Summary
Type B gelatin-basert konstruert nanovectors system (Gens) ble utviklet for systemisk genet levering og transfeksjon i behandling av bukspyttkjertelkreft. Ved modifisering med epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) spesifikke peptid på overflaten av nanparticles, kunne de target på EGFR reseptor og slipp plasmid henhold redusere miljø, slik som høye intracellulære glutation konsentrasjoner.
Abstract
Mer enn 32.000 pasienter er diagnostisert med kreft i bukspyttkjertelen i USA per år og sykdommen er forbundet med svært høy dødelighet 1. Påtrengende behov eksisterer for å utvikle nye klinisk-oversettbare terapeutiske strategier som kan forbedre den dystre overlevelse statistikk for kreft i bukspyttkjertelen pasienter. Selv om genterapi i kreft har vist en enorm løfte, er den viktigste utfordringen i utviklingen av trygg og effektiv levering system, som kan føre til vedvarende transgenet uttrykk.
Gelatin er et av de mest allsidige naturlige biopolymer, mye brukt i næringsmidler og farmasøytiske produkter. Tidligere studier fra vårt laboratorium har vist at type B gelatin kan fysisk innkapsle DNA, som bevarte supercoil strukturen av plasmid og forbedret transfeksjon effektivitet ved intracellulære levering. Ved thiolation av gelatin, kunne sulfhydryl gruppene bli introdusert inn i polymer og ville fOrm disulfide obligasjon innenfor nanopartikler, som stabiliserer hele komplekset og når disulfide bindingen er brutt på grunn av tilstedeværelsen av glutation i cytosol, ville nyttelast bli utgitt 2-5. Poly (etylenglykol) (PEG)-modifisert Gens, når det gis i den systemiske sirkulasjonen, gir lang sirkulasjon ganger og fortrinnsvis mål til svulsten masse på grunn av hyper-permeabilitet av neovasculature av den forbedrede permeabilitet og oppbevaring effekt seks. Studier har vist over-uttrykk for epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) på Panc-1 humane bukspyttkjertelen adenocarcinoma celler 7. For å aktivt å målrette kreft i bukspyttkjertelen cellelinje, var EGFR spesifikke peptid konjugert på partikkel overflaten gjennom en PEG spacer. 8
De fleste anti-tumor genterapi er fokusert på administrasjon av tumorsuppressorgener som villtype p53 (WT-p53), for å gjenopprette den pro-apoptotiske funksjonen i cellene 9 10. I kreft i bukspyttkjertelen, de fleste celler har mutasjoner i p53 protein, forårsaker tap av apoptotiske aktiviteten. Med introduksjonen av WT-p53, kan apoptose repareres og videre utløser celledød i kreftceller 11.
Basert på ovennevnte begrunnelse, har vi designet EGFR rettet peptid-modifisert thiolated gelatin nanopartikler for WT-p53 genet levering og evaluert levering effektivitet og transfeksjon i Panc-1 celler.
Protocol
1. Utarbeidelse av Plasmid DNA Encapsulated EGFR-Målrettet Gelatin Nanopartikler
- Syntese av thiolated gelatin
- Thiolated gelatin ble syntetisert som forrige metoden 2-5, ved kovalente konjugering med 2-iminothiolane på primære amino grupper av type B gelatin. 1 gram gelatin ble oppløst i 100 ml avionisert vann og inkubert med 20 mg 2-iminothiolane hydroklorid i romtemperatur i 15 timer.
- Ureagerte reagens ble fjernet ved dialyse mot 5 mM HCl løsning, etterfulgt av en mM HCl løsning for 3 timer hver. Renset thiolated gelatin var fryse tørket og lagret ved 4 ° C for videre bruk.
- Utarbeidelse av DNA som inneholder nanopartikler
- 200 mg thiolated gelatin ble oppløst i vann og pH av løsningen ble justert til 7 med tillegg av 0,2 M NaOH løsning. 1mg DNA ble innført og forsiktig blandes med gelatin løsning.
- Kjølt etanol ble lagt sakte inn i blandingen mensrøring løsning i høy hastighet. Nanopartikler ble dannet da løsemiddel sammensetningen endret til 75% hydro-alkoholholdige løsning.
- Nanopartikler ble ytterligere krysskoblet ved langsom tilsetning av 0,1 ml 8% (v / v) glyoxal løsning. Ureagerte reagenser ble slukket med 0,5 ml 0,2 M glysin løsning.
- Nanopartikler var ultra-sentrifugeres ved 16000 rpm i 30 minutter. Pellets ble vasket med avionisert vann to ganger og renset nanopartikler ble frysetørket og oppbevart ved 4 ° C.
