिए 16,000 rpm पर अल्ट्रा centrifuged थे. हिमपात विआयनीकृत पानी से धोया गया और दो बार शुद्ध नैनोकणों फ्रीज सूखे और 4 में संग्रहीत किया गया डिग्री सेल्सियस
  3. नैनोकणों के सतह संशोधन
    1. नैनोकणों 0.1 एम फॉस्फेट बफर (7.4 पीएच) में 10 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के साथ निलंबित कर दिया गया और methoxy खूंटी succinimidyl carboxy मिथाइल (MPEG-SCM, मेगावाट २००० दा) एस्टर या carboxy maleimide खूंटी succinimidyl 2 बार वजन साथ incubated methylester धीमी सरगर्मी के साथ कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए (मल - खूंटी SCM, मेगावाट २००० दा).
    2. PEGylated नैनोकणों अल्ट्रा centrifugation के साथ 30 मिनट के लिए 16,000 rpm पर एकत्र किए गए थेएस हिमपात विआयनीकृत पानी से धोया गया और दो बार शुद्ध नैनोकणों फ्रीज सूखे और 4 में संग्रहीत किया गया डिग्री सेल्सियस
    3. मल - खूंटी - SCM संशोधित नैनोकणों 0.1M फॉस्फेट बफर (6.5 पीएच) में 10mg/ml की एकाग्रता के साथ निलंबित कर दिया गया और EGFR धीमी सरगर्मी के साथ कमरे के तापमान पर 6 घंटे के लिए विशिष्ट पेप्टाइड (YHWYGYTPQNVI GGGGC) के 10% वजन के साथ incubated.
    4. पेप्टाइड संशोधित नैनोकणों अल्ट्रा centrifugation के साथ 30 मिनट के लिए 16,000 rpm पर एकत्र किए गए थे. हिमपात विआयनीकृत पानी से धोया गया और दो बार शुद्ध नैनोकणों फ्रीज सूखे और 4 में संग्रहीत किया गया डिग्री सेल्सियस

2. EGFR लक्षित नैनोकणों की विशेषता

  1. कण आकार और जीटा संभावित माप
    नैनोकणों 1mg/ml की एकाग्रता के साथ पानी में निलंबित कर दिया गया. सस्पेंशन Zetasizer नैनो (Malvern इंक) का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया गया था. कण आकार विश्लेषण 90 डिग्री के एक बिखरने कोण पर 25 में किया गया °सी. जीटा संभावित ढांकता हुआ निरंतर, अपवर्तक सूचकांक और पानी का चिपचिपापन का डिफ़ॉल्ट मापदंडों पर 25 पर मापा गया था डिग्री सेल्सियस
  2. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
    Lyophilized नैनोकणों एल्यूमीनियम नमूना माउंट पर घुड़सवार थे और पैलेडियम चालकता बढ़ाने और शुल्कों के buildup को कम से कम के साथ धूम - लेपित. नमूने सतह आकारिकी के लिए एक Hitachi 4800 क्षेत्र 3 केवी में स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप उत्सर्जन के तहत मनाया गया.
  3. रासायनिक विश्लेषण के लिए इलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोप (ESCA)
    रुक सूखे नियंत्रण तैयार करने, PEGylated और पेप्टाइड संशोधित नैनोकणों ESCA द्वारा विश्लेषण किया गया. यह राष्ट्रीय ESCA और भूतल विश्लेषण केंद्र बायोमेडिकल समस्याओं के लिए (/ NESAC जैव), वाशिंगटन विश्वविद्यालय (सिएटल, WA) में प्रदर्शन किया गया था.
    1. नमूने ultrahigh निर्वात में रखा गया और कम ऊर्जा एक्स - रे किरण है, जो सतह से माध्यमिक photoelectrons के एक उत्सर्जन प्रेरित को उजागर.
    2. बिन के एक समारोह के रूप में पता लगाया इलेक्ट्रॉनों की संख्या की साजिश रचनेडिंग ऊर्जा, मनाया स्पेक्ट्रम चोटियों प्रत्येक रासायनिक घटकों को सौंपा गया.
    3. C1s स्पेक्ट्रा के उच्च संकल्प विश्लेषण सटीक हाइड्रोकार्बन से रासायनिक संरचना (सीसी या 285mV में दर्पण), 286.4mV पर ईथर (सीओ)), और कार्बोनिल (288.1 एम वी सी = ओ), और प्रत्येक कार्यक्षमता के रिश्तेदार संरचना निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन किया था वक्र के तहत क्षेत्र द्वारा निर्धारित किया गया था.
  4. समझाया प्लाज्मिड की स्थिरता
    समझाया प्लास्मिड डीएनए की स्थिरता पूर्व डाली जैल पर निकाली डीएनए चलाकर पुष्टि की गई. नैनोकणों 0.2 मिलीग्राम / एमएल पीबीएस (37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट) और 0.2 यू / मिलीलीटर DNase (10min कमरे के तापमान पर) अलग से युक्त protease के साथ पचा थे, एक साथ या sequentially. नमूने तो अच्छी तरह से प्रति एक 18μL मात्रा में 100ng/well की एकाग्रता में 1.2% agarose जेल (जीपी) (ई - जेल, Invitrogen, सीए) पर लोड थे. प्लाज्मिड नंगे नियंत्रण के रूप में भरी हुई थी और जेल में 30 मिनट के लिए 75 वी पर चलाया गया था. कोडक डिजिटल नमूना एक्स - रे सिस्टम (DXS) ख कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया थायूवी transluminescence साथ ands.
  5. प्लाज्मिड लोड हो रहा है का निर्धारण
    प्लाज्मिड समझाया नैनोकणों 1mg/ml पर निलंबित कर दिया गया है और 37 पर 0.2mg/ml protease साथ पचा डिग्री सेल्सियस 30 मिनट के लिए. समाधान १३,००० rpm पर 10 मिनट के लिए centrifuged था और सतह पर तैरनेवाला एकत्र और Picogreen परख (Invitrogen) के साथ प्लाज्मिड एकाग्रता के लिए परीक्षण किया गया था. इनकैप्सुलेशन अनुपात प्रारंभिक लोड हो रहा है 0.5% (w / w) के साथ समझाया प्लाज्मिड एकाग्रता विभाजित करके गणना की थी.

