Summary
Tipo B à base de gelatina sistema nanovectors engenharia (GENS) foi desenvolvido para a entrega do gene sistêmica e transfecção no tratamento de câncer pancreático. Por modificação com receptor fator de crescimento epidérmico (EGFR) peptídeos específicos na superfície da nanparticles, eles poderiam alvo no receptor EGFR e liberação do plasmídeo em reduzir ambiente, tais como altas concentrações de glutationa intracelular.
Abstract
Mais de 32.000 pacientes são diagnosticados com câncer de pâncreas nos Estados Unidos por ano e que a doença está associada com mortalidade muito elevada 1. Necessidade urgente de desenvolver novas clinicamente traduzíveis estratégias terapêuticas que podem melhorar as estatísticas de sobrevivência sombrio de pacientes com câncer pancreático. Embora a terapia gênica em câncer tem mostrado uma grande promessa, o grande desafio está no desenvolvimento de sistema de entrega segura e eficaz, que pode levar à expressão do transgene sustentado.
A gelatina é um dos biopolímeros mais versátil natural, amplamente utilizado em produtos alimentares e farmacêuticos. Estudos anteriores de nosso laboratório demonstraram que tipo de gelatina B poderia física encapsular DNA, que preservou a estrutura superenrolado da eficiência de transfecção do plasmídeo e melhorou após a entrega intracelular. Por thiolation de gelatina, os grupos sulfidrila poderia ser introduzido no polímero e que form ligação dissulfeto dentro de nanopartículas, que estabiliza a ligação dissulfeto todo complexo e uma vez que está quebrado devido à presença de glutationa no citosol, carga seria liberado 2-5. Poli (etileno glicol) (PEG) modificado GENS, quando administrado na circulação sistêmica, proporciona longa circulação vezes e preferencialmente metas para a massa do tumor devido à hiper-permeabilidade da neovascularização pela permeabilidade aumentada e efeito de retenção 6. Estudos têm demonstrado over-expressão do receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) em Panc-1 células pancreáticas humanas adenocarcinoma 7. , A fim de visar activamente pancreático linha de células de câncer, EGFR peptídeo específico foi conjugado na superfície da partícula através de um espaçador PEG 8.
A maioria das terapias anti-tumorais do gene estão focados na administração dos genes supressores tumorais, como p53 do tipo selvagem (wt-p53), para restaurar a função de pró-apoptóticas nas células 9 10. No câncer de pâncreas, a maioria das células apresentam mutações na proteína p53, causando a perda de atividade apoptótica. Com a introdução da p53 em peso, a apoptose pode ser reparado e ainda provoca a morte celular em células de câncer 11.
Com base na fundamentação acima, temos projetado EGFR direcionamento de peptídeos modificados thiolated nanopartículas de gelatina para wt p53-entrega do gene e eficiência na entrega avaliados e transfecção em células Panc-1.
Protocol
1. Preparação de DNA plasmidial Encapsulated EGFR-alvejado Nanopartículas Gelatina
- Síntese de gelatina thiolated
- Thiolated gelatina foram sintetizados como método anterior 2-5, por conjugação covalente com 2-iminothiolane no primário grupos amino do tipo B de gelatina. 1 grama de gelatina foi dissolvida em 100 ml de água deionizada e incubadas com 20 mg de cloridrato de 2-iminothiolane em temperatura ambiente por 15 horas.
- Reagente que não reagiu foi removido por diálise contra solução de HCl 5 mM, seguido por uma solução de HCl mM durante 3 horas cada. Purificada thiolated gelatina foi liofilizadas e armazenadas a 4 ° C para uso posterior.
- Preparação de DNA contendo as nanopartículas
- 200 mg thiolated gelatina foi dissolvida em água e pH da solução foi ajustado a 7 com a adição de 0,2 M NaOH. DNA foi adicionado 1mg e gentilmente misturado com uma solução de gelatina.
- Etanol refrigerados foi adicionado lentamente na mistura, enquantosolução de agitação em alta velocidade. Nanopartículas foram formadas quando a composição solvente alterado para 75% hidro-alcoólica solução.
- Nanopartículas foram ainda reticulado pela adição lenta de 0,1 ml de solução de 8% (v / v) glioxal. Reagentes não reagidos foram apagados, com 0,5 ml de solução 0,2 M de glicina.
- Nanopartículas foram ultra-centrifugadas a 16.000 rpm por 30 minutos. Pellets foram lavados com água deionizada duas vezes e nanopartículas purificadas foram liofilizados e armazenados a 4 ° C.