- Overflate modifikasjon av nanopartikler
- Nanopartikler ble suspendert i 0,1 M fosfat buffer (pH 7,4) med konsentrasjon på 10 mg / ml og inkubert med 2 ganger vekten av metoksy-PEG-succinimidyl carboxy methyl ester (MPEG-SCM, MW 2000 Da) eller maleimide-PEG-succinimidyl carboxy methylester (MAL-PEG-SCM, 2.000 MW Da) i 2 timer i romtemperatur med sakte omrøring.
- Pegylert nanopartikler ble samlet inn med ultra-sentrifugeres ved 16000 rpm i 30 minutts. Pellets ble vasket med avionisert vann to ganger og renset nanopartikler ble frysetørket og oppbevart ved 4 ° C.
- MAL-PEG-SCM modifiserte nanopartikler ble suspendert i 0.1m fosfat buffer (pH 6,5) med konsentrasjon av 10mg/ml og inkubert med 10% vekt av EGFR spesifikke peptid (YHWYGYTPQNVI-GGGGC) for 6 timer ved romtemperatur med sakte omrøring.
- Peptid endret nanopartikler ble samlet inn med ultra-sentrifugeres ved 16000 rpm i 30 minutter. Pellets ble vasket med avionisert vann to ganger og renset nanopartikler ble frysetørket og oppbevart ved 4 ° C.
2. Karakterisering av EGFR-Målrettet Nanopartikler
- Partikkelstørrelse og Zeta potensielle måling
Nanopartikler ble suspendert i vann med konsentrasjon av 1mg/ml. Suspension ble analysert ved hjelp Zetasizer Nano (Malvern Inc). Partikkelstørrelse analyse ble utført ved en spredning vinkel på 90 grader ved 25 °C. Zeta potensial ble målt ved standard parametere dielektrisk konstant, brytningsindeks og viskositet vann ved 25 ° C. - Scanning Elektronmikroskopi
Lyofilisert nanopartikler ble montert på aluminium prøve montere og frese-belagt med palladium for å forbedre ledningsevne og minimere oppbygging av avgifter. Prøvene ble observert for overflate morfologi under en Hitachi 4800 felt utslipp scanning elektronmikroskop ved 3 kV. - Electron spectroscope for kjemisk analyse (ESCA)
Frysetørket formulering av kontroll, var pegylert og peptid modifiserte nanopartikler analysert av Esca. Det ble utført ved National ESCA og Surface Analysis Center for Biomedical Problemer (NESAC / BIO), University of Washington (Seattle, WA).- Prøvene ble plassert i ultrahøy vakuum og utsatt for lavenergi-x-ray beam, som forårsaket et utslipp av sekundær photoelectrons fra overflaten.
- Ved å plotte antall oppdaget elektroner som en funksjon av binDing energi, observerte spekteret topper ble tildelt hver kjemiske komponenter.
- Høyoppløselige analyse av C1S spektra ble utført for å bestemme eksakt kjemisk sammensetning fra hydrokarbon (CC eller CH på 285mV), eter (CO) på 286.4mV), og carbonyl (C = O på 288,1 mV) og relative sammensetningen av hver funksjonalitet ble bestemt av arealet under kurven.
- Stabilitet av innkapslet plasmid
Stabiliteten av den innkapslede plasmid DNA ble bekreftet ved å kjøre ut DNA på pre-cast gels. Nanopartikler var fordøyd med 0,2 mg / ml protease som inneholder PBS (30 min ved 37 ° C) og 0,2 U / ml DNAse (10min ved romtemperatur) separat, samtidig eller sekvensielt. Prøvene ble deretter lastet inn på 1.2% agarose gel (GP) (E-Gel, Invitrogen, CA) til en konsentrasjon av 100ng/well i en 18μL volum per brønn. Naked plasmidet ble lastet som kontroll og gel ble kjørt ved 75 V i 30 minutter. Kodak Digital X-ray Prøvetaking (DxS) System ble brukt til å visualisere bands med UV transluminescence. - Fastsettelse av plasmid lasting
Plasmid innkapslet nanopartikler ble suspendert på 1mg/ml og fordøyd med 0.2mg/ml protease ved 37 ° C i 30 minutter. Løsningen ble sentrifugeres ved 13000 rpm i 10 minutter og supernatanten ble samlet inn og testet for plasmid konsentrasjon med Picogreen analysen (Invitrogen). Innkapsling ratio ble beregnet ved å dele den innkapslede plasmid konsentrasjon med den innledende lasting 0,5% (w / w).
3. In Vitro Transfeksjon Studier i Panc-1 kreft i bukspyttkjertelen celler
- Cellekultur forhold
Panc-1 og Capan-1 bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinjer ble SKOV3 eggstokkene adenokarsinom celle linje og NIH-3T3 murine fibroblast cellelinje hentet fra ATCC. Panc-1 og NIH-3T3 ble dyrket med DMEM leveres med L-glutamin, Pen-strep og 10% føtal bovint serum ved 37 ° C og 5% CO 2, mens Capan-1 som kreves DMEM leverte 20% fetal bovint serum.SKOV3 ble dyrket i RPMI-1640 leveres med 10% fosterets bovint serum. - Western blot analyse for EGFR uttrykk
- Cell lysates ble samlet inn fra 2 millioner celler og analysert for total protein konsentrasjon bruker BCA assay (Pierce). NIH-3T3 ble brukt som negativ kontroll og SKOV3 ble brukt som positiv kontroll for EGFR uttrykk.
