Summary
सुसंस्कृत मांसपेशी कोशिकाओं को एक अपर्याप्त मॉडल innervated मांसपेशी पुनरावृत्ति करना
Protocol
1. प्राथमिक मानव मांसपेशी सेल संस्कृति की तैयारी
- Explantation पुनः - explantation 4 तकनीक के अनुसार मानव मांसपेशी सेल संस्कृतियों की स्थापना. सबसे पहले, बायोप्सी से गैर मांसपेशियों के ऊतकों को हटा दें. फिर, प्लाज्मा, जो fibroblasts explants से उभरने के लिए अनुमति देता है की एक रक्तकण में 1 मिमी 3 मांसपेशी explants एम्बेड.
- एम्बेडेड explants एक प्लाज्मा जेलाटीन लेपित पकवान पर स्थानांतरित कर रहे हैं और उन्हें सामान्य मध्यम विकास में वृद्धि (सदस्य 25% 199 मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [FBS],% 1 पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10 इंसुलिन / μg एमएल, के साथ पूरक 10 एनजी / एमएल मानव epidermal वृद्धि कारक [EGF], 12.5 एनजी / एमएल मानव fibroblast वृद्धि कारक एक monolayer में) [FGF]. उन परिस्थितियों में explants से उभरने वाली कोशिकाओं है कि मांसपेशियों की कोशिकाओं. इन कोशिकाओं को हटाने के बाद explants की एक monolayer में बढ़ती रहेगी.
- संस्कृति सामान्य मध्यम विकास में 0.1% जिलेटिन में लिपटे प्लेटों पर aneurally कोशिकाओं. कोशिकाओं हो सकते हैंaneurally सुसंस्कृत और प्रवर्धित के रूप में की जरूरत है. 3 और 8 के बीच एक मार्ग पर सह संस्कृतियों के प्रदर्शन के लिए मांसपेशियों की कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए यह बेहतर है. यह लिए युवा myotubes अंदर आना महत्वपूर्ण है, इस बिंदु के बाद, सह संस्कृतियों में नाकाम रहने का एक उच्च जोखिम है. इसके अलावा, myotubes बहुत बड़ा है और भी मोटी नहीं होना चाहिए.
- दो दिन पहले स्फूर्तिदान की योजना बनाई है, प्लेट डिश प्रति कोशिकाओं के सामान्य विकास के माध्यम 500,000 घनत्व में 35 मिमी ऊतक संस्कृति व्यंजन (या 6 अच्छी तरह प्लेटें) पर मांसपेशियों की कोशिकाओं. कि घनत्व, कोशिकाओं उचित निम्नलिखित दिन पर संलयन शुरू confluency, और उसके बाद बाद स्फूर्तिदान दिन में कर रहे हैं. उन शर्तों का प्रयोग, myotubes इष्टतम innervation और इसलिए बाद में फाइबर के संकुचन के लिए सही स्तर पर कर रहे हैं.
- अगले दिन, एक संलयन मध्यम सदस्य की रचना 25% 199 मध्यम, 5% FBS, इंसुलिन 10 μg / एमएल और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 1% के साथ पूरक के साथ सामान्य मध्यम विकास की जगह.
2. Isolati चूहा भ्रूण स्पाइनल कॉर्ड explants की
पूरी प्रक्रिया के लिए रीढ़ की हड्डी explants अलग एक द्विनेत्री माइक्रोस्कोप के तहत किया जाता है, हांक संतुलित नमक (HbSS, / Gibco Invitrogen रेफरी 14,170) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त समाधान में.
- यह महत्वपूर्ण है चूहा भ्रूण 13 प्रवर्तन निदेशालय और 14 के बीच एक अलग विकास मंच के रूप में कर रहे हैं कि पूरी प्रक्रिया ख़तरे में डालना होगा. सीओ 2 के साथ एक गर्भवती महिला बलिदान और HbSS मध्यम में पूरे भ्रूण श्रृंखला इकट्ठा. प्रत्येक भ्रूण को अलग करने और उन्हें इच्छामृत्यु के लिए सिर काटना.