- Modificação da superfície de nanopartículas
- Nanopartículas foram suspensos em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) com concentração de 10 mg / ml e incubadas com 2 vezes o peso da metoxi-PEG-succinimidyl carboxi metil éster (MPEG-SCM, 2.000 MW Da) ou maleimida-PEG-succinimidyl carboxi metílico (MAL-PEG-SCM, 2.000 MW Da) por 2 horas em temperatura ambiente com agitação lenta.
- Nanopartículas PEGylated foram coletadas com ultra-centrifugação a 16.000 rpm para 30 minutoss. Pellets foram lavados com água deionizada duas vezes e nanopartículas purificadas foram liofilizados e armazenados a 4 ° C.
- Nanopartículas MAL-PEG-SCM modificado foram suspensas em 0,1 M tampão fosfato (pH 6,5) com concentração de 10mg/ml e incubadas com peso de 10% do EGFR peptídeo específico (YHWYGYTPQNVI-GGGGC) por 6 horas à temperatura ambiente com agitação lenta.
- Nanopartículas de peptídeos modificados foram coletados com ultra-centrifugação a 16.000 rpm por 30 minutos. Pellets foram lavados com água deionizada duas vezes e nanopartículas purificadas foram liofilizados e armazenados a 4 ° C.
2. Caracterização de EGFR-alvejado Nanopartículas
- Tamanho das partículas e medição de potencial zeta
Nanopartículas foram suspensas em água com concentração de 1mg/ml. Suspensão foi analisada através Zetasizer Nano (Malvern Inc). Análise granulométrica foi realizada em um ângulo de espalhamento de 90 graus a 25 °C. Zeta potencial foi medido em parâmetros padrão do dielétrico de índice, constante de refração e viscosidade da água a 25 ° C. - Microscopia Eletrônica de Varredura
Nanopartículas liofilizado foram montados em montagem de amostra de alumínio e revestido por pulverização catódica com paládio para aumentar a condutividade e minimizar o acúmulo de encargos. As amostras foram observadas para a morfologia da superfície sob uma emissão de campo Hitachi 4800 microscópio eletrônico de varredura em 3 kV. - Espectroscópio de elétrons para análise química (ESCA)
Liofilizadas formulação de controle, peguilado e peptídeo nanopartículas modificadas foram analisadas por ESCA. Foi realizado na ESCA Nacional e Centro de Superfície Análise de Problemas Biomédicos (NESAC / BIO), University of Washington (Seattle, WA).- Amostras foram colocadas em vácuo ultra e expostos a baixa energia do feixe de raios x, que induziu uma emissão de fotoelétrons secundário a partir da superfície.
- Plotando número de elétrons detectados em função do binding de energia, picos de espectro observados foram atribuídos a cada componentes químicos.
- Análise de alta resolução de C1s espectros foi realizada para determinar a composição química exata de hidrocarbonetos (CC ou CH em 285mV), éter (CO) em 286.4mV) e carbonila (C = O em 288,1 mV), ea composição relativa de cada funcionalidade foi determinada pela área sob a curva.
- Estabilidade do plasmídeo encapsulado
A estabilidade do DNA encapsulado plasmídeo foi confirmada pela execução do DNA extraído no pré-cast géis. As nanopartículas foram digeridos com 0,2 protease mg / ml contendo PBS (30 min a 37 ° C) e 0,2 U / ml DNAse (10min em temperatura ambiente), separadamente, simultânea ou seqüencialmente. Amostras foram então carregados em gel de agarose 1,2% (GP) (E-Gel, Invitrogen, CA) em uma concentração de 100ng/well em um volume de 18μL por poço. Nua plasmídeo foi carregado como controle e gel foi executado em 75 V por 30 minutos. Kodak Digital X-ray Specimen System (DXS) foi usado para visualizar bands com transluminescence UV. - Determinação de carga plasmídeo
Plasmídeo nanopartículas encapsuladas foram suspensas em 1mg/ml e digeridas com protease 0.2mg/ml a 37 ° C por 30 minutos. Solução foi centrifugada a 13.000 rpm por 10 minutos eo sobrenadante foi coletado e testado para a concentração de plasmídeo com Picogreen ensaio (Invitrogen). Relação de encapsulamento foi calculado dividindo-se a concentração encapsulado plasmídeo com o carregamento inicial de 0,5% (w / w).