- 10 mikrogram av totalt protein ekstrakt ble kjørt på pre-cast natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) systemet på 135V for 90 minutter.
- Deretter ble gel overføres til PVDF membran av iBlot Dry blotting System (Invitrogen).
- Membran ble blokkert med 5% fettfri melk i Tween inneholder Tris buffer saltvann (TBS-t) i 1 time ved romtemperatur.
- Membran ble kuttet og inkubert med 1:1,000 fortynning av primær kanin beta-aktin antistoffer og 1:1,000 fortynning av primær kanin EGFR antistoffer separat over natten ved 4 ° C.
- Membran ble deretter vasket to ganger medTBS-t og inkubert med 1:2,000 fortynninger av sekundære anti-kanin hest-reddik peroksidase-konjugert IgG i TBS-t i 1 time ved romtemperatur.
- Etter skylling overflødig antistoffer med TBS-t og vann, var 4 ml ECL substrat (Pierce, Rockford, IL, USA) lagt til og inkubert med membraner i 5 minutter.
- Kjemiluminescens band ble deretter visualiseres ved hjelp av Kodak Digital X-ray Prøvetaking (DxS) System.
- Celleviabilitet studier med ulike formuleringer
- Panc-1 cellene ble dyrket i 96-bra plater på 10 000 celler per brønn i 200μL av supplert DMEM natten.
- Vekst medium ble erstattet med serum free media inneholder ulike konsentrasjoner av nanopartikler med 0, 0,5, 1, 2, 4, 6 mg / ml. 1mg/ml PEI, en kjent cytotoksisk kationisk polymer, ble brukt som positiv kontroll.
- Celler ble behandlet med 200μL nanopartikler i 6 timer og deretter erstattet med 20μL MTS reagens og 100μL komplettkultur media.
- Etter innlegget inkubering i 3 timer ved 37 ° C i 5% CO 2, ble absorbansen formazanforbindelsen produkt målt ved 490nm med BioTek SynergyHT plateavleseren (Winooski, VT).
- Det prosent levedyktighet av celler ble uttrykt som forholdet mellom absorbans av polymer behandlet celler i forhold til negativ kontroll (0mg/ml) multiplisert med 100 og plottet som funksjon av polymer konsentrasjoner.
- Cell menneskehandel studier
- Rhodamine B isothiocyanat (RBITC) ble brukt til å conjugate på thiolated gelatin ved reaksjon med amin gruppen. Etter dialyse og lyophilization, merket RBITC thiolated gelatin ble brukt for nanopartikler forberedelse.
- Før desolvation var 25μL PicoGreen blandet med 1mg plasmid for 1 minutt og merket plasmider ble lagt til gelatin løsning. Ulike formuleringer ble gjort etter den forrige metoden.
- Panc-1 cellene ble dyrket i 6-brønn plater som inneholder glass cover-slips med 200.000 celler per bra. Etter natten vekst, ble 2 ml av merket nanopartikler behandlet i hver brønn med konsentrasjon av 1mg/ml i serum fritt medium.
- Etter forskjellige tidspunkter, fra 15 minutter til 6 timer, var medium erstattet med kultur medium som inneholder 1μg/ml av Høst 33342 (Invitrogen) i 15 minutter inkubasjon ved romtemperatur. 2 ml på 4% Paraformaldehyde Løsningen ble byttet ut i hver brønn for å fikse celler. Celler ble deretter vasket med PBS to ganger.
- Coversilps ble montert på glass lysbilder. Laserskanning confocal fluorescens mikroskopi ble brukt til å ta bilder av faste celler.
- Kvalitativ måling av transfeksjon effektiviteten ved fluorescens mikroskopi med pEGFP-N1 innkapslet nanopartikler
- pEGFP-N1 plasmider var innkapslet i nanopartikler og suspendert i serum frie medier med konsentrasjon tilsvarer 10μg plasmider per ml for videre behandling.
- Panc-1 cellene ble dyrket over natten i 6-brønn plater containing glass cover-slips med 200.000 celler per brønn. 2 ml av pEGFP-N1 plasmider innkapslet nanopartikler ble behandlet i hver brønn. 20μg av plasmider ble blandet med 20μl Lipofectin, kationiske lipid transfeksjon reagens, og det ble brukt som positiv kontroll, mens ubehandlet celler ble brukt som negativ kontroll.
