Summary
בתאי שריר בתרבית הם מודל לקוי לשחזר שרירים מעוצבבים
Abstract
אדם לתאי שריר ראשוניים בתרבית aneurally בשכבה כמעט באופן ספונטני, כי החוזה, בהעדר מרכיב העצב, התמיינות תאים מוגבל גירוי נוירון מוטורי חסר 1. מגבלות אלה לעכב את המחקר במבחנה ב neuromuscular של מחלות רבות בתאי שריר בתרבית. חשוב לציין, מגבלות הניסוי של תאים בתרבית monolayered שרירים ניתן להתגבר על ידי עצבוב התפקודי של myofibers עם explants בעמוד השדרה של שיתוף תרבויות.
כאן, אנו מציגים את השלבים השונים הנדרשים על מנת להשיג העצבוב יעיל, תקין של אדם לתאי שריר ראשוניים, המוביל להשלים את התכווצות בידול וסיבים לפי השיטה שפותחה על ידי Askanas 2. כדי לעשות זאת, תא שריר שיתוף תרבותי עם explants בעמוד השדרה של עוברי עכברים בבית ED 13.5, עם הגרעינים השורש הגבי מחוברת עדיין את פרוסות בעמוד השדרה. אחרי כמה ימים, שרירים Fibers להתחיל להתכווץ בסופו של דבר בין מפוספס דרך העצבוב על ידי neurites תפקודית מקרין מן explants בעמוד השדרה כי בהתחברות לתאי השריר. מבנה זה יכול להישמר במשך חודשים רבים, פשוט על ידי דיאלוג על בסיס קבוע בינוני התרבות.
יישומים של כלי זה הן רבות שלא יסולא בפז, שכן היא מייצגת מודל פונקציונלי ניתוח רב תחומי של פיתוח שרירים העצבוב האדם. למעשה, שלמה דה נובו ההתקנה צומת neuromuscular מתרחשת בצלחת התרבות, המאפשר מדידה קלה של פרמטרים רבים בכל שלב, בהקשר יסודי פיזיולוגית.
רק כדי להזכיר כמה דוגמאות, גנומית ו / או מחקרים proteomic יכול להתבצע ישירות על שיתוף תרבויות. יתר על כן, תופעות לפני ואחרי סינפטי ניתן להעריך במיוחד ובנפרד בצומת neuromuscular, כי שני הרכיבים מגיעים מינים שונים,עכברוש האדם, בהתאמה. עצב, שריר שיתוף תרבות יכולה גם להתבצע עם אדם לתאי שריר מבודד לחולים הסובלים ממחלות שריר או neuromuscular 3, ולכן יכול לשמש ככלי מיון עבור תרופות המועמד. לבסוף, ציוד מיוחד, אך לא מתקן קבוע BSL2 צורך לשחזר יחידה תפקודית מוטורית בצלחת התרבות. שיטה זו ולכן הוא בעל ערך שריר הן, כמו גם בקהילות מחקר neuromuscular ללימודי פיזיולוגיות מכניסטית של הפונקציה neuromuscular, בהקשר הרגיל ומחלות.
Protocol
1. הכנת תרבית תאים ראשונית האדם שריר
- להקים תא תרבויות האדם שריר על פי טכניקה explantation מחדש, explantation 4. ראשית, להסיר רקמת השריר הלא מהתאים. לאחר מכן, להטביע 1 3 מ"מ explants שרירים מקרש של פלזמה, אשר מאפשר fibroblasts לצאת מן explants את.
- Explants המוטבע מועברים על גבי צלחת פלזמה ג'לטין מצופה ולתת להם לגדול במצע גידול רגיל (MEM השלימו עם המדיום 25% 199, 10% עוברית שור בסרום [FBS], 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 10 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין, 10 ng / ml גדילה אנושי גורם אפידרמיס [EGF], 12.5 ng / ml הגורם האנושי גידול פיברובלסטים [FGF]) בשכבה. התאים העולות explants בתנאים האלה לתאי שריר. תאים אלה ימשיכו לגדול בשכבה לאחר הסרת explants את.