3. Estudos in vitro em Transfection Panc-1 células de câncer pancreático
- Cultura de células condições
Panc-1 e Capan-1 linhagens de células pancreáticas adenocarcinoma, SKOV3 linha de células de ovário e adenocarcinoma NIH-3T3 linha de células de fibroblastos de camundongos foram obtidas a partir ATCC. Panc-1 e NIH-3T3 foram cultivadas com DMEM fornecido com L-glutamina, Pen-strep e 10% de soro fetal bovino a 37 ° C e 5% CO 2, enquanto Capan-1 necessário DMEM fornecido 20% de soro fetal bovino.SKOV3 foi cultivada em RPMI-1640 fornecido com 10% de soro fetal bovino. - Ocidental blot para expressão EGFR
- Lisados celulares foram coletados de 2 milhões de células e analisadas para a concentração de proteína total usando ensaio BCA (Pierce). NIH-3T3 foi utilizada como controle negativo e SKOV3 foi utilizada como controle positivo para a expressão de EGFR.
- 10 mg de extrato de proteína total foi executado em pré-moldados de sódio dodecil sulfato de poliacrilamida-gel eletroforese sistema (SDS-PAGE) em 135V por 90 minutos.
- Posteriormente, o gel foi transferido para membrana PVDF por iBlot Sistema Dry Blotting (Invitrogen).
- Membrana foi bloqueada com 5% de leite desnatado em Tween contendo tampão Tris salina (TBS-t) por 1 hora em temperatura ambiente.
- Membrana foi cortada e incubadas com diluição de 1:1.000 primário de coelho beta actina-anticorpos e 1:1.000 a diluição dos anticorpos primários EGFR coelho separadamente durante a noite a 4 ° C.
- Membrana foi lavada duas vezes comTBS-t e incubados com diluições de 1:2.000 secundário anti-coelho rábano-IgG conjugado com peroxidase na TBS-t por 1 hora em temperatura ambiente.
- Após lavagem anticorpos em excesso com TBS-t e água, 4 ml de substrato ECL (Pierce, Rockford, IL, EUA) foi adicionado e incubado com membranas por 5 minutos.
- Bandas quimioluminescente foram visualizados usando Kodak Digital X-ray Specimen System (DXS).
- Estudos de viabilidade de células com diferentes formulações
- Panc-1 células foram cultivadas em placas de 96 poços em 10.000 células por poço em 200μL de meio DMEM suplementado durante a noite.
- Meio de crescimento foi substituído por soro de mídia livre contendo diferentes concentrações de nanopartículas com 0, 0,5, 1, 2, 4, 6 mg / ml. 1mg/ml PEI, um conhecido polímero catiônico citotóxicos, foi utilizada como controle positivo.
- Células foram tratadas com nanopartículas de 200μL por 6 horas e depois substituído por 20μL do reagente MTS e 100μL completomeios de cultura.
- Após a incubação pós durante 3 horas a 37 ° C em 5% CO 2, a absorção do produto formazan foi medida em 490nm com Biotek SynergyHT leitor de placas (Winooski, VT).
- A viabilidade por cento das células foi expressa como a proporção de absorbância de polímero de células tratadas em relação ao controle negativo (0mg/ml) multiplicado por 100 e plotados em função da concentração de polímero.
- Tráfico de estudos com células
- Rodamina B isotiocianato (RBITC) foi usada para o conjugado de gelatina thiolated pela reação com o grupo amina. Após diálise e liofilização, RBITC rotulados thiolated gelatina foi usada para a preparação de nanopartículas.
- Antes dessolvatação, 25μL PicoGreen foi misturado com 1mg plasmídeo por 1 minuto e plasmídeos rotulados foram adicionadas à solução de gelatina. Formulações diferentes foram feitos seguindo o método anterior.
- Panc-1 células foram cultivadas em placas de 6 poços contendo tampa de vidro-escorrega com 200.000 células per também. Após o crescimento durante a noite, 2ml de nanopartículas marcadas foram tratados em cada poço, com concentração de 1mg/ml em meio livre de soro.
- Depois de momentos diferentes, a partir de 15 minutos a 6 horas, médio foi substituído por meio de cultura contendo 1μg/ml de Hoest 33.342 (Invitrogen) por 15 minutos de incubação à temperatura ambiente. 2 ml de solução de paraformaldeído a 4% foi substituída em cada poço para corrigir células. As células foram então lavadas com PBS duas vezes.
- Coversilps foram montados em lâminas de vidro para. Microscopia eletrônica de varredura a laser confocal de fluorescência foi usado para captar imagens de células fixas.
