Summary
교양 근육 세포 innervated 근육을 요점을 되풀이하는 불충 분한 모델입니다
Abstract
신경 구성 요소의 부재에서, 세포 분화가 제한되며 모터 신경 세포의 자극 1가 누락되어 자연스럽게 있기 때문에 인간의 기본 근육 세포 단일층에 aneurally 드물게 계약을 배양해. 이러한 제한은 교양 근육 세포에있는 많은 신경근육학 질병의 체외 연구를 방해. 중요한 monolayered, 교양 근육 세포의 실험적 제약이 공동 문화권에서 척수의 explants있는 myofibers의 기능 innervation에 의해 극복할 수있다.
여기서는 Askanas이 개발한 방법에 따라 차별화 및 섬유 수축을 완료하는 데 선도적인, 인간의 기본 근육 세포의 효율적이고 적절한 innervation을 달성하는 데 필요한 여러 단계를 보여줍니다. 이렇게하려면, 근육 세포는 여전히 척수의 조각에 부착된 지느러미 루트 신경으로 ED 13.5에서 쥐의 배아의 척수의 explants와 공동 배양해 있습니다. 며칠 후, 근육이 좋bers 계약에 시작하고 결국 근육 세포에 연결되는 척수의 explants에서 돌출 기능 neurites 의해 innervation을 통해 교차 줄무늬가된다. 이 구조는 단순히 문화 매체의 정기 교류에 의해, 많은 달 동안 유지하실 수 있습니다.
그것이 인간의 근육 발달과 innervation의 종합 분석을위한 기능적인 모델을 대표로 귀중한 도구의 응용 프로그램은 다수 있습니다. 사실, 완벽한 드 노보 신경근육학 접합 설치 기본 및 생리적 컨텍스트의 각 단계에서 여러 매개 변수를 쉽게 측정을 수 있도록 문화 접시에 발생합니다.
몇 가지 예제, 게놈 및 / 또는 proteomic 연구를 인용하는 것은 공동의 문화에서 직접 수행할 수 있습니다. 두 구성 요소가 서로 다른 종에서 온 있기 때문에 또한, 사전 및 사후 시냅스 효과는 특별히 별도로, 신경근육학 교차점에서 평가 수쥐, 인간, 각각. 신경 근육의 공동 문화는 또한 근육이나 신경근육학 질병 3 앓고 환자 격리 인간의 근육 세포를 수행할 수 있으며, 따라서 후보 의약품에 대한 선별 도구로 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 특별한 장비가 있지만 일반 BSL2 시설은 문화 접시에있는 기능적인 운동 단위를 재현하는 데 필요하지 않습니다. 이 방법은 따라서 정상과 질병 맥락에서, 근육뿐만 아니라 신경근육학 기능의 생리적 및 기계론의 연구 신경근육학 연구 지역 사회 모두에 유용합니다.
Protocol
1. 기본 인간 근육 세포 배양의 준비
- explantation - 다시 explantation 기법 넷에 따르면 인간의 근육 세포 배양을 마련한다. 첫째, biopsies에서가 아닌 근육 조직을 제거합니다. 그런 다음, 섬유아 세포가 explants에서 나타날 수있는 플라즈마의 coagulum에 1mm 3 근육 explants를 포함.
- 임베디드 explants는 플라즈마-젤라틴 코팅 접시에 옮겨주고 (MEM 10 % 태아 소 혈청 [FBS], 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 10 μg / ML 인슐린, 25 %의 중간 199, 함께 보완 정상적인 성장 매체로 성장하게됩니다 10 NG / ML 인간 표피 성장 인자 [EGF], 12.5 NG / ML 인간 fibroblast의 성장 인자 단일층의 [FGF]). 이러한 조건 하에서 explants 반발 세포는 근육 세포입니다. 이러한 세포는 explants이 제거된 후에도 단일층 성장 나갈 것입니다.
- 문화 aneurally 정상적인 성장 매체의 0.1 % 젤라틴 코팅 접시에있는 세포. 세포가 될 수 있습니다aneurally 배양해하고, 필요에 따라 증폭. 그것은 공동 문화권을 수행하기 위해 3와 8 사이 통로에서 근육 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 그것은 젊은 myotubes에 신경을 분포시키다 것이 중요하다,이 시점 이후, 공동 문화는 실패의 위험이 있습니다. 또한, myotubes 너무 크고 너무 두꺼운가 없습니다.