- एक टुकड़ा में शरीर के बाकी हिस्सों से काटना भ्रूण रीढ़ की हड्डी और आसपास की मांसपेशियों और संयोजी ऊतक को हटा दें. बहुत पृष्ठीय रूट (DRGs) ganglions है रीढ़ की हड्डी से जुड़ी कार्यात्मक स्फूर्तिदान सुनिश्चित रखने के लिए सावधान रहें.
- दूसरी रेखाओ को काटते हुए, आड़े तौर पर प्रत्येक रीढ़ की हड्डी में स्लाइस में एक तरीका है कि प्रत्येक explant कम से कम 2 DRG यह करने के लिए संलग्न (1 3 मिमी की explants) शामिल हैं.
- मांसपेशी सेल संस्कृति पर संलयन मध्यम निकालें, monolayer पर मध्यम ठीक एक परत छोड़.
- मांसपेशी कोशिका परत, 35 मिमी पकवान प्रति पांच समान स्थान explants पर explants ध्यान रखें.
- बहुत धीरे धीरे जोड़ें, को प्रत्येक explant पर वार, संलयन मध्यम ड्रॉप. यह मांसपेशियों की कोशिकाओं के लिए मध्यम जोड़ने के लिए जीवित आवश्यक है, लेकिन बहुत ज्यादा नहीं है explants को पहले पालन करने और कोशिकाओं के साथ संपर्क बनाने की अनुमति है. यदि मध्यम ठीक से नहीं जोड़ा जाता है (बहुत दृढ़ता से या बहुत ज्यादा मध्यम), explants नाव और मांसपेशियों की कोशिकाओं के अंदर आना असफल हो जायेगी.
- एक बार explants पालन करना शुरू करते हैं, 35 मिमी पकवान प्रति 2 मिलीलीटर संलयन मध्यम शीर्ष, और बहुत सावधानी से बर्तन इनक्यूबेटर में वापस डाल दिया.
4. Heterologous तंत्रिका पेशी सह संस्कृतियों का रखरखाव
- संलयन मध्यम सप्ताह में दो बार बदलें.
तंत्रिका वितरण के बाद के रूप में जल्द ही दो दिनों के रूप में, यह संभव है प्रत्येक explant से उभरती है और मांसपेशियों की कोशिकाओं, बटन संरचनाओं की तरह (चित्र 1) द्वारा प्रतिनिधित्व के साथ संपर्क स्थापित neurites देखना.
के रूप में जल्दी स्फूर्तिदान के बाद 4-6 दिनों के रूप में, कुछ व्यक्तिगत फाइबर अनुबंध करने के लिए शुरू कर देंगे.
संकुचन कई महीनों के लिए जारी रहती है, बस संस्कृति मध्यम सप्ताह में दो बार बदल द्वारा बनाए रखा.
के बारे में 2 सप्ताह के बाद, रीढ़ की हड्डी explant ही घिनौना, लेकिन स्फूर्तिदान संरक्षित है. यह सामान्य है. तंत्रिका घटक के ठीक एक परत मांसपेशी कोशिका परत की सतह पर रहता है. यह तंत्रिका नेटवर्क मोटर इकाई की कार्यक्षमता को बनाए रखने के लिए पर्याप्त है.
यदि explants स्फूर्तिदान के बाद मध्यम दिन में तैरने लगते हैं, वे कभी नहीं पालन करना होगा. यह तब होता है जब मांसपेशी कोशिका परत हैमिला हुआ है, नहीं पर्याप्त या मध्यम जब भी मोटे तौर पर जोड़ा जाता है. कभी कभी, explant पालन करता है लेकिन कोई neurites के सामने होगा. यह संभावना है कि यह करने के लिए संलग्न DRG की कमी के कारण है. कि के रूप में अच्छी तरह से मामले में, स्फूर्तिदान स्थापित नहीं किया जाएगा. व्यंजन पहला सप्ताह बहुत ध्यान से हेरफेर, के रूप में explants अभी भी आसानी से अलग कर सकते हैं. संलयन मीडिया का आदान - प्रदान करने के लिए, एक न्यूनतम गति के साथ तरल ड्रॉप - सेल टुकड़ी से बचने के लिए बुद्धिमान जोड़ने के लिए.