- Determinação qualitativa da eficiência de transfecção por microscopia de fluorescência com pEGFP-N1 nanopartículas encapsuladas
- pEGFP-N1 plasmídeos foram encapsulados em nanopartículas e suspenso em soro de mídia livre com concentração equivalente a 10μg por plasmídeos ml para os tratamentos adicionais.
- Panc-1 células foram cultivadas durante a noite em seis placas de bem-containing tampa de vidro-escorrega com 200.000 células por poço. 2ml de pEGFP-N1 nanopartículas encapsuladas plasmídeos foram tratados em cada poço. 20μg de plasmídeos foram misturados com 20μl Lipofectin, reagentes de transfecção lipídica catiônica, e foi utilizado como controle positivo, enquanto as células não tratadas foram usadas como controle negativo.
- As células foram incubadas com diferentes formulações para 6 horas.
- Médio foi substituído por meio de cultura e as células foram transfectadas para pós-24, 48, 72 e 96.
- Depois de pós-transfecção, médio foi substituído por meio de cultura contendo 1μg/ml de Hoest 33.342 (Invitrogen) e incubadas com as células por 15 minutos em temperatura ambiente.
- Lamínulas foram montadas em lâminas de vidro e de expressão de GFP nas células foi observado por microscópio de fluorescência. Contraste de interferência diferencial (DIC) e imagens de fluorescência obtidas utilizando microscópio Olympus BX61 e as imagens digitais foram processadas com o software Image J.
- pEGFP-N1 plasmídeos foram encapsulados em nanopartículas e suspenso em soro de mídia livre com concentração equivalente a 10μg por plasmídeos ml para os tratamentos adicionais.
- Panc-1 células foram cultivadas durante a noite em seis bem-placas com 200.000 células por poço. 2ml de pEGFP-N1 nanopartículas encapsuladas plasmídeos foram tratados em cada poço. 20μg de plasmídeos foram misturados com 20μl Lipofectin, reagentes de transfecção lipídica catiônica, que foi utilizado como controle positivo e células não tratadas foram usadas como controle negativo.
- As células foram incubadas com diferentes formulações para 6 horas.
- Médio foi substituído por meio de cultura e as células foram incubadas por pós-24, 48, 72 e 96.
- Depois de pós-transfecção, lisados celulares foram coletadas de cada bem e analisadas para concentração de proteína total usando ensaio BCA (Pierce).
- placa foi bem coated com 100μl de diluições de 1:1000 monoclonal anti GFP-anticorpos em cada poço. Após duas horas de incubação, a placa foi lavada com PBS-0,5% (w / v) Tween-80 por 4 vezes.
- Buffers 300 ul TBS bloqueio foram adicionados em cada poço e incubado por 2 horas. Em seguida, placa foi lavada com PBS-0,5% (w / v) Tween-80 por 4 vezes.
- 30μg de proteínas de cada grupo foram adicionados à placa e incubadas overnight a 4 °. Em seguida, placa foi lavada com PBS-0,5% (w / v) Tween-80 por 4 vezes.
- 100μl de diluições de 1:2400 secundário anti GFP-anticorpos em relação à fosfatase alcalina foram adicionados a cada poço e incubado por 1 hora. Em seguida, placa foi lavada com PBS-0,5% (w / v) Tween-80 por 4 vezes.
- 100μl substratos da fosfatase alcalina foram adicionados a cada poço e incubado por 30 minutos a 1 hora. Placa foi medido com Biotek leitor de placas Synergy HT para absorbância a 405nm.
- Concentração de GFP expressa foi relatado como nanogramas por milligrams de proteína total.
- Wt p53-plasmídeos foram encapsulados em nanopartículas e suspenso em soro de mídia livre com concentração equivalente a 10μg por ml plasmídeo para tratamentos adicionais.
- Panc-1 células foram cultivadas durante a noite em seis bem-placas com 200.000 células por poço. 2ml de wt p53-plasmídeos nanopartículas encapsuladas foram tratados em cada poço. 20μg de plasmídeos foram misturados com 20μl Lipofectin, reagentes de transfecção lipídica catiônica, que foi utilizado como controle positivo e células não tratadas foram usadas como controle negativo.
- As células foram incubadas com diferentes formulações para 6 horas.
- Médio foi substituído por meio de cultura e as células foram pós-incubadas por 48 horas.
- mRNA foram extraídos de cada poço, usando alta Pure RNA isolamento kit (Roche, Indianapolis, IN) e medido com Nanodrop 2000 (Thermo Científico, Wilminton, DE).