- innervation이 계획되어 이틀 전, 플레이트 정상적인 성장 매체에 요리 당 500,000 세포 밀도에서 35mm 조직 문화 요리 (또는 6 잘 접시)에서 근육 세포. 그 농도에서 세포 그 이후는 다음날 융합을 시작할 적절한 confluency 및 후속 innervation 날에입니다. 이러한 조건을 사용하여 myotubes는 최적의 innervation시키고 그럼으로써 이후 섬유 수축에 맞는 단계에 있습니다.
- 다음 날, 25 %의 중간 199 5 % FBS, 10 μg / ML 인슐린과 페니실린 / 스트렙토 마이신의 1 %로 보충 MEM 구성된 융합 미디어로 정상 성장 매체를 교체하십시오.
2. Isolati 쥐 배아 척수의 Explants의에
척수의 explants를 분리하기위한 모든 절차는 10% 태아 소 혈청 (FBS)을 포함하는 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS, Gibco / Invitrogen 심판 14,170)에, 쌍안 현미경으로 수행됩니다.
- 이것은 쥐의 배아가 다른 개발 단계로 ED 13 층과 14 층 사이에 있다고하는 것은 전체 과정을 위태롭게 할 것이 매우 중요합니다. CO 2와 임신 여성을 희생하고 HBSS 매체 전체 배아 체인을 수집합니다. 각각의 배아를 분리하고 안락사를 위해 목을 벨.
- 한 조각의 신체의 나머지 부분에서 배아 척수를 해부하며 주위의 근육과 결합 조직을 제거하십시오. 기능성 innervation을 보장하기 위해 척수에 연결된 지느러미 루트 ganglions (DRGs)를 유지하는 데 매우주의하십시오.
- 각 explant는 최소한 2 DRG (1mm 3 explants) 그것에 첨부를 포함하는 방식으로 transversally 각 척수를 썰어.
- 단일층에 매체의 벌금 레이어를두고, 근육 세포 배양에 융합 매체를 제거합니다.
- 근육 세포 층, 35 밀리미터 접시 당 다섯 균등하게 게재 explants에 신중 explants를 놓습니다.
- 매우 느리게 추가, 각 explant에 현명, 퓨전 미디어를 놓습니다. 그것은 explants 먼저 준수하고 세포와 접촉을하도록 너무 많은 살아남기 위해 근육 세포에 대한 매체를 추가할 필요가 있지만, 아니다. 매체가 제대로 (너무 강하게 또는 너무 많은 매체)에 추가되지 않은 경우 explants는 역부족되며 근육 세포를 신경을 분포시키다되지 않습니다.
- explants가 준수하기 시작하면, 35 밀리미터 접시 당 2 ML로 융합 미디어를 위로하고, 인큐베이터에 다시주의 깊게 요리를하다.
4. Heterologous 신경 근육의 공동 문화의 유지 보수
- 일주일에 두 번 융합 미디어를 변경합니다.
즉시 이일로 innervation 후, 그것은 각 explant에서 신흥 및 버튼과 같은 구조 (그림 1)로 표시 근육 세포와 연락처를 확립 neurites을 볼 수 있습니다.
이르면 innervation 후 4-6일로서, 몇 가지 개별 섬유 계약에 시작됩니다.
수축이 단순히 일주일에 두 번 배지를 변경하여 유지, 여러 달 동안 유지됩니다.
약 2 주가 지난 후, 척수의 explant 자체는 썩어빠진지만 innervation이 보존되어있다. 이것은 정상입니다. 신경 구성 요소의 벌금 레이어 근육 세포 레이어의 표면에 유지됩니다. 이 신경 네트워크는 모터 장치의 기능을 유지하는 데 충분합니다.
explants이 innervation 후 매체를 하루에 떠있다면, 그들은 준수하지 않습니다. 근육 세포 계층이 때 발생충분히 합류, 또는 경우 매체 아니라도 대략 추가됩니다. 때로 explant을 준수합니다 그런데 neurites가 등장할 것입니다. 이것은 가능성이 그것에 첨부 DRG의 부족 때문입니다. 물론이 경우, innervation을 설정할 수 없습니다. explants 여전히 쉽게 분리 수 있으므로, 첫째 주에 매우 신중하게 요리를 조작. 융합 미디어를 교환하려면, 셀 부대를 피하기 위해 최소한의 속도로 액체 드롭 현명한를 추가합니다.
그림 1. 척수 explants - 근육 세포 일 ~ 15 일 1에서 공동의 문화.