3. Panc-1 अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं में इन विट्रो अभिकर्मक अध्ययन में

  1. सेल संस्कृति शर्तों
    Panc-1 और Capan 1 अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता सेल लाइनों, ATCC SKOV3, डिम्बग्रंथि ग्रंथिकर्कटता सेल लाइन और NIH-3T3 murine fibroblast सेल लाइन से प्राप्त किया गया. Panc-1 और NIH-3T3 DMEM 37 एल glutamine, पेन strep और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ आपूर्ति की डिग्री सेल्सियस और 5% 2 सीओ, जबकि Capan-1 आवश्यक DMEM 20% भ्रूण गोजातीय सीरम की आपूर्ति के साथ बड़े हो रहे थेSKOV3, RPMI 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ की आपूर्ति 1640 में हो गया था.
  2. EGFR अभिव्यक्ति के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण
    1. सेल lysates 2 मिलियन कोशिकाओं से एकत्र किए गए थे और कुल प्रोटीन एकाग्रता के लिए बीसीए परख (पियर्स) का उपयोग कर विश्लेषण किया. NIH-3T3 नकारात्मक नियंत्रण और SKOV3, EGFR अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था के रूप में इस्तेमाल किया गया था.
    2. कुल प्रोटीन निकालने के 10 μg पूर्व डाली सोडियम dodecyl जेल सल्फेट polyacrylamide वैद्युतकणसंचलन प्रणाली (एसडीएस पृष्ठ) पर 135V में 90 मिनट के लिए चलाया गया था.
    3. इसके बाद, जेल PVDF झिल्ली पर iBlot ड्राई सोख्ता प्रणाली (Invitrogen) के द्वारा स्थानांतरित किया गया था.
    4. झिल्ली 5% के बीच युक्त Tris बफर खारा (टीबीएस टी) में गैर वसा दूध के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए बंद किया गया था.
    5. झिल्ली काट था और प्राथमिक बीटा actin खरगोश एंटीबॉडी के 1:1,000 कमजोर पड़ने और प्राथमिक खरगोश EGFR एंटीबॉडी के 1:1,000 कमजोर पड़ने के साथ incubated अलग से 4 बजे रातोंरात डिग्री सेल्सियस
    6. तो झिल्ली के साथ दो बार धोयाटीबीएस - टी और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 1:2,000 माध्यमिक विरोधी - खरगोश घोड़े - मूली peroxidase संयुग्मित टीबीएस - टी में आईजीजी की dilutions के साथ incubated .
    7. टीबीएस - टी और पानी के साथ अतिरिक्त एंटीबॉडी rinsing के बाद, 4 मिलीलीटर ईसीएल सब्सट्रेट (पियर्स, रॉकफोर्ड, आईएल, संयुक्त राज्य अमेरिका) जोड़ा गया था और 5 मिनट के लिए झिल्ली के साथ incubated.
    8. Chemiluminescent बैंड तो कोडक डिजिटल नमूना एक्स - रे सिस्टम (DXS) का उपयोग करते हुए कल्पना थे.
  3. विभिन्न योगों के साथ सेल व्यवहार्यता अध्ययन
    1. पूरक DMEM रातोंरात 200μL में 10,000 अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं पर Panc-1 कोशिकाओं 96 अच्छी तरह प्लेटों में बड़े हो रहे थे.
    2. ग्रोथ मध्यम सीरम मुक्त 0 के साथ नैनोकणों के विभिन्न सांद्रता वाले मीडिया, 0.5, 1, 2, 4, 6 मिलीग्राम / एमएल के साथ बदल दिया गया था. 1mg/ml पी, एक ज्ञात साइटोटोक्सिक cationic बहुलक, सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था.
    3. कक्ष 6 घंटे के लिए 200μL नैनोकणों के साथ इलाज किया गया और तब 20μL टन अभिकर्मक और पूरा 100μL के साथ प्रतिस्थापितसंस्कृति मीडिया.
    4. पोस्ट ऊष्मायन के बाद 3 घंटे के लिए 37 ° सी 5% में सीओ 2, formazan उत्पाद के absorbance Biotek SynergyHT प्लेट रीडर (Winooski, VT) के साथ 490nm पर मापा गया था .
    5. प्रतिशत कक्षों की व्यवहार्यता बहुलक इलाज 100 से गुणा नकारात्मक (0mg/ml) नियंत्रण के सापेक्ष कोशिकाओं के absorbance के अनुपात के रूप में व्यक्त की गई थी और बहुलक सांद्रता के समारोह के रूप में प्लॉट किए जाते हैं.
  4. सेल तस्करी पढ़ाई
    1. Rhodamine बी आइसोथियोसाइनेट (RBITC) amine समूह के साथ प्रतिक्रिया द्वारा thiolated जिलेटिन संयुग्म के लिए इस्तेमाल किया गया था. डायलिसिस और lyophilization के बाद, RBITC लेबल thiolated जिलेटिन नैनोकणों तैयारी के लिए इस्तेमाल किया गया था.
    2. Desolvation पहले, 25μL PicoGreen 1 मिनट के लिए प्लाज्मिड 1mg के साथ मिलाया गया था और लेबल plasmids जिलेटिन समाधान के लिए जोड़ा गया था. विभिन्न योगों पिछले विधि के बाद किए गए थे.
    3. Panc-1 कोशिकाओं 6 अच्छी तरह प्लेटों में बड़े हो रहे थे, 200000 कोशिकाओं के साथ कांच कवर - फिसल जाता है युक्त पीअच्छी तरह एर. रातोंरात वृद्धि के बाद, लेबल नैनोकणों के 2ml प्रत्येक कुएं में 1mg/ml सीरम मुक्त माध्यम में एकाग्रता के साथ इलाज किया गया.