- Celler ble inkubert med ulike formuleringer i 6 timer.
- Medium ble erstattet med kultur medium og celler ble post-transfektert for 24, 48, 72 og 96 timer.
- Etter post-transfeksjon, var medium erstattet med kultur medium som inneholder 1μg/ml av Høst 33342 (Invitrogen) og inkubert med celler i 15 minutter ved romtemperatur.
- Dekkglass ble montert på glassplater og uttrykk av GFP i cellene ble observert av fluorescens mikroskop. Differential interferens kontrast (DIC) og fluorescens bilder ervervet bruker Olympus BX61 mikroskop og digitale bilder som ble behandlet med Image J programvare.
- pEGFP-N1 plasmider var innkapslet i nanopartikler og suspendert i serum frie medier med konsentrasjon tilsvarer 10μg plasmider per ml for videre behandling.
- Panc-1 cellene ble dyrket over natten i 6-brønn plater med 200.000 celler per brønn. 2 ml av pEGFP-N1 plasmider innkapslet nanopartikler ble behandlet i hver brønn. 20μg av plasmider ble blandet med 20μl Lipofectin, kationiske lipid transfeksjon reagens, som ble brukt som positiv kontroll og ubehandlet celler ble brukt som negativ kontroll.
- Celler ble inkubert med ulike formuleringer i 6 timer.
- Medium ble erstattet med kultur medium og celler ble post-inkubert i 24, 48, 72 og 96 timer.
- Etter post-transfeksjon ble celle lysates samlet inn fra hver brønn og analysert for total protein konsentrasjon bruker BCA assay (Pierce).
- bra plate var coated med 100μl av 1:1000 fortynninger av monoklonale anti-GFP antistoffer i hver brønn. Etter 2 timer inkubering ble plate vasket med PBS-0,5% (w / v) Tween-80 for 4 ganger.
- 300μl TBS blokkering buffere ble lagt inn i hver brønn og ruges i 2 timer. Da platen ble deretter vasket med PBS-0,5% (w / v) Tween-80 for 4 ganger.
- 30μg av proteiner i hver gruppe ble lagt inn på plate og inkubert over natten ved 4 °. Da platen ble deretter vasket med PBS-0,5% (w / v) Tween-80 for 4 ganger.
- 100μl av 1:2400 fortynninger av sekundære anti-GFP antistoffer i forhold til alkalisk fosfatase ble lagt til hver brønn og inkuberes 1 time. Da platen ble deretter vasket med PBS-0,5% (w / v) Tween-80 for 4 ganger.
- 100μl alkalisk fosfatase underlag ble lagt til hver brønn og ruges i 30 minutter til 1 time. Plate ble målt med BioTek Synergy HT plateavleseren for absorbans ved 405nm.
- Uttrykt GFP konsentrasjonen var rapportert som nanogram per milligrams av totalt protein.
- WT-p53 plasmider var innkapslet i nanopartikler og suspendert i serum frie medier med konsentrasjon tilsvarer 10μg plasmid per ml for videre behandling.
- Panc-1 cellene ble dyrket over natten i 6-brønn plater med 200.000 celler per brønn. 2 ml av WT-p53 plasmider innkapslet nanopartikler ble behandlet i hver brønn. 20μg av plasmider ble blandet med 20μl Lipofectin, kationiske lipid transfeksjon reagens, som ble brukt som positiv kontroll og ubehandlet celler ble brukt som negativ kontroll.
- Celler ble inkubert med ulike formuleringer i 6 timer.
- Medium ble erstattet med kultur medium og celler ble post-inkubert i 48 timer.
- mRNA ble ekstrahert fra hver brønn ved hjelp av høy Pure RNA isolering kit (Roche, Indianapolis, IN) og målt med Nanodrop 2000 (THermo Scientific, Wilminton, DE).
- RT-PCR ble gjort ved hjelp av Qiagen One-step RT-PCR kit (Qiagen, Valencia, CA). Primere for p53, Bax, BCL-2, Beta-aktin, DR5, Apaf-1, PUMA, ble Survivin syntetisert av Eurofins MWG Operon (Huntsville, AL).
- PCR produktene ble evaluert med gel elektroforese og pikslene for cDNA band ble analysert med ImageJ programvare.
- WT-p53 plasmid ble innkapslet i nanopartikler og suspendert i serum frie medier med konsentrasjon tilsvarer 10μg plasmider per ml for videre behandling.
- Panc-1 cellene ble dyrket over natten i 6-brønn plater med 200.000 celler per brønn. 2 ml av WT-p53 plasmider innkapslet nanopartikler ble behandlet i hver brønn. 20μg av plasmider ble blandet med 20μl Lipofectin, kationiske lipid transfeksjon reagens, som ble brukt som positiv kontroll og ubehandlet celler varbrukt som negativ kontroll.