- RT-PCR foi feita utilizando QIAGEN Um passo-RT-PCR kit (QIAGEN, Valencia, CA). Primers para p53, Bax, Bcl-2, beta-actina, DR5, Apaf-1, PUMA, Survivin foram sintetizados por MWG Eurofins Operon (Huntsville, AL).
- Os produtos de PCR foram avaliados com a eletroforese em gel e os pixels das bandas de cDNA foram analisados com o software ImageJ.
- Wt p53-plasmídeo foi encapsulada em nanopartículas e suspenso em soro de mídia livre com concentração equivalente a 10μg por plasmídeos ml para tratamento posterior.
- Panc-1 células foram cultivadas durante a noite em seis bem-placas com 200.000 células por poço. 2ml de wt p53-plasmídeos nanopartículas encapsuladas foram tratados em cada poço. 20μg de plasmídeos foram misturados com 20μl Lipofectin, reagentes de transfecção lipídica catiônica, que foi utilizado como controle positivo e células não tratadas foramusada como controle negativo.
- As células foram incubadas com diferentes formulações para 6 horas.
- Médio foi substituído por meio de cultura e as células foram incubadas por pós-24, 48, 72 e 96.
- Permeabilidade condensação da cromatina / Membrana / Kit Apoptosis Morto Cell (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi usado para rotular células apoptóticas, células necróticas e de células vivas com diferentes corantes.
- iCys Imaging Research Citómetro de CompuCyte (Westwood, MA) foi utilizada para analisar e comparar os níveis de apoptose após o tratamento. Com base nas imagens de fluorescência microscópicas, as intensidades de todas as cores foi gravado e plotados contra a contagem e as percentagens para diferentes populações foram calculadas.
- Comparado ao controle negativo, o que significa que não havia tratamento para as células, as células apoptóticas mudanças vezes foram calculados para fora e listados no gráfico.
- Kit Assay 3.8.8 Apo-ONE Caspase-3 Homogêneos / 7 (Promega, Madison, WI) foi usado para examinar os pro-apoptóticos atividade após a transfecção de wt p53-plasmídeo. 1mg/ml PEI foi utilizada como controle negativo para eliminar toda a atividade apoptótica. Depois de pós-transfecção, as células foram tratadas com rodamina 110, bis-(N-CBZL-aspartil-L-glutamil-L-valyl-L-aspártico amida de ácido; Z-DEVD-R110), que é um substrato de caspase 3 / 7, por até 18 horas.
- Placa foi medido com Biotek leitor de placas Synergy HT para fluorescência em 490/520 nm. Com base na intensidade de fluorescência verde, pró-apoptóticos atividade pode ser avaliada.
4. Resultados representante
1. Síntese e Chatacterization de nanopartículas de EGFR Targeted
EGFR direcionamento de peptídeos modificados nanopartículas foram sintetizadas como o esquema mostrado na figura 1. As nanopartículas preparadas por dessolvatação foram caracterizados por tamanho de partícula e potencial zeta. A acusação tamanho e média da superfície das partículas preparadas a partir de gelatinas thiolatedcom diferentes graus de thiolation estão listadas na Tabela 1. Os diâmetros médio de partícula de diferentes nanopartículas foram entre 150-250 nm. Nanopartículas Thiolated ter tamanho menor em comparação com nanopartículas de gelatina, talvez devido à formação de ponte dissulfeto dentro partículas. Com modificações de superfície, em tamanhos diferentes de nanopartículas têm aumentado. Os potenciais zeta de diferentes formulações foram em torno de -20 mV. Com a análise de SEM, o tamanho, a morfologia da superfície e forma esférica de nanopartículas foram observados e correspondente ao resultado Zetasizer. Eficiência de carga de DNA em nanopartículas de gelatina e de gelatina thiolated nanopartículas foram superiores a 95% (Tabela 1).
Figura 1. Scheme reação química, por modificação da superfície de ilustrar thiolated nanopartículas de gelatina com crescimento epidérmico factor receptor (EGFR) peptídeo de ligação através de um (etileno glicol) poli espaçador (PEG).
Caracterização de nanopartículas
| Formulação | Diâmetro das nanopartículas (nm) | Potencial Zeta (mV) | Eficiência Carregando plasmídeo de DNA (%) |
| Gel NP | 151,4 ± 23,5 | -17,1 ± 5,23 | 95,6 ± 2,2 |
| SH-Gel NP | 132,6 ± 17,9 | -24,6 ± 5,16 | 97,0 ± 3,8 |
| SH-Gel-PEG | 179,0 ± 30,9 | -22,3 ± 9,50 | 95,8 ± 6,5 |
| SH-Gel PEG Peptide | 230,8 ± 41,5 | -18,1 ± 4,02 | 94,8 ± 5,1 |
Tavel 1. O tamanho das partículas, carga de superfície, e eficiências de DNA plasmídeo encapsulamento de controle e EGFR-alvejado gelatina e thiolated nanopartículas de gelatina.