    4. अलग समय अंक के बाद, 15 मिनट से 6 घंटे के लिए मध्यम संस्कृति कमरे के तापमान पर 15 मिनट ऊष्मायन के लिए 33342 hoest (Invitrogen) के 1μg/ml युक्त माध्यम के साथ बदल दिया गया था. 2ml 4% paraformaldehyde समाधान के प्रत्येक कुएं में बदल दिया गया था करने के लिए कोशिकाओं को ठीक. कक्ष फिर PBS के साथ दो बार धोया गया.
    5. Coversilps गिलास स्लाइड पर घुड़सवार थे. लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी प्रतिदीप्ति तय कोशिकाओं के चित्र लेने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
  5. समझाया pEGFP-N1 के साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा अभिकर्मक दक्षता के गुणात्मक दृढ़ संकल्प नैनोकणों
    1. pEGFP-N1 plasmids नैनोकणों में समझाया गया और आगे के उपचार के लिए मिलीलीटर प्रति 10μg plasmids के बराबर एकाग्रता के साथ सीरम स्वतंत्र मीडिया में निलंबित कर दिया.
    2. Panc 1 कोशिकाओं रातोंरात 6 अच्छी तरह प्लेटें contai में बड़े हो रहे थेअच्छी तरह से प्रति 200,000 कोशिकाओं के साथ कांच के कवर फिसल जाता है ning. 2ml pEGFP N1 plasmids समझाया नैनोकणों के एक कुएँ में इलाज किया गया. Plasmids के 20μg 20μl Lipofectin, cationic लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ मिलाया गया है, और यह सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, जबकि अनुपचारित कोशिकाओं नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया.
    3. कक्ष 6 घंटे के लिए विभिन्न योगों के साथ incubated रहे थे.
    4. मध्यम संस्कृति मध्यम और कोशिकाओं को 24, 48, 72, और 96 घंटे के लिए पोस्ट ट्रांसफ़ेक्ट थे के साथ बदल दिया गया था.
    5. बाद अभिकर्मक के बाद, मध्यम संस्कृति 33342 hoest (Invitrogen) 1μg/ml युक्त मध्यम के साथ बदल दिया गया था और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं के साथ incubated.
    6. Coverslips गिलास स्लाइड पर घुड़सवार थे और GFP की कोशिकाओं में अभिव्यक्ति प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी से मनाया गया. अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) और प्रतिदीप्ति छवियों ओलिंप BX61 खुर्दबीन और डिजिटल छवियों छवि जम्मू सॉफ्टवेयर के साथ संसाधित का उपयोग हासिल कर ली.
  6. pEGFP-N1 plasmids नैनोकणों में समझाया गया और आगे के उपचार के लिए मिलीलीटर प्रति 10μg plasmids के बराबर एकाग्रता के साथ सीरम स्वतंत्र मीडिया में निलंबित कर दिया.
  7. Panc-1 कोशिकाओं रात 6 अच्छी तरह प्लेटें में अच्छी तरह से प्रति 200,000 कोशिकाओं के साथ बड़े हो रहे थे. 2ml pEGFP N1 plasmids समझाया नैनोकणों के एक कुएँ में इलाज किया गया. Plasmids के 20μg 20μl Lipofectin, cationic लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक, जो सकारात्मक नियंत्रण और इलाज कोशिकाओं नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया थे के रूप में इस्तेमाल किया गया था के साथ मिलाया गया.
  8. कक्ष 6 घंटे के लिए विभिन्न योगों के साथ incubated रहे थे.
  9. मध्यम संस्कृति मध्यम और कोशिकाओं के बाद 24, 48, 72, और 96 घंटे के लिए incubated रहे थे के साथ बदल दिया गया था.
  10. बाद अभिकर्मक के बाद, सेल lysates एक अच्छी तरह से एकत्र किए गए थे और कुल प्रोटीन एकाग्रता के लिए बीसीए परख (पियर्स) का उपयोग विश्लेषण.
  11. अच्छी तरह से थाली सीओए थाटेड 100μl प्रत्येक कुएं में 1:1000 के मोनोक्लोनल विरोधी GFP एंटीबॉडी dilutions के साथ. 2 घंटे ऊष्मायन के बाद, थाली पीबीएस - 0.5% (w / v) 4 बार के लिए बीच-80 के साथ धुल गया था.
  12. 300μl टीबीएस अवरुद्ध buffers के एक कुएँ में जोड़ा गया था और 2 घंटे के लिए incubated. फिर थाली तो पीबीएस - 0.5% (w / v) 4 बार के लिए बीच-80 के साथ धोया गया था.
  13. प्रत्येक समूह के प्रोटीन की 30μg थाली में जोड़ा गया था और 4 ° रात incubated. फिर थाली तो पीबीएस - 0.5% (w / v) 4 बार के लिए बीच-80 के साथ धोया गया था.
  14. 100μl माध्यमिक विरोधी GFP alkaline फॉस्फेट के सापेक्ष एंटीबॉडी के 1:2400 dilutions की एक अच्छी तरह से जोड़ा गया था और 1 घंटे के लिए incubated. फिर थाली तो पीबीएस - 0.5% (w / v) 4 बार के लिए बीच-80 के साथ धोया गया था.
  15. 100μl alkaline फॉस्फेट substrates एक अच्छी तरह से जोड़ा गया था और 30 मिनट पहले 1 घंटे के लिए incubated. प्लेट Biotek सिनर्जी एचटी प्लेट रीडर के साथ absorbance के लिए 405nm पर मापा गया था.