- התרבות התאים aneurally על 0.1 ג'לטין מצופים צלחות% במצע הגידול הרגיל. התאים יכולים להיותבתרבית aneurally ו מוגבר לפי הצורך. עדיף להשתמש בתאי שריר במעבר בין 3 ל 8 כדי לבצע את שיתוף תרבויות. זה קריטי כדי innervate myotubes צעירים, לאחר מועד זה, שותף תרבויות יש סיכון גבוה של אי. יתר על כן, myotubes לא צריך להיות גדול מדי, סמיך מדי.
- יומיים לפני העצבוב מתוכנן, צלחת לתאי השריר על 35 מ"מ תרבות מנות רקמות (או 6 צלחות גם) בצפיפות של 500,000 תאים לכל צלחת במצע גידול רגיל. בצפיפות זה, התאים נמצאים confluency הנכון כדי להפעיל את היתוך למחרת, ואת העצבוב לאחר יום לאחר מכן. שימוש באותם תנאים, myotubes הם בשלב הנכון העצבוב אופטימלית התכווצות סיב לאחר מכן ומכאן.
- למחרת, להחליף את מדיום הגידול הרגיל עם המדיום היתוך מורכב MEM השלימו עם המדיום 25% 199, 5% FBS, 10 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין 1% של פניצילין / סטרפטומיצין.
2. Isolati על של Explants עובריים עכברוש טבורי עמוד השדרה
ההליך כולו על מנת לבודד את explants בעמוד השדרה מתבצע תחת מיקרוסקופ דו עינית, על תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS, Gibco / Invitrogen נ"צ 14170) המכיל 10% בסרום שור עוברית (FBS).
- זה חיוני כי עוברי עכברים הם בין ED 13 ו - 14 כשלב התפתחות שונה היה לסכן את כל התהליך. להקריב את האישה ההרה עם CO 2 ולאסוף את שרשרת העובר שלם בינוני HBSS. לבודד את כל העובר ואת לערוף להם המתת חסד.
- לנתח את חוט השדרה העובר משאר הגוף בריא ושלם ולהסיר השריר שמסביב רקמת חיבור. להיות זהירים מאוד כדי לשמור על הגב ganglions שורש (DRGs) המחוברים בחוט השדרה על מנת להבטיח עצבוב פונקציונלי.
- כל פרוסה חוט השדרה transversally באופן explant מכיל לפחות 2 DRG קשור אליו (explants של 1 מ"מ 3).
- הסר בינוני היתוך לתרבות תא שריר, משאיר שכבה דקה של המדיום על monolayer.
- מניחים את explants בזהירות על שכבת השריר התא, חמש explants במרווחים קבועים זה מזה בכל צלחת 35 מ"מ.
- להוסיף לאט לאט, טיפה בינוני חכם, היתוך explant על כל אחד. יש צורך להוסיף בינונית לתאי השריר כדי לשרוד, אבל לא יותר מדי כדי לאפשר את explants לדבוק הראשון ליצור קשר עם התאים. אם המדיום הוא לא הוסיף כראוי (יותר מדי חזק או בינוני יותר מדי), explants את יצוף ויהיה אינם innervate לתאי השריר.
- לאחר explants מתחילים לדבוק, למעלה בינוני היתוך 2 מ"ל לכל צלחת 35 מ"מ, ולשים את הכלים בזהירות רבה לתוך אינקובטור.
4. תחזוקה של עצבים שרירים Heterologous שיתופי תרבויות
- לשנות את המדיום היתוך פעמיים בשבוע.
ברגע יומיים לאחר עצבוב, ניתן לראות את neurites העולה מתוך explant כל קשרים עם לתאי השריר, המיוצגים על ידי כפתור כמו מבנים (איור 1).
כבר 4-6 ימים לאחר עצבוב, כמה סיבים בודדים יתחיל להתכווץ.
הצירים להימשך חודשים רבים, שמר פשוט על ידי שינוי תרבות בינונית פעמיים בשבוע.