De alta resolução C 1S scans da espectroscopia eletrônica para análise química (ESCA) foi usada para analisar componentes de superfície de thiolated gelatina (SH-Gel NP), PEG-modificados thiolated gelatina (SH-Gel PEG) e EGFR direcionamento de peptídeos modificados gelatina thiolated nanopartículas (SH-Gel PEG Peptide). Os resultados da Tabela 2 mostraram intensidades de pico do CH (hidrocarbonetos), CO (éter), e C = O (carbonila) grupos de 285,0, 286,3, e 288,1 eV, respectivamente. O sinal de CO éter PEG aumentou após a modificação e diminuiu após a conjugação de peptídeos. Enquanto a composição de nitrogênio diminuiu após a modificação e PEG aumentou após peptídeo modificação, que confirmou a presença de EGFR-targeting peptídeo sobre as nanopartículas. Análise ESCA também confirmou PEG e modificação da superfície de peptídeo.
Electron Spectroscopy para análise química de nanopartículas de composição da superfície
| Formulação | C 1s (%) | O 1s (%) | N 1s (%) |
| SH-Gel NP | 59,3 ± 0,8 | 22,9 ± 0,5 | 12,9 ± 0,1 |
| SH-Gel-PEG | 58,2 ± 0,6 | 28,0 ± 1,2 | 9,5 ± 0,7 |
| SH-Gel PEG Peptide | 56,7 ± 0,8 | 25,9 ± 0,7 | 12,3 ± 0,6 |
| Formulação | CC (%) | CO, N (%) | C = O (% ) |
| SH-Gel NP | 51,5 | 26,6 | 21,9 |
| SH-Gel-PEG | 17,1 | 63,1 | 19,8 |
| SH-Gel PEG Peptide | 33,1 | 42,8 | 24,1 |
Tabela 2. C 1S scans de alta resolução de espectroscopia eletrônica para análise química (ESCA)
A fim de analisar a estabilidade do plasmídeo encapsulado, as nanopartículas foram tratadas com protease ou separadamente DNAse, simuntaneously ou seqüencialmente. Após a eletroforese, os resultados na Figura 2 têm mostrado que DNA plasmídeo encapsulado em todas as nanopartículas estão protegidos por nanopartículas e estável, comparável ao DNA nu plasmídeo. Estes estudaram têm mostrado que todas essas nanopartículas podem encapsular e preservar a estrutura plasmídeo após o encapsulamento.
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Figura 2. Estabilidade de DNA plasmídeo encapsulado em thiolated gelatina, PEG-modificados thiolated gelatina, e EGFR peptídeo modificado thiolated nanopartículas de gelatina por eletroforese em gel de agarose. As nanopartículas foram tratados com 0,2 mg / ml de protease para provar encapsulamento DNA plasmídeo dentro da matriz de nanopartículas
2. Linha de base Expressão EGFR nas células do cancro do pâncreas
Duas linhas de adenocarcinoma pancreático humano celular (Panc-1 e Capan-1) foram analisadas por western blot para expressão de EGFR. Adenocarcinoma de ovário humano (SKOV3) e de fibroblastos de camundongos ((NIH-3T3), as células foram escolhidos como controles positivos e negativos, respectivamente. Beta-actina foi analisada como controle de carga de proteína. Panc-1 células têm demonstrado maior expressão do EGFR em comparação com Capan-1 e esta linhagem de células foi então utilizado para os seguintes estudos in vitro
3. Citotoxicidade de Controle e surface-Modified Thiolated Nanopartículas Gelatina
A fim de avaliar a interação celular de nanopartículas, ensaios de citotoxicidade foram realizados após o tratamento com nanopartículas. Com base nos resultados na Figura 3, tanto o controle e as nanopartículas de superfície modificada foram relativamente seguro e biocompatível em Panc-1 células mesmo em altas concentrações, com relação ao PEI. Os seguintes estudos foram realizados com nanopartículas de 1mg/ml.