  16. व्यक्त GFP एकाग्रता मील प्रति nanograms के रूप में सूचना मिली थीकुल प्रोटीन की lligrams.
  • RT-पीसीआर द्वारा अभिकर्मक दक्षता के गुणात्मक WT-p53 प्लाज्मिड समझाया नैनोकणों के साथ दृढ़ संकल्प
    1. Wt-p53 plasmids नैनोकणों में समझाया गया और सीरम एकाग्रता 10μg आगे के उपचार के लिए प्लाज्मिड प्रति मिलीलीटर के बराबर के साथ स्वतंत्र मीडिया में निलंबित कर दिया.
    2. Panc-1 कोशिकाओं रात 6 अच्छी तरह प्लेटें में अच्छी तरह से प्रति 200,000 कोशिकाओं के साथ बड़े हो रहे थे. 2ml WT-p53 plasmids समझाया नैनोकणों के प्रत्येक अच्छी तरह से में इलाज किया गया. Plasmids के 20μg 20μl Lipofectin, cationic लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक, जो सकारात्मक नियंत्रण और इलाज कोशिकाओं नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया थे के रूप में इस्तेमाल किया गया था के साथ मिलाया गया.
    3. कक्ष 6 घंटे के लिए विभिन्न योगों के साथ incubated रहे थे.
    4. मध्यम संस्कृति मध्यम और कोशिकाओं के बाद 48 घंटे के लिए incubated रहे थे के साथ बदल दिया गया था.
    5. mRNA उच्च शुद्ध आरएनए अलगाव किट (Roche, इंडियानापोलिस में,) का उपयोग करके प्रत्येक कुएं से निकाले थे और 2000 Nanodrop साथ मापा (टीhermo वैज्ञानिक, Wilminton, डे).
    6. RT-पीसीआर QIAGEN का उपयोग करके किया गया था एक कदम RT-पीसीआर किट (QIAGEN, वालेंसिया, सीए). P53 के लिए प्राइमर्स, Bax, बीसीएल-2, बीटा actin, DR5, Apaf-1, PUMA, survivin Eurofins MWG operon (Huntsville, AL) द्वारा संश्लेषित किया गया.
    7. पीसीआर उत्पादों जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ मूल्यांकन किया गया और सीडीएनए बैंड के पिक्सल ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया गया.
  • Wt-p53 के साथ चिकित्सकीय दक्षता के मात्रात्मक निर्धारण समझाया नैनोकणों palsmid
    1. प्लाज्मिड wt-p53 नैनोकणों में समझाया गया था और आगे के इलाज के लिए मिलीलीटर प्रति 10μg plasmids करने के लिए एकाग्रता बराबर के साथ सीरम मुक्त मीडिया में निलंबित कर दिया.
    2. Panc-1 कोशिकाओं रात 6 अच्छी तरह प्लेटें में अच्छी तरह से प्रति 200,000 कोशिकाओं के साथ बड़े हो रहे थे. 2ml WT-p53 plasmids समझाया नैनोकणों के प्रत्येक अच्छी तरह से में इलाज किया गया. Plasmids के 20μg 20μl Lipofectin, cationic लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक, जो सकारात्मक नियंत्रण और इलाज कोशिकाओं थे के रूप में इस्तेमाल किया गया था के साथ मिलाया गयानकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया.
    3. कक्ष 6 घंटे के लिए विभिन्न योगों के साथ incubated रहे थे.
    4. मध्यम संस्कृति मध्यम और कोशिकाओं के बाद 24, 48, 72, और 96 घंटे के लिए incubated रहे थे के साथ बदल दिया गया था.
    5. Chromatin पारगम्यता / संघनन झिल्ली / मृत सेल apoptosis किट (Invitrogen, Carlsbad, CA) apoptotic कोशिकाओं, परिगलित कोशिकाओं और विभिन्न रंगों के साथ जीवित कोशिकाओं लेबल इस्तेमाल किया गया था.
    6. iCys CompuCyte से अनुसंधान इमेजिंग cytometer (वेस्टवुड, एमए) के विश्लेषण और उपचार के बाद apoptosis स्तर की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. प्रतिदीप्ति सूक्ष्म छवियों के आधार पर, सभी रंग की तीव्रता दर्ज किया गया था और विभिन्न आबादी की गणना की गई के लिए मायने रखता है और प्रतिशत बनाम प्लॉट.
    7. नकारात्मक नियंत्रण, जिसका अर्थ है वहाँ कक्षों के लिए कोई इलाज था की तुलना में, apoptotic कोशिकाओं गुना परिवर्तन बाहर गणना की गई और ग्राफ में सूचीबद्ध है.
    8. 3.8.8 वन - ए पी ओ सजातीय कस्पासे 3 / 7 परख किट (Promega, मैडिसन, WI) पी की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाRo-apoptotic wt-p53 के अभिकर्मक प्लाज्मिड के बाद गतिविधि. 1mg/ml पी एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था सभी apoptotic गतिविधि को समाप्त किया गया. बाद अभिकर्मक के बाद, कोशिकाओं rhodamine 110 के साथ इलाज किया गया, (एन CBZL - aspartyl एल glutamyl - एल valyl - एल एसपारटिक एसिड एमाइड, z-DEVD-R110) बीआईएस है, जो कस्पासे की एक सब्सट्रेट है 3 / 7 अप करने के लिए 18 घंटे के लिए.
    9. प्लेट Biotek 490/520 एनएम पर सिनर्जी एचटी प्रतिदीप्ति के लिए प्लेट पाठक के साथ मापा गया था. हरी प्रतिदीप्ति की तीव्रता के आधार पर, समर्थक apoptotic गतिविधि का मूल्यांकन किया जा सकता है.
  • 4. प्रतिनिधि परिणाम