- Celler ble inkubert med ulike formuleringer i 6 timer.
- Medium ble erstattet med kultur medium og celler ble post-inkubert i 24, 48, 72 og 96 timer.
- Kromatin Kondens / Membran Permeabilitet / døde celler Apoptose Kit (Invitrogen, Carlsbad, California) ble brukt til å merke apoptotiske celler, nekrotiske celler og levende celler med ulike fargestoffer.
- iCys Forskning Imaging cytometeret fra CompuCyte (Westwood, MA) ble brukt til å analysere og sammenligne apoptose nivåer etter behandling. Basert på fluorescens mikroskopiske bilder ble intensitet av alle farger registreres og plottes versus teller og prosenter for ulike populasjoner ble beregnet.
- Sammenlignet med den negative kontrollen, noe som betyr at det ikke var noen behandling for cellene, var apoptotiske celler fold endringer beregnes ut og oppført i grafen.
- 3.8.8 Apo-ONE Homogen caspase-3 / 7 Assay kit (Promega, Madison, WI) ble brukt til å undersøke pro-apoptotisk aktivitet etter transfeksjon av WT-p53 plasmid. 1mg/ml PEI ble brukt som en negativ kontroll for å eliminere alle apoptotiske aktiviteten. Etter post-transfeksjon ble cellene behandlet med rhodamine 110, bis-(N-CBZL-aspartyl-L-glutamyltransferase-L-valyl-L-asparaginsyre amid; Z-devd-R110), som er et substrat av caspase 3 / 7, for opptil 18 timer.
- Plate ble målt med BioTek Synergy HT plateavleseren for fluorescens ved 490/520 nm. Basert på intensiteten av grønn fluorescens, kunne pro-apoptotiske aktiviteten bli vurdert.
Fire. Representant Resultater
1. Syntese og Chatacterization av EGFR Målrettet Nanopartikler
EGFR targeting peptid-modifiserte nanopartikler ble syntetisert som ordningen viste i figur 1. Nanopartikler utarbeidet av desolvation var preget for partikkelstørrelse og Zeta potensial. Gjennomsnittlig størrelse og overflate ansvaret for partikler forberedt fra thiolated gelatinsmed ulike grader av thiolation er listet i tabell 1. Middelverdien partikkel diameter ulike nanopartikler var mellom 150-250 nm. Thiolated nanopartikler har mindre størrelse i forhold til gelatin nanopartikler, kan skyldes disulfide brua dannelsen inne partikler. Med ulike underlag modifikasjoner, har størrelser av nanopartikler økt. Den Zeta potensialer av forskjellige formuleringer var rundt -20 mV. Med SEM analysen ble størrelsene, overflate morfologi og sfærisk form av nanopartikler observert og tilsvarende Zetasizer resultat. DNA lasting effektivitet i gelatin nanopartikler og thiolated gelatin nanopartikler var høyere enn 95% (Tabell 1).
Figur 1. Chemical Reaction Scheme, illustrerer overflate modifikasjon av thiolated gelatin nanopartikler med epidermal vekst factor reseptor (EGFR) binding peptid gjennom en poly (etylenglykol) (PEG) spacer.
Karakterisering av nanopartikler
| Formulering | Nanopartikkel Diameter (nm) | Zeta Potential (mV) | Plasmid DNA Loading Efficiency (%) |
| Gel NP | 151,4 ± 23,5 | -17,1 ± 5.23 | 95,6 ± 2,2 |
| SH-Gel NP | 132,6 ± 17,9 | -24,6 ± 5.16 | 97,0 ± 3,8 |
| SH-Gel-PEG | 179,0 ± 30,9 | -22,3 ± 9.50 | 95,8 ± 6,5 |
| SH-Gel PEG Peptid | 230,8 ± 41,5 | -18,1 ± 4.02 | 94,8 ± 5,1 |
TaBle en. Partikkelstørrelse, overflate lade, og plasmid DNA innkapsling effektivitet av kontroll og EGFR målrettede gelatin og thiolated gelatin nanopartikler.
Høy oppløsning C 1S skanninger av elektron-spektroskopi for kjemisk analyse (ESCA) ble brukt til å analysere overflate komponent av thiolated gelatin (SH-Gel NP), PEG-modifisert thiolated gelatin (SH-Gel PEG) og EGFR rettet peptid-modifisert thiolated gelatin nanopartikler (SH-Gel PEG Peptid). Resultatene i tabell 2 viste peak intensiteter av CH (hydrokarbon), CO (eter), og C = O (carbonyl) grupper på 285,0, 286,3 og 288,1 eV, henholdsvis. Den eter CO signalet har økt etter PEG modifikasjon og sank etter peptid konjugering. Mens nitrogen sammensetning har sunket etter PEG modifikasjon og økte etter peptid modifikasjon, som bekreftet tilstedeværelsen av EGFR-targeting peptid på nanopartikler. ESCA analyse har ytterligere bekreftet PEG og peptid overflate modifikasjon.