אחרי בערך 2 שבועות, explant חוט השדרה עצמו מתנוון, אבל העצבוב נשמרת. זה נורמלי. שכבה דקה של מרכיב העצב נשאר על פני השטח של שכבת תא השריר. זו רשת העצבים מספיק כדי לשמור את הפונקציונליות של יחידת המנוע.
אם explants צפים במדיום יום לאחר עצבוב, הם לעולם לא תדבק. זה קורה כאשר שכבת תא שריר הואלא confluent מספיק, או כאשר אמצעי נוסף גם פחות או יותר. לפעמים, את שומרת explant אבל לא neurites תצא. סביר להניח עקב חוסר של DRG המצורפת אליו. במקרה זה, כמו גם, עצבוב לא יוקם. לתפעל את הכלים בזהירות רבה בשבוע הראשון, כמו explants את עדיין יכולה לנתק בקלות. להחליף את המדיה היתוך, מוסיפים את הנוזל ירידה מבחינת במהירות מינימלית, כדי למנוע ניתוק התא.
באיור 1. חוט השדרה, שרירים explants תא שיתוף תרבויות מיום 1 עד יום 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כלי במבחנה פיזיולוגי ללמוד התא תפקוד השרירים בהקשר רגיל וגם בזמן מחלה מעניין הגבוה ביותר myologists, כי התא תרבויות שרירים בדרך כלל לא לשחזר את החשיבות של מספר תאים ותא מסוג חיבורים. תוספת של מטוהרים הנוירונים המוטוריים לתאי השריר אינה מספיקה כדי להשיג את יחידת המנוע תפקודית מאז נוכחות של תאים שוואן נדרש העצבוב להיות יעיל 5 וזה לא טופולוגית (הפצה 3D + מיוחד) רלוונטי פרוטוקול המתוארת כאן שימש בהצלחה להקים לתאי השריר מעוצבבים במבחנה תוצאות ההתבגרות NMJ מלאה כי ניתן להעריך בקלות.
מודלים Murine זמינות כעת עבור מחלות התוקפת רבים. למרבה הצער, רבים מודלים אלה מוגבלים מבחינת התרגום המחלה בחולים אנושיים, למשל על מודלים העכבר על ניוון שרירים, דושןניוון שרירים או טרשת לרוחב amyotrophic. ניוון שרירים השדרה נגרמת על ידי מוטציה בגן SMN1, אשר בין השאר ניתן למתן על ידי נוכחות של גן SMN 2 בגנום האנושי 6. לעומת זאת, בעכברים הגנום מכיל רק 1 הגן SMN, ומחיקה שלו הוא קטלני embryonically 7. לכן, על מנת לפתח מודלים השדרה עכבר שרירים להתנוון, עותק האדם SMN2 הוצג באופן מלאכותי לתוך עכברים בנוקאאוט SMN 8,9. בעלי חיים אלה עדיין מייצגים את המודל הגנטי הקרוב ביותר את הפתולוגיה האנושית, אך פנוטיפ נצפתה בעכברים אלה נובע הביטוי של הגן SMN2 כי עכברים בדרך כלל אינם מבטאים 10. במקרה של ניוון שרירים מסוג דושן, העכברים MDX יש גן הדיסטרופין מוטציה דומה בבני אדם, אך התוצאה היא הרבה פחות חמורה לעומת הסימפטומים אצל חולים 11. מודל העכבר הנפוץ ביותר עבור amyotrophiג טרשת לרוחב, את SOD1 לעכברים, מאוכזב עד כה חושף תובנות לתוך מנגנוני המחלה וגישות טיפוליות 12,13. לכן, תאים בעמוד השדרה, שרירים explants כבל שיתוף תרבויות ללמוד לתפקד, מאפיינים גנומית proteomic של השרירים המגיעים חולים, על רקע פיזיולוגי לגמרי, מייצגים כלי רב ערך כדי לחקור מחלות מורכבות כאלה. יתר על כן מודל זה הטרו מינים עוזר להבחין בין מנגנונים פתולוגיים neurogenic ו myogenic. 3,14,15
שיתוף התרבות המוצגת כאן יש גם כמה מגבלות. כך, למשל, ניסויים אימונוהיסטוכימיה על תא שריר קשה לבצע על מבנה זה, כי מסוף העצב המגולם על ידי explant מכסה את המנגנון NMJ postsynaptic. מערכת זו יכולה לשמש גם כדי להעריך את ההשפעות neurotrophic או myotonic של תרופות במערכת התרבות משולבת בוגר יחסית, אבל זה לא מאפשר תפוקה גבוההההקרנה, כמו נפח יהיה הרבה יותר מדי גדול. מוזר, הומולוגיים עצבים שרירים שיתוף תרבות עם שני עצב ורכיבים השריר מגיע רק עכבר או חולדה אינה מתפקדת ואינה מצליחה לגרום להתכווצויות שרירים. ואולם, הומולוגיים העצבוב בין לוויין עכבר לתאי השריר ואת השדרה עכבר explants טבורי שבוצעה בהצלחה על ידי שינוי התאריך של קצירת העובר (Callizot, שטיינשניידר החוקרים, תוצאות שלא פורסמו). התקדמות נוספת בהקמת פרוטוקולים שגרתיות הומולוגיים שיתוף תרבויות עשוי לעזור להתגבר על המגבלה מינים קיימת טכניקה זו היום.