चित्रा 1 रीढ़ की हड्डी explants मांसपेशी कोशिका 1 दिन से 15 दिन के लिए सह संस्कृतियों.
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Discussion
एक शारीरिक सामान्य और रोग के संदर्भ में अध्ययन मांसपेशी कोशिका समारोह में इन विट्रो उपकरण myologists के लिए सबसे अधिक ब्याज की है, क्योंकि मांसपेशी सेल संस्कृतियों को आम तौर पर कई कोशिकाओं और सेल प्रकार के कनेक्शन के महत्व को नहीं पुनरावृत्ति करना चाहती है. मांसपेशियों की कोशिकाओं मोटर न्यूरॉन्स को शुद्ध करने के अलावा एक कार्यात्मक मोटर इकाई को प्राप्त करने के बाद श्वान कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए कुशल हो सकता है 5 स्फूर्तिदान के लिए आवश्यक है और यह topologically (3 डी + विशेष वितरण) प्रासंगिक प्रोटोकॉल नहीं है यहाँ वर्णित है के लिए पर्याप्त नहीं है सफलतापूर्वक इस्तेमाल करने के लिए इन विट्रो और एक पूरा NMJ परिपक्वता में परिणाम है कि आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है में innervated मांसपेशियों की कोशिकाओं की स्थापना.
Murine मॉडल अब कई neuromuscular बीमारियों के लिए उपलब्ध हैं. दुर्भाग्य से, इन मॉडलों के कई मानव रोगियों में रोग के लिए अनुवाद के संदर्भ में सीमित कर रहे हैं, उदाहरण के लिए रीढ़ की हड्डी में पेशी शोष के लिए माउस मॉडल डचेनपेशी dystrophy या पार्श्व काठिन्य पेशीशोषी. रीढ़ की हड्डी में पेशी शोष SMN1 जीन, जो भाग में मानव जीनोम में 6 एक दूसरे SMN जीन की उपस्थिति से कम किया जा सकता है में एक परिवर्तन के कारण होता है. इसके विपरीत, चूहों जीनोम SMN के लिए केवल एक जीन होता है, और इसकी विलोपन embryonically 7 घातक है. इस प्रकार, क्रम में माउस रीढ़ की हड्डी में पेशी शोष मॉडल विकसित करने के लिए, एक मानव नकल SMN2 कृत्रिम SMN पीटा चूहों 8,9 में पेश किया गया था. इन जानवरों को अभी भी निकटतम मानव विकृति को आनुवंशिक मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं, लेकिन उन चूहों में मनाया phenotype SMN2 जीन है कि चूहे सामान्य रूप से 10 व्यक्त नहीं की अभिव्यक्ति के कारण है. Duchenne पेशी dystrophy के मामले में, चूहों MDX एक उत्परिवर्तित dystrophin मानव रोगियों के समान जीन है, लेकिन परिणाम 11 रोगियों में मनाया लक्षण की तुलना में बहुत कम गंभीर है. सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया amyotrophi के लिए माउस मॉडलग पार्श्व काठिन्य, SOD1 चूहों, अब तक रोग तंत्र और चिकित्सकीय दृष्टिकोण 12,13 में खुलासा अंतर्दृष्टि में निराश. इसलिए, रीढ़ की हड्डी सेल explants पेशी सह संस्कृतियों समारोह का अध्ययन करने के लिए, मांसपेशियों के जीनोमिक और प्रोटिओमिक विशेषताओं रोगियों से आ रहा है, एक पूरी तरह से शारीरिक सेटिंग में, जैसे जटिल रोगों का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं. इसके अलावा इस मॉडल असमलैंगिक प्रजातियों तंत्रिकाजन्य और myogenic रोग के तंत्र के बीच भेदभाव करने में मदद करता है 3,14,15.