    1. संश्लेषण और EGFR लक्षित नैनोकणों के Chatacterization

    EGFR लक्ष्यीकरण पेप्टाइड संशोधित नैनोकणों के रूप में योजना संख्या 1 में दिखाया संश्लेषित थे. desolvation द्वारा तैयार नैनोकणों कण आकार और क्षमता जीटा के लिए विशेषता थे. कणों का औसत आकार और सतह के प्रभारी thiolated gelatins से तैयारसाथ thiolation के विभिन्न डिग्री तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं. विभिन्न नैनोकणों के मतलब कण व्यास 150-250 एनएम के बीच थे. Thiolated नैनोकणों जिलेटिन नैनोकणों छोटे आकार की तुलना में है, की वजह से कणों के अंदर डाइसल्फ़ाइड पुल गठन के लिए हो सकता है. अलग सतह संशोधनों के साथ, नैनोकणों के आकार में वृद्धि हुई है. विभिन्न योगों के जीटा क्षमता -20 एम वी के आसपास थे. SEM विश्लेषण के साथ, आकार, सतह morphology और नैनोकणों के गोलाकार आकार मनाया गया और Zetasizer परिणाम के लिए इसी. जिलेटिन नैनोकणों और thiolated जिलेटिन नैनोकणों में डीएनए लोडिंग क्षमता 95% (तालिका 1) की तुलना में अधिक थे.

    चित्रा 1
    चित्रा 1 केमिकल रिएक्शन योजना, illustrating के epidermal वृद्धि वास्तविक साथ thiolated जिलेटिन नैनोकणों के सतह संशोधनआर रिसेप्टर (EGFR) को एक पाली (ethylene glycol) स्पेसर (खूंटी) के माध्यम से बाध्यकारी पेप्टाइड.

    नैनोकणों की विशेषता

    सूत्रीकरण Nanoparticle व्यास (एनएम) जीटा संभावित (mV) प्लास्मिड डीएनए लोड हो रहा है क्षमता (%)
    जेल एनपी 151.4 ± 23.5 -17.1 ± 5.23 95.6 ± 2.2
    एनपी एसएच-जेल 132.6 ± 17.9 -24.6 ± 5.16 97.0 ± 3.8
    एसएच जेल - खूंटी 179.0 ± 30.9 -22.3 ± 9.50 95.8 ± 6.5
    एसएच जेल खूंटी पेप्टाइड 230.8 ± 41.5 -18.1 ± 4.02 94.8 ± 5.1

    धन्यवादble एक नियंत्रण और EGFR लक्षित जिलेटिन और thiolated जिलेटिन नैनोकणों के कण आकार, सतह प्रभारी, और प्लास्मिड डीएनए encapsulation क्षमता.

    उच्च संकल्प सी 1S रासायनिक विश्लेषण के लिए इलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी (ESCA) के स्कैन thiolated (एनपी एसएच-जेल) जिलेटिन, खूंटी संशोधित thiolated जिलेटिन (खूंटी एसएच-जेल) और EGFR की सतह घटक पेप्टाइड संशोधित thiolated जिलेटिन लक्ष्यीकरण का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था नैनोकणों (एसएच जेल खूंटी पेप्टाइड). तालिका 2 में परिणाम 285.0 पर (हाइड्रोकार्बन) दर्पण, सीओ (ईथर), और सी = (कार्बोनिल) हे समूहों के चरम तीव्रता, 286.3, 288.1 eV, क्रमशः से पता चला. ईथर सीओ संकेत खूंटी संशोधन के बाद बढ़ गया है और पेप्टाइड संयुग्मन के बाद की कमी हुई. जबकि नाइट्रोजन रचना खूंटी संशोधन के बाद गिरावट आई है और पेप्टाइड संशोधन, जो नैनोकणों पर EGFR-लक्ष्यीकरण पेप्टाइड की उपस्थिति की पुष्टि के बाद वृद्धि हुई. ESCA विश्लेषण आगे खूंटी और पेप्टाइड सतह संशोधन की पुष्टि की है.