Figura 3. Viabilidade Percentual de células em função da concentração de formulação de nanopartículas em células Panc-1 avaliada pelo corante tetrazólio (MTS) ensaio
4. Receptor de Captação mediada por células em Panc-1 Células
Para confirmar a acessibilidade superfície de EGFR-targeting peptídeo e receptor mediada por absorção endocítica de nanopartículas, um sistema de rotulagem foi desenhado por cada co-mponent com fluorescência diferentes para a visualização de nanopartículas de captação e tráfico de células. Com este sistema de rotulagem, DNA plasmídeo, nanopartículas e núcleo da célula poderia ser identificado. Microscopia eletrônica de varredura a laser confocal de fluorescência foi usado para tirar fotos em momentos diferentes, de 15 minutos a 6 horas. Ao comparar as imagens de diferentes formulações, peptídeo conjugado nanopartículas de gelatina mostrou a absorção rápida e liberação do plasmídeo em 30 minutos. Este resultado mostrou que EGFR peptídeo conjugado com nanopartículas foram submetidos a endocitose facilitado com a interação rápida entre o peptídeo EGFR específicos e receptores EGFR na superfície da célula, que foi muito mais rápido, em comparação com outras nanopartículas, que sofreu não específica endocitose.
Estudo Tráfico celular
Figura 4. Microscopia de fluorescência confocal umalysis de DNA encapsulado absorção de nanopartículas e tráfico de Panc-1 células. (Vermelho = rodamina marcado nanopartículas, verde = PicoGreen marcado DNA plasmídeo, e azul = núcleo DAPI-identificadas). A potência do laser foi 7 vezes maior nos últimos quatro figuras do painel inferior.
5. Qualitativa e quantitativa em Transfection Vitro com Proteína Verde Fluorescente melhorada
ELISA na Figura 5 e análise microscópica de fluorescência na Figura 6 foram usados para medir a eficiência tranfection qualitativa e quantitativa em Panc GFP-1 com a administração de células sem modificações, PEG-modificados e peptídeo modificado EGFR thiolated nanopartículas de gelatina. Plasmídeos entregue pelo EGFR-alvo nanopartículas resultou no mais alto nível de expressão GFP após 48 horas em relação a outros controlos, incluindo Lipofectin-complexado DNA.
Figura 5. GFP uma expressãonalyzed por ELISA plotado como uma função do tempo pós-administração de plasmídeo de DNA no controle e EGFR-alvo nanopartículas.
Fluoresence análise microscópica para transfecção GFP
Figura 6. Análise qualitativa da expressão da proteína verde fluorescente no Panc-1 células por microscopia epifluoresence após 24, 48, 72 e 96 horas após a transfecção com EGFP-N1. Lipofectin DNA do complexo foi utilizado como controle positivo.
6. Tranfection Em Vitro com tipo selvagem p53 Plasmid em Panc Células-1
Plasmídeos do tipo selvagem p53 pORF-hp53, com EF-1α / HTLV promotor híbrido foram extraídas de E. coli e encapsulados em nanopartículas para estudar o efeito terapêutico apoptose. Panc-1 células foram tratadas com partículas por 6 horas e pós-transfectadas por 24 adicionais, 48, 72 e 96 horas.
Como o p53 pode induzir apoptose em células e para realizar esta função, muitos fatores de transcrição a jusante estaria envolvido diretamente e regulada pela expressão da p53 em peso. Entre eles, Bax, caspase-3, caspase-9, DR5, PUMA e Apaf-1 seria up-regulada por expressão de p53 e enquanto Bcl-2, survivina seriam reprimidos. A fim de examinar os níveis desses fatores de transcrição, o mRNA foi extraído de células Panc-1 depois de 48 horas após a transfecção e usado para RT-PCR. Os produtos foram avaliados com a eletroforese em gel e bandas foram analisados com ImageJ. Com base nos resultados mostrados na Figura 7, sobrevivendo diminuiu significativamente com o tratamento de EGFR alvo thiolated nanopartículas de gelatina em comparação com outros tratamentos, nenhuma mudança óbvia foi visto em Bcl-2, Bax e expressão da caspase-3, caspase-9, DR5, PUMA e Apaf-1increased com o tratamento nanopartículas alvo.
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Figura 7. Os níveis de mRNA de fatores jusante da wt p53-expressão foram comparados por RT-PCR após 48 horas pós-transfecção.