यहाँ प्रस्तुत सह संस्कृति भी कुछ सीमाएं हैं. उदाहरण के लिए, मांसपेशियों की कोशिकाओं के पर immunohistochemistry प्रयोगों के इस संरचना पर प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल हैं, क्योंकि explant द्वारा सन्निहित तंत्रिका टर्मिनल के postsynaptic NMJ उपकरण शामिल हैं. इस प्रणाली को भी एक एकीकृत और अपेक्षाकृत परिपक्व संस्कृति प्रणाली में neurotrophic या मायोटोनिक दवाओं के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह अनुमति नहीं उच्च throughputस्क्रीनिंग, साथ ही मात्रा तक भी बड़ा होगा. मजे की बात है, तंत्रिका पेशी मुताबिक़ दोनों तंत्रिका और मांसपेशियों घटकों माउस या चूहा से ही आने के साथ सह संस्कृति और कार्यात्मक नहीं है मांसपेशी संकुचन में परिणाम विफल रहता है. हाल ही में तथापि, माउस उपग्रह मांसपेशी कोशिकाओं और माउस रीढ़ की हड्डी explants के बीच मुताबिक़ स्फूर्तिदान सफलतापूर्वक किया गया है भ्रूण कटाई की तारीख के संशोधन (Callizot, Steinschneider और उनके सहयोगियों ने, अप्रकाशित परिणाम) के द्वारा प्रदर्शन किया. सह संस्कृतियों मुताबिक़ के लिए नियमित प्रोटोकॉल स्थापित करने में आगे प्रगति करने के लिए है कि आज इस तकनीक के लिए मौजूद प्रजातियों सीमा पर काबू पाने में मदद कर सकता है.
इन सीमाओं के बावजूद, हम यहाँ एक तरीका है कि मांसपेशियों और मोटर न्यूरॉन शरीर क्रिया विज्ञान के कई पहलुओं के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है वर्णन, एक तकनीक है जो करने के लिए प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल नहीं है, कोई विशेष और स्थिर explants पेशी सह कॉर्ड रीढ़ की हड्डी में सामग्री है कि परिणाम की आवश्यकता नहीं है संस्कृतियों है कि आसानी से बनाए रखा जा सकता है और पढ़ाईकई महीनों के लिए चाहते हैं.
प्रोटोकॉल के कुछ पहलुओं के विशेष महत्व के हैं और विशेष देखभाल की जरूरत एक उचित स्फूर्तिदान सुनिश्चित. सबसे पहले, चूहा भ्रूण उम्र के 13 और 14 के बीच प्रवर्तन निदेशालय होगा. दूसरा, 35 मिमी पकवान प्रति 500,000 कोशिकाओं सेल संगम की सही स्तर सुनिश्चित करता है कि मांसपेशियों की कोशिकाओं को तुरंत जोड़ रहे हैं जब सेल संलयन शुरू होता है explants के पालन की सुविधा. अंत में, के रूप में प्रोटोकॉल में बल दिया है, मांसपेशियों की कोशिकाओं पर explants की जमा के बाद मध्यम के अलावा इस प्रक्रिया का सबसे कठिन हिस्सा है और चरम देखभाल के साथ किया जाना चाहिए.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हमारा काम स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एसएनएफ), सिस्टम जीवविज्ञान (SystemsX.ch), पेशी Dystrophy एसोसिएशन (एमडीए) के संयुक्त राज्य अमेरिका, एसोसिएशन Française contre लेस myopathies (AFM), संयुक्त Mitochondrial रोग फाउंडेशन में स्विस पहल द्वारा समर्थित है (UMDF), फाउंडेशन Gebert - RUF दुर्लभ रोगों (GRF) के कार्यक्रम, स्नायु रोग (सूचना / SSEM FSRMM), स्विस जीवन Jubiläumsstiftung फर Volksgesundheit und Medizinische Forschung, रॉश रिसर्च फाउंडेशन और विश्वविद्यालय के अनुसंधान के लिए स्विस सोसायटी बास्ले.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| MEM | GIBCO, by Life Technologies | 31095 | |
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 31153 | |
| Fetal Bovine Serum | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 | |
| Insuline | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Human EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Human FGF | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Penicillin/streptomycin solution | GIBCO, by Life Technologies | 15140 |
References
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