    नैनोकणों के सतह की संरचना के रासायनिक विश्लेषण के लिए इलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी

    सूत्रीकरण सी 1s (%) हे 1s (%) एन 1s (%)
    एनपी एसएच-जेल 59.3 ± 0.8 22.9 ± 0.5 12.9 ± 0.1
    एसएच जेल - खूंटी 58.2 ± 0.6 28.0 ± 1.2 9.5 ± 0.7
    एसएच जेल खूंटी पेप्टाइड 56.7 ± 0.8 25.9 ± 0.7 12.3 ± 0.6
    सूत्रीकरण सीसी (%) सीओ एन, (%) सी = हे (% )
    एनपी एसएच-जेल 51.5 26.6 21.9
    एसएच जेल - खूंटी 17.1 63.1 19.8
    एसएच जेल खूंटी पेप्टाइड 33.1 42.8 24.1

    टेबल 2 सी 1S संकल्प उच्च इलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी के स्कैन रासायनिक विश्लेषण (ESCA) के लिए

    आदेश में समझाया प्लाज्मिड की स्थिरता की जांच करने के लिए, नैनोकणों protease DNase या अलग के साथ इलाज किया गया, simuntaneously या sequentially. वैद्युतकणसंचलन के बाद, चित्रा 2 में परिणाम से पता चला है कि सभी नैनोकणों में समझाया प्लास्मिड डीएनए नैनोकणों और स्थिर, तुलनीय नग्न प्लास्मिड डीएनए द्वारा संरक्षित हैं. अध्ययन ये पता चला है कि इन सभी नैनोकणों encapsulate और encapsulation के बाद प्लाज्मिड संरचना के संरक्षण सकता है.

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    चित्रा 2 प्लाज्मिड thiolated जिलेटिन में समझाया डीएनए की स्थिरता, खूंटी संशोधित जिलेटिन thiolated, और EGFR agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा thiolated जिलेटिन नैनोकणों पेप्टाइड संशोधित. नैनोकणों 0.2 protease की मिलीग्राम / मिलीलीटर के साथ इलाज किया गया nanoparticle मैट्रिक्स के भीतर प्लास्मिड डीएनए encapsulation साबित

    2. अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं में बेसलाइन EGFR अभिव्यक्ति

    दो मानव अग्नाशय के adenocarcinoma के सेल लाइनों (Panc-1 और Capan-1) EGFR अभिव्यक्ति के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण किया गया. मानव डिम्बग्रंथि (SKOV3) ग्रंथिकर्कटता और murine (fibroblast कोशिकाओं (NIH-3T3) सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में चुने गए हैं, क्रमशः बीटा actin प्रोटीन लोड हो रहा है नियंत्रण के रूप में विश्लेषण किया गया था. Panc 1-कक्षों Capan-1 की तुलना में उच्च EGFR अभिव्यक्ति दिखाया और इस सेल लाइन तो इन विट्रो अध्ययन में निम्नलिखित के लिए इस्तेमाल किया गया था

    3. नियंत्रण और Surfa के cytotoxicityCE-संशोधित जिलेटिन नैनोकणों Thiolated

    आदेश में नैनोकणों के सेलुलर बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए, cytotoxicity assays नैनोकणों के साथ इलाज के बाद बाहर किए गए. चित्रा 3 में परिणाम के आधार पर, दोनों नियंत्रण और सतह संशोधित नैनोकणों Panc एक उच्च सांद्रता में भी कोशिकाओं में अपेक्षाकृत सुरक्षित और biocompatible पी की तुलना के साथ थे. निम्नलिखित अध्ययनों 1mg/ml नैनोकणों के साथ किया गया.

    चित्रा 3
    चित्रा 3. प्रतिशत Panc-1 कोशिकाओं में nanoparticle तैयार सांद्रता के एक समारोह के रूप में सेल व्यवहार्यता के रूप में tetrazolium (टन) डाई परख द्वारा मूल्यांकन

    4. Panc - एक कक्ष में रिसेप्टर मध्यस्थता सेल तेज

    EGFR लक्ष्यीकरण पेप्टाइड और रिसेप्टर मध्यस्थता नैनोकणों के endocytotic तेज की सतह पहुँच की पुष्टि करने के लिए, एक प्रणाली प्रत्येक सह लेबलिंग के द्वारा डिजाइन किया गया थानैनोकणों और कोशिकाओं में तेज तस्करी के दृश्य के लिए अलग प्रतिदीप्ति साथ mponent. इस लेबलिंग प्रणाली के साथ, प्लास्मिड डीएनए, नैनोकणों और सेल नाभिक पहचाना जा सकता है. 6 घंटे 15 मिनट से अलग अलग समय बिंदुओं पर छवियों ले, लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी प्रतिदीप्ति इस्तेमाल किया गया था. विभिन्न योगों की छवियों की तुलना करके, पेप्टाइड संयुग्मित जिलेटिन नैनोकणों तेजी से और 30 मिनट के भीतर प्लाज्मिड रिलीज तेज दिखाया. इस परिणाम ने साबित कर दिया कि EGFR पेप्टाइड संयुग्मित नैनोकणों विशिष्ट पेप्टाइड EGFR और कोशिका की सतह रिसेप्टर्स पर EGFR, जो बहुत तेजी से किया गया था के बीच त्वरित बातचीत के साथ मदद की endocytosis लिया अन्य नैनोकणों, जो गैर विशिष्ट endocytosis लिया तुलना.