Depois wt p53-transfecção, kit Apoptose Chromatin Permeabilidade condensação / Membrana / Morto celular foi usado para diferenciar células apoptóticas, células necróticas e de células vivas com diferentes corantes. iCys Imaging Research Citómetro de CompuCyte (Westwood, MA) foi utilizada para analisar e comparar os níveis de apoptose após o tratamento. Comparado ao controle negativo, células apoptóticas mudanças vezes foram calculados para fora e listados na Figura 8. EGFR alvo thiolated nanopaticles gelatina mostraram a maior população de células em apoptose após pós-transfecção. Análise de caspase 3 / 7 atividade também mostrou que EGFR-alvo nanopartículas tinha internalização rápido e mais alto nível de atividade de apoptose em células Panc-1.
Figura 8. Análise por citometria de pró-apoptóticos atividade no controle wt p53-transfectadas Panc-1 células usando iCys ° imagem citómetro
Discussion
E controle de EGFR alvo thiolated nanopartículas de gelatina foram preparadas com encapsulação do DNA eficiente e estabilidade. Os tamanhos de partículas de todos esses sistemas foram na faixa de 150-250 nm de diâmetro. Potencial zeta provou que este sistema é um sistema um pouco negativo. Com a análise de SEM, os tamanhos das nanopartículas foram os mesmos, com resultado Zetasizer. Análise ESCA poderia confirmar PEG e modificação da superfície de peptídeos.
Ocidental blot mostrou que Panc-1 células tinham uma elevada níveis de expressão do EGFR e esta linha celular foi usado para estudos in vitro. Tanto o controle e as nanopartículas de superfície modificada foram relativamente menos citotóxicos em células Panc-1 em relação ao PEI.
Estudos de tráfego celular mostrou rápida absorção e liberação do plasmídeo de EGFR-alvo nanopartículas em Panc-1 células. Entrega de DNA repórter plasmídeos expressando EGFR-alvejado com nanopartículas resultou em maiores níveis deGFP expressão em relação a outros controlos, incluindo Lipofectin-complexado DNA. Com o mesmo sistema, transfecção com wt p53-plasmídeo acionado o caminho downstream apoptóticas e rápida apoptose induzida em Panc-1 células.
Estes resultados preliminares sugerem que o EGFR-alvejado thiolated nanopartículas de gelatina pode servir como um sistema seguro e eficiente DNA de entrega para a terapia gênica como tratamento para câncer de pâncreas.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela Aliança do Instituto Nacional do Câncer em Nanotecnologia para o Centro de Câncer de Excelência em Nanotecnologia (CCNE) conceder-U54 CA151881.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type B gelatin, Bloom 225 | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| 2-iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Elim Biopharm | N/A | |
| pORF-hp53 E. coli | Invitrogen | porf-hp53 | |
| Glyoxal solution (40wt. % in H2O) | Sigma-Aldrich | 128465 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225-250G | |
| QIA filter Plasmid Mega kit | Qiagen | 12281 | |
| Beckman LE 80K Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | N/A | |
| FreeZone 6 Liter Console Freeze Dry Systems | Labconco Corp. | 7753020 | |
| mPEG-SCM, MW 2,000 Da | Laysan Bio Inc. | mPEG-SCM-2K-1g | |
| MAL-PEG-SCM, MW 2,000 Da | Jenkem Technology | A5001-1 | |
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments | Zetasizer Nano ZS | |
| Hitachi 4800 field emission scanning electron microscope | Hitachi | S-4800 UHR FE-SEM | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits | Invitrogen | P7589 | |
| Lipofectin Transfection Reagent | Invitrogen | 18292011 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10 013 CM | |
| RPMI | Mediatech, Inc. | 50 020 PB | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 | |
| iBlot Dry Blotting System | Invitrogen | IB1001 | |
| XCellSureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark | Invitrogen | EI0002 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 32109 | |
| Kodak Digital X-ray Specimen (DXS) System | Kodak | N/A | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega Corp. | G3580 | |
| BioTek SynergyHT plate reader | BioTek | N/A | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | N/A | |
| One-step RT-PCR kit | Qiagen | 210212 | |
| Chromatin Condensation/Membrane Permeability/Dead Cell Apoptosis Kit | Invitrogen | V23201 | |
| Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay kit | Promega Corp. | G7790 | |
| Hybaid PCR Sprint Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, Inc. | N/A | |
| EGF Receptor Antibody | Cell Signaling Technology | 2232 | |
| β-Actin Antibody | Cell Signaling Technology | 4967 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| Mouse Monoclonal GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-597 | |
| Goat Polyclonal GFP antibody (Alkaline Phosphatase) | Novus Biologicals | NB600-1502 | |
| Phosphatase Substrate Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 37620 |
References
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