Electron Spectroscopy for kjemisk analyse av nanopartikler Surface sammensetning
| Formulering | C 1s (%) | O 1s (%) | N 1s (%) |
| SH-Gel NP | 59,3 ± 0,8 | 22,9 ± 0,5 | 12,9 ± 0,1 |
| SH-Gel-PEG | 58,2 ± 0,6 | 28,0 ± 1,2 | 9.5 ± 0.7 |
| SH-Gel PEG Peptid | 56,7 ± 0,8 | 25,9 ± 0,7 | 12,3 ± 0,6 |
| Formulering | CC (%) | CO, N (%) | C = O (% ) |
| SH-Gel NP | 51,5 | 26,6 | 21,9 |
| SH-Gel-PEG | 17,1 | 63,1 | 19,8 |
| SH-Gel PEG Peptid | 33,1 | 42,8 | 24,1 |
Tabell 2. C 1S høyoppløselige skanninger av elektron-spektroskopi for kjemisk analyse (ESCA)
For å undersøke stabiliteten av innkapslede plasmid ble nanopartikler behandlet med proteasehemmere eller DNAse separat, simuntaneously eller sekvensielt. Etter elektroforese, har resultatene i Figur 2 vist at plasmid DNA innkapslet i alle nanopartikler er beskyttet av nanopartikler og stabil, kan sammenlignes med nakent plasmid DNA. Disse studert har vist at alle disse nanopartiklene kan kapsle og bevare plasmidet struktur etter innkapsling.
/ Files/ftp_upload/3612/3612fig2.jpg "/>
Figur 2. Stabilitet av plasmid DNA innkapslet i thiolated gelatin, thiolated PEG-modifisert gelatin, og EGFR peptid-modifisert thiolated gelatin nanopartikler av agarose gel elektroforese. Nanopartikler ble behandlet med 0,2 mg / ml av protease å bevise plasmid DNA innkapsling i nanopartikkel matrise
2. Baseline EGFR Expression i kreft i bukspyttkjertelen celler
To mennesker bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinjer (Panc-1 og Capan-1) ble analysert ved western blot for EGFR uttrykk. Menneskelig eggstokkene adenokarsinom (SKOV3) og murine fibroblast ((NIH-3T3) celler ble valgt som positive og negative kontroller, henholdsvis. Beta-aktin ble analysert som protein lasting kontroll. Panc-1 celler har vist høyere EGFR uttrykk i forhold til Capan-1 og denne cellen linjen ble så brukt til følgende in vitro-studier
3. Cytotoksisitet of Control og SurfaCE-Modified Thiolated Gelatin Nanopartikler
For å vurdere cellulære samspillet av nanopartikler ble cytotoksisitet analyser utført etter behandling med nanopartikler. Basert på resultatene i figur 3, både kontroll og overflate-modifiserte nanopartikler var relativt trygge og biokompatible i Panc-1 cellene selv ved høye konsentrasjoner, med sammenligning til PEI. Følgende studier ble utført med 1mg/ml nanopartikler.
Figur 3. Prosent celleviabilitet som en funksjon av nanopartikler formulering konsentrasjoner i Panc-1 celler som vurderes av tetrazolium fargestoff (MTS) assay
Fire. Reseptormediert Cell Opptak i Panc-1 celler
For å bekrefte overflate tilgjengelighet av EGFR målretting peptid og reseptor-mediert endocytotic opptak av nanopartikler, var et system designet av merking hver component med ulik fluorescens for visualisering av nanopartikler opptak og trafficking i celler. Med dette merking system, kunne plasmid DNA, nanopartikler og cellekjernen bli identifisert. Laserskanning confocal fluorescens mikroskopi ble brukt til å ta bilder på forskjellige tidspunkter, fra 15 minutter til 6 timer. Ved å sammenligne bilder av ulike formuleringer, viste peptid konjugert gelatin nanopartikler den raske opptak og plasmid utgivelse innen 30 minutter. Dette resultatet videre bevist at EGFR peptid-konjugerte nanopartikler gjennomgikk tilrettelagt endocytose med rask samhandling mellom EGFR spesifikke peptid og EGFR reseptorer på celleoverflaten, som var mye raskere, sammenlignet med andre nanopartikler, som gjennomgikk uspesifikk endocytose.
Cell Trafficking Study
Figur 4. Confocal fluorescens mikroskopi enalysis av DNA-innkapslet nanopartikkel opptak og trafficking i Panc-1 celler. (Rød = rhodamine-merket nanopartikler, grønn = PicoGreen-merket plasmid DNA, og blå = DAPI-merket kjernen). Laseren makt var 7 ganger mindre i de fire siste tallene i nedre panel.