    सेल तस्करी अध्ययन

    चित्रा 4
    चित्रा 4 Confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी.डीएनए समझाया nanoparticle और Panc 1-कोशिकाओं में तेज तस्करी के alysis. (लाल = rhodamine-लेबल नैनोकणों, हरे = प्लास्मिड डीएनए PicoGreen लेबल, और नीले = नाभिक DAPI लेबल). लेजर शक्ति कम पैनल के पिछले चार आंकड़ों में 7 गुना कम था.

    5. बढ़ी हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ इन विट्रो अभिकर्मक में गुणात्मक और मात्रात्मक

    चित्रा 5 और 6 चित्र में प्रतिदीप्ति सूक्ष्म विश्लेषण में एलिसा Panc 1-असंशोधित, खूंटी संशोधित और EGFR पेप्टाइड संशोधित thiolated जिलेटिन नैनोकणों के प्रशासन पर कोशिकाओं में गुणात्मक और मात्रात्मक GFP tranfection दक्षता मापने के लिए इस्तेमाल किया गया. EGFR - लक्षित नैनोकणों द्वारा दिया प्लास्मिड 48 अन्य नियंत्रणों के सापेक्ष Lipofectin complexed डीएनए सहित घंटे के बाद GFP अभिव्यक्ति के उच्चतम स्तर में हुई.

    चित्रा 5
    चित्रा 5 GFP अभिव्यक्ति एक.एलिसा द्वारा nalyzed नियंत्रण और EGFR लक्षित नैनोकणों में प्लास्मिड डीएनए के बाद प्रशासन के समय के एक समारोह के रूप में साजिश रची है.

    Fluoresence GFP अभिकर्मक के लिए सूक्ष्म विश्लेषण

    चित्रा 6
    चित्रा 6 Panc एक epifluoresence माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं में 24, 48, 72, और EGFP-N1 के साथ 96 के बाद अभिकर्मक घंटे के बाद हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति की गुणात्मक विश्लेषण. Lipofectin डीएनए परिसर में एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था.

    जंगली प्रकार p53 के साथ इन विट्रो Tranfection में 6. Panc - एक कक्ष में प्लाज्मिड

    जंगली प्रकार p53 pORF hp53 एफई-1α / HTLV संकर प्रमोटर के साथ plasmids, ई. से निकाले गए थे कोलाई और apoptotic उपचारात्मक प्रभाव का अध्ययन नैनोकणों में समझाया . Panc-1 कोशिकाओं को 6 घंटे के लिए कणों और पोस्ट के लिए 24 अतिरिक्त - ट्रांसफ़ेक्ट, 48, 72, और 96 के साथ इलाज किया गया घंटे.

    चूंकि p53 कोशिकाओं में apoptosis प्रेरित और आदेश में इस कार्य को पूरा करने के लिए सकता है, तो कई बहाव प्रतिलेखन कारक शामिल हो सकता है और सीधे wt p53 की अभिव्यक्ति द्वारा विनियमित होगा. उनमें से, Bax, कस्पासे-3, कस्पासे-9, DR5, PUMA और Apaf-1 होगा विनियमित और p53 की अभिव्यक्ति के द्वारा बीसीएल-2, जबकि survivin नीचे विनियमित होगा. आदेश में इन प्रतिलेखन कारकों के स्तर की जांच करने के लिए, mRNA Panc-1 कोशिकाओं से 48 के बाद अभिकर्मक घंटे बाद निकाला गया था और RT-पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया. उत्पादों जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ मूल्यांकन किया गया और बैंड ImageJ के साथ विश्लेषण किया गया. परिणाम 7 चित्रा में दिखाया के आधार पर, survivin EGFR लक्षित thiolated जिलेटिन अन्य उपचार की तुलना में नैनोकणों के उपचार के साथ काफी कमी आई है, कोई स्पष्ट परिवर्तन बीसीएल-2 में देखा गया था, Bax और कस्पासे 3 की अभिव्यक्ति, कस्पासे-9, DR5, PUMA और लक्षित नैनोकणों उपचार के साथ Apaf 1increased.

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    7 चित्रा wt-p53 अभिव्यक्ति के बहाव के कारक का mRNA स्तर RT-पीसीआर द्वारा 48 पोस्ट अभिकर्मक घंटे के बाद की तुलना में थे .

    Wt-p53 अभिकर्मक के बाद, chromatin पारगम्यता / संघनन झिल्ली / मृत सेल apoptosis किट apoptotic कोशिकाओं, परिगलित कोशिकाओं और विभिन्न रंगों के साथ जीवित कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. iCys CompuCyte से अनुसंधान इमेजिंग cytometer (वेस्टवुड, एमए) के विश्लेषण और उपचार के बाद apoptosis स्तर की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में, गुना परिवर्तन apoptotic कोशिकाओं बाहर गणना की गई और 8 चित्रा में सूचीबद्ध है. EGFR लक्षित thiolated जिलेटिन nanopaticles बाद अभिकर्मक के बाद उच्चतम apoptotic सेल की आबादी से पता चला है. कस्पासे 3 / 7 गतिविधि का विश्लेषण यह भी पता चला है कि EGFR लक्षित नैनोकणों तेजी internalization और Panc 1-कोशिकाओं में apoptotic गतिविधि के उच्चतम स्तर था.