למרות מגבלות אלה, המתואר כאן שיטה המאפשרת לימוד היבטים רבים של שרירים נוירון מוטורי פיזיולוגיה, טכניקה אשר לא קשה לביצוע, אינה דורשת כל חומר מיוחד המביא חוט השדרה יציבה explants-שריר שיתוף תרבויות יכול בקלות להיות מתוחזקים ו studieד במשך חודשים רבים.
היבטים מסוימים של פרוטוקול הם בעלי חשיבות מסוימת וצריכים טיפול מיוחד על מנת להבטיח עצבוב תקין. ראשית, עוברי עכברים צריך להיות בין 13 ו 14 ED של גיל. שנית, 500,000 התאים לכל צלחת 35 מ"מ מבטיח את רמת הנכון של מפגש התא כדי להקל על הדבקות של explants שיתווספו לתאי השריר מיד לאחר איחוי תאים מתחיל. לבסוף, הדגיש גם בפרוטוקול, תוספת של המדיום לאחר ההפקדה של explants על לתאי השריר החלק הקשה ביותר של הליך זה יש לבצע בזהירות רבה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
העבודה שלנו נתמך על ידי השוויצרי הקרן הלאומית למדע (SNF), יוזמת שווייץ Systems Biology (SystemsX.ch), ניוון שרירים האגודה ארה"ב (MDA), את Francaise האגודה contre לס Myopathies (AFM), מיטוכונדריאלי הברית מחלות קרן (UMDF), Gebert-רוף קרן תכנית מחלות נדירות (פוי), החברה השוויצרית למחקר של מחלות שריר (SSEM / FSRMM), החיים השוויצרי "Jubiläumsstiftung für und Volksgesundheit medizinische Forschung", מחקר רוש קרן האוניברסיטה באזל.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| MEM | GIBCO, by Life Technologies | 31095 | |
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 31153 | |
| Fetal Bovine Serum | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 | |
| Insuline | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Human EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Human FGF | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Penicillin/streptomycin solution | GIBCO, by Life Technologies | 15140 |
References
- Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions. Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).
- Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation. J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).
- Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy. Lancet. 345, 694-695 (1995).
- Askanas, V., Engel, W. K. A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture. Neurology. 25, 58-67 (1975).
- Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro. Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).
- Lefebvre, S. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell. 80, 155-165 (1995).
- Schrank, B. Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).
- Hsieh-Li, H. M. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).
- Monani, U. R. The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).
- Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).
- Durbeej, M., Campbell, K. P. Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models. 12, 349-361 (2002).
- Schnabel, J. Neuroscience: Standard model. Nature. 454, 682-685 (2008).
- Benatar, M. Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS. Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).
- Dorchies, O. M. Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system. Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).
- McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies. Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).