5. Kvalitative og kvantitative In Vitro Transfeksjon med Enhanced grønt fluorescerende protein
ELISA i figur 5 og fluorescens mikroskopisk analyse i Figur 6 ble brukt til å måle kvalitative og kvantitative GFP tranfection effektivitet i Panc-1 celler ved administrering av umodifisert, PEG-modifisert og EGFR peptid-modifisert thiolated gelatin nanopartikler. Plasmider levert av EGFR målrettede nanopartikler resulterte i det høyeste nivå av GFP uttrykk etter 48 timer i forhold til andre kontroller, inkludert Lipofectin-kompleksbundet DNA.
Figur 5. GFP uttrykk ennalyzed av ELISA plottet som en funksjon av tid etter administrasjon av plasmid DNA i kontroll og EGFR målrettet nanopartikler.
Fluoresence mikroskopisk analyse for GFP transfeksjon
Figur 6. Kvalitativ analyse av grønt fluorescerende protein uttrykk i Panc-1 celler ved epifluoresence mikroskopi etter 24, 48, 72 og 96 timer etter transfeksjon med EGFP-N1. Lipofectin-DNA kompleks ble brukt som positiv kontroll.
Seks. In Vitro Tranfection med villtype p53 Plasmid i Panc-1 celler
Villtype p53 plasmider pORF-hp53, med EF-1α / HTLV hybrid promoter ble ekstrahert fra E. coli og innkapslet inn nanopartikler å studere apoptotiske terapeutisk effekt. Panc-1 celler ble behandlet med partikler i 6 timer og post-transfektert for ytterligere 24, 48, 72, og 96 timer.
Siden p53 kan indusere apoptose i celler og for å oppnå denne funksjonen, vil mange nedstrøms transkripsjonsfaktorer være involvert og direkte regulert av uttrykk av WT-p53. Blant dem, ville Bax, caspase-3, caspase-9, DR5, PUMA og Apaf-1 være opp-regulert av uttrykk av p53 og mens BCL-2, ville survivin bli nedregulert. For å undersøke nivåene av disse transkripsjonsfaktorer, ble mRNA hentet fra Panc-1 celler etter 48 timer etter transfeksjon og brukes for RT-PCR. Produktene ble evaluert med gel elektroforese og band ble analysert med ImageJ. Basert på resultatene viste i Figur 7, survivin redusert betydelig med behandling av EGFR målrettede thiolated gelatin nanopartikler sammenlignet med andre behandlinger, var ingen åpenbare endringen sett i BCL-2, Bax og uttrykk av caspase-3, caspase-9, DR5, PUMA og Apaf-1increased med målrettede nanopartikler behandling.
les/ftp_upload/3612/3612fig7.jpg "/>
Figur 7.. MRNA nivåene av nedstrøms faktorer av WT-p53 uttrykk ble sammenlignet med RT-PCR etter 48 timer etter transfeksjon.
Etter WT-p53 transfeksjon ble Chromatin Kondens / Membran Permeabilitet / døde celler Apoptose kit brukes for å skille apoptotiske celler, nekrotiske celler og levende celler med ulike fargestoffer. iCys Forskning Imaging cytometeret fra CompuCyte (Westwood, MA) ble brukt til å analysere og sammenligne apoptose nivåer etter behandling. Sammenlignet med den negative kontrollen, var apoptotiske celler fold endringer beregnes ut og oppført i Figur 8. EGFR målrettet thiolated gelatin nanopaticles har vist høyeste apoptotiske cellen befolkningen etter post-transfeksjon. Analyse av caspase 3 / 7 aktivitet viste også at EGFR målrettede nanopartikler hadde raske internalisering og høyeste nivået av apoptotiske aktiviteten i Panc-1 celler.
Figur 8. Cytometric analyse av pro-apoptotiske aktiviteten i kontroll WT-p53 transfektert Panc-1 celler ved hjelp iCys ° Imaging cytometeret
Discussion
Kontroll og EGFR målrettet thiolated gelatin nanopartikler var forberedt med effektive DNA innkapsling og stabilitet. Den partikkelstørrelser av alle disse systemene var i området 150-250 nm i diameter. Zeta potensial har vist at dette systemet er en litt negativ system. Med SEM analysen ble størrelsene av nanopartikler det samme med Zetasizer resultat. ESCA analyse kunne bekrefte PEG og peptid overflate modifikasjon.
Western blot analyse viste at Panc-1 celler hadde en høy EGFR uttrykk nivåer og denne cellen linjen ble brukt til in vitro studier. Både kontroll og overflate-modifiserte nanopartikler var relativt mindre cytotoksiske i Panc-1 celler i forhold til PEI.