    8 चित्रा 8 चित्रा. Wt-p53 के नियंत्रण में समर्थक apoptotic गतिविधि के Cytometric विश्लेषण Panc-1 iCys का उपयोग कोशिकाओं ° इमेजिंग cytometer ट्रांसफ़ेक्ट

    Discussion

    नियंत्रण और EGFR लक्षित thiolated जिलेटिन नैनोकणों कुशल डीएनए encapsulation और स्थिरता के साथ तैयार थे. इन प्रणालियों के सभी के कण आकार व्यास में 150-250 एनएम के रेंज में थे. जीटा क्षमता साबित कर दिया है कि इस प्रणाली एक थोड़ा नकारात्मक प्रणाली है. SEM विश्लेषण के साथ, नैनोकणों के आकार Zetasizer परिणाम के साथ ही थे. ESCA विश्लेषण खूंटी और पेप्टाइड सतह संशोधन की पुष्टि कर सकते हैं.

    पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से पता चला कि Panc-1 कोशिकाओं एक उच्च EGFR अभिव्यक्ति के स्तर था और इन विट्रो अध्ययन में इस सेल लाइन के लिए इस्तेमाल किया गया था . दोनों नियंत्रण और सतह संशोधित नैनोकणों Panc-1 कोशिकाओं में अपेक्षाकृत कम साइटोटोक्सिक पी की तुलना में थे.

    सेल तस्करी पढ़ाई तेजी से तेज और Panc 1-कोशिकाओं में EGFR लक्षित नैनोकणों के प्लाज्मिड रिलीज दिखाया. रिपोर्टर प्लास्मिड डीएनए EGFR लक्षित नैनोकणों के साथ व्यक्त की डिलिवरी के उच्चतम स्तर के परिणामस्वरूपGFP Lipofectin - complexed डीएनए सहित अन्य नियंत्रण के सापेक्ष अभिव्यक्ति. इसी प्रणाली के साथ, प्लाज्मिड wt-p53 के साथ अभिकर्मक बहाव apoptotic मार्ग और Panc-1 कोशिकाओं में प्रेरित तेजी से apoptosis ट्रिगर.

    इन प्रारंभिक परिणाम बताते हैं कि EGFR - लक्षित thiolated जिलेटिन नैनोकणों अग्नाशय के कैंसर के लिए एक इलाज के रूप में जीन थेरेपी के लिए एक सुरक्षित और कारगर डीएनए वितरण प्रणाली के रूप में सेवा कर सकते हैं.

    Disclosures

    ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

    Acknowledgments

    इस अध्ययन और कैंसर Nanotechnology उत्कृष्टता के लिए कैंसर केंद्र (CCNE) अनुदान U54 CA151881 के लिए राष्ट्रीय कैंसर संस्थान के नैनो में एलायंस द्वारा समर्थित किया गया.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Type B gelatin, Bloom 225 Sigma-Aldrich G9391
    2-iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256
    pEGFP-N1 plasmid Elim Biopharm N/A
    pORF-hp53 E. coli Invitrogen porf-hp53
    Glyoxal solution (40wt. % in H2O) Sigma-Aldrich 128465
    Glycine Sigma-Aldrich 410225-250G
    QIA filter Plasmid Mega kit Qiagen 12281
    Beckman LE 80K Ultracentrifuge Beckman Coulter Inc. N/A
    FreeZone 6 Liter Console Freeze Dry Systems Labconco Corp. 7753020
    mPEG-SCM, MW 2,000 Da Laysan Bio Inc. mPEG-SCM-2K-1g
    MAL-PEG-SCM, MW 2,000 Da Jenkem Technology A5001-1
    Zetasizer Nano Malvern Instruments Zetasizer Nano ZS
    Hitachi 4800 field emission scanning electron microscope Hitachi S-4800 UHR FE-SEM
    Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits Invitrogen P7589
    Lipofectin Transfection Reagent Invitrogen 18292011
    DMEM Mediatech, Inc. 10 013 CM
    RPMI Mediatech, Inc. 50 020 PB
    Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23225
    iBlot Dry Blotting System Invitrogen IB1001
    XCellSureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark Invitrogen EI0002
    Pierce ECL Western Blotting Substrate Thermo Fisher Scientific, Inc. 32109
    Kodak Digital X-ray Specimen (DXS) System Kodak N/A
    CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega Corp. G3580
    BioTek SynergyHT plate reader BioTek N/A
    Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific, Inc. N/A
    One-step RT-PCR kit Qiagen 210212
    Chromatin Condensation/Membrane Permeability/Dead Cell Apoptosis Kit Invitrogen V23201
    Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay kit Promega Corp. G7790
    Hybaid PCR Sprint Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific, Inc. N/A
    EGF Receptor Antibody Cell Signaling Technology 2232
    β-Actin Antibody Cell Signaling Technology 4967
    Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074
    Mouse Monoclonal GFP Antibody Novus Biologicals NB600-597
    Goat Polyclonal GFP antibody (Alkaline Phosphatase) Novus Biologicals NB600-1502
    Phosphatase Substrate Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 37620

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    References

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    जीन और मानव अग्नाशय के कैंसर epidermal वृद्धि कारक का उपयोग कक्ष में डिलिवरी अभिकर्मक जिलेटिन आधारित इंजीनियर Nanovectors रिसेप्टर - लक्षित
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    Xu, J., Amiji, M. Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles. J. Vis. Exp. (59), e3612, doi:10.3791/3612 (2012).More

    Xu, J., Amiji, M. Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles. J. Vis. Exp. (59), e3612, doi:10.3791/3612 (2012).

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