Cell trafficking studier viste raske opptak og plasmid utgivelsen av EGFR målrettede nanopartikler i Panc-1 celler. Levering av reporter plasmider DNA uttrykker med EGFR målrettede nanopartikler resulterte i høyeste nivåene avGFP uttrykk i forhold til andre kontroller, inkludert Lipofectin-kompleksbundet DNA. Med det samme systemet, utløste transfeksjon med WT-p53 plasmid nedstrøms apoptotiske sti og indusert hurtig apoptose i Panc-1 celler.
Disse foreløpige resultatene tyder på at EGFR målrettede thiolated gelatin nanopartikler kan tjene som en trygg og effektiv DNA levering system for genterapi som behandling for kreft i bukspyttkjertelen.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av National Cancer Institute er Alliance i Nanoteknologi for Cancer Center for Cancer Nanoteknologi Excellence (CCNE) gi U54-CA151881.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type B gelatin, Bloom 225 | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| 2-iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Elim Biopharm | N/A | |
| pORF-hp53 E. coli | Invitrogen | porf-hp53 | |
| Glyoxal solution (40wt. % in H2O) | Sigma-Aldrich | 128465 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225-250G | |
| QIA filter Plasmid Mega kit | Qiagen | 12281 | |
| Beckman LE 80K Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | N/A | |
| FreeZone 6 Liter Console Freeze Dry Systems | Labconco Corp. | 7753020 | |
| mPEG-SCM, MW 2,000 Da | Laysan Bio Inc. | mPEG-SCM-2K-1g | |
| MAL-PEG-SCM, MW 2,000 Da | Jenkem Technology | A5001-1 | |
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments | Zetasizer Nano ZS | |
| Hitachi 4800 field emission scanning electron microscope | Hitachi | S-4800 UHR FE-SEM | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits | Invitrogen | P7589 | |
| Lipofectin Transfection Reagent | Invitrogen | 18292011 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10 013 CM | |
| RPMI | Mediatech, Inc. | 50 020 PB | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 | |
| iBlot Dry Blotting System | Invitrogen | IB1001 | |
| XCellSureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark | Invitrogen | EI0002 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 32109 | |
| Kodak Digital X-ray Specimen (DXS) System | Kodak | N/A | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega Corp. | G3580 | |
| BioTek SynergyHT plate reader | BioTek | N/A | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | N/A | |
| One-step RT-PCR kit | Qiagen | 210212 | |
| Chromatin Condensation/Membrane Permeability/Dead Cell Apoptosis Kit | Invitrogen | V23201 | |
| Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay kit | Promega Corp. | G7790 | |
| Hybaid PCR Sprint Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, Inc. | N/A | |
| EGF Receptor Antibody | Cell Signaling Technology | 2232 | |
| β-Actin Antibody | Cell Signaling Technology | 4967 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| Mouse Monoclonal GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-597 | |
| Goat Polyclonal GFP antibody (Alkaline Phosphatase) | Novus Biologicals | NB600-1502 | |
| Phosphatase Substrate Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 37620 |
References
- Vimalachandran, D. Genetics and prevention of pancreatic cancer. Cancer. Control. 11, 6-14 (2004).
- Kommareddy, S., Amiji, M. Preparation and evaluation of thiol-modified gelatin nanoparticles for intracellular DNA delivery in response to glutathione. Bioconjug. Chem. 16, 1423-1432 (2005).
- Kommareddy, S., Amiji, M. Poly(ethylene glycol)-modified thiolated gelatin nanoparticles for glutathione-responsive intracellular DNA delivery. Nanomedicine. 3, 32-42 (2007).
- Kommareddy, S., Amiji, M. Antiangiogenic gene therapy with systemically administered sFlt-1 plasmid DNA in engineered gelatin-based nanovectors. Cancer. Gene. Ther. 14, 488-498 (2007).
- Kommareddy, S., Amiji, M. Biodistribution and pharmacokinetic analysis of long-circulating thiolated gelatin nanoparticles following systemic administration in breast cancer-bearing mice. J. Pharm. Sci. 96, 397-407 (2007).
- Kaul, G., Amiji, M. Tumor-targeted gene delivery using poly(ethylene glycol)-modified gelatin nanoparticles: in vitro and in vivo studies. Pharm. Res. 22, 951-961 (2005).
- Bardeesy, N., DePinho, R. A. Pancreatic cancer biology and genetics. Nat. Rev. Cancer. 2, 897-909 (2002).
- Li, Z. Identification and characterization of a novel peptide ligand of epidermal growth factor receptor for targeted delivery of therapeutics. FASEB. J. 19, 1978-1985 (2005).
- McCormick, F. Cancer gene therapy: fringe or cutting edge. Nat. Rev. Cancer. 1, 130-141 (2001).
- Green, D. R., Kroemer, G. Cytoplasmic functions of the tumour suppressor p53. Nature. 458, 1127-1130 (2009).
- Barton, C. M. Abnormalities of the p53 tumour suppressor gene in human pancreatic cancer. Br. J. Cancer. 64, 1076-1082 (1991).