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Discussion
근육 세포 배양은 보통 여러 셀 및 셀 타입의 연결의 중요성을 요점을 되풀이하지 않기 때문에 정상과 병리 학적 맥락에서 근육 세포 기능을 연구하는 생리학의 체외 도구, myologists에 대한 높은 관심이다. 근육 세포에 모터 뉴런을 정화의 첨가 Schwann 세포의 존재는 5 개의 효율적이 될 innervation 필요하고 관련 프로토콜이 여기에 설명된 (3D + 특수 유통) topologically하지 않았습니다이기 때문에 기능적인 운동 단위를 달성하는 것만으로는 충분하지 않습니다 시험 관내 쉽게 평가 할 수있는 완벽한 NMJ의 성숙의 결과에 innervated 근육 세포를 확립하는 데 성공적으로 사용되었습니다.
Murine 모델은 많은 신경근육학 질환 이제 사용할 수 있습니다. 불행히도, 이러한 모델의 대부분은 예를 들면 척수 근육 위축증에 대한 마우스 모델, Duchenne는 인간 환자의 질병에 번역의 측면에서 제한됩니다근육 영양 장애 또는 루게릭병. 척수 근육 위축증은 부분적으로 인간 게놈 6의 두 번째 SMN 유전자의 존재에 의해 해결할 수 있습니다 SMN1 유전자의 돌연변이로 인해 발생합니다. 반대로 쥐 게놈은 SMN위한 하나의 유전자를 포함하며, 삭제는 7 embryonically 치명적이다. 따라서, 마우스 척수 근육 위축증 모델을 개발하기 위해, 인간 SMN2 복사본은 인공적 Smn 녹아웃 마우스 8,9에 소개되었습니다. 이러한 동물은 여전히 인간의 병리에 가장 가까운 유전자 모델을 대표하지만, 그 생쥐에서 관찰 표현형 쥐가 평소 10을 표현하지 않는 것이 SMN2 유전자의 표현 때문이다. Duchenne 근육 퇴행 위축의 경우에는 MDX 마우스는 인간의 환자와 비슷한 변이된 dystrophin 유전자가 있지만, 결과는 환자 11 관찰 증상에 비해 훨씬 덜 심각합니다. amyotrophi을위한 가장 널리 사용되는 마우스 모델C 측방 경화증, SOD1 마우스는 지금까지 질병 메커니즘과 치료 접근 12,13에 의미 심장한 통찰력 실망. 따라서 척수 explants - 근육 세포 공동 배양, 환자에서 오는 근육의 게놈 및 proteomic 특성 함수를 공부할 수 있도록 완전히 생리적 환경에서 이러한 복잡한 질병을 연구하기위한 귀중한 도구를 나타냅니다. 또한 본 이종 종 모델은 neurogenic 및 myogenic 병리 학적 메커니즘을 구별하는 데 도움이됩니다. 3,14,15
여기에 제시된 공동 문화는 또한 몇 가지 제약 사항들이있다. explant에 의해 구체화 신경 터미널 postsynaptic NMJ 장치를 다루고 있기 때문에 예를 들어, 근육 세포에 immunohistochemistry 실험,이 구조에서 수행하기가 어렵습니다. 이 시스템은 또한 통합과 상대적으로 성숙한 문화 시스템에서 약물의 neurotrophic 또는 myotonic 효과를 파악하기 위해 사용될 수 있지만, 그것은 허용하지 않습니다 높은 처리량심사는 볼륨이 너무 클 것이기 때문입니다. 호기심, 동종 신경 근육 신경 및 근육의 구성 요소가 모두 전용 마우 스나 쥐에서 오는가있는 공동 문화 기능 아니며, 근육의 수축을 초래하는 데 실패합니다. 최근에는 그러나, 마우스 위성 근육 세포와 마우스 척수의 explants 간의 동종 innervation이 성공적으로 배아 수확의 날짜 수정 (Callizot, Steinschneider 및 동료, 게시되지 않은 결과)에 의해 수행되었습니다. 동종은 공동의 문화에 대한 일상적인 프로토콜을 수립에 더 이상 진전 오늘이 기술을 위해 존재 종의 한계를 극복하는 데 도움이 있습니다.
이러한 제한에도 불구하고, 우리는 여기에 근육과 운동 신경 세포 생리학의 여러 측면의 연구를 가능하게하는 방법을 설명합니다; 수행하기 어렵지 않습니다 기술은 안정적인 척수 explants - 근육의 공동에있는 특수 재료와 그 결과를 필요로하지 않습니다 쉽게 유지 수있는 문화와 studie몇 개월 라.
프로토콜의 특정 측면이 특히 중요하며 적절한 innervation을 보장하기 위해 특별한주의가 필요합니다. 첫째, 쥐의 배아 나이는 13 사이 및 14 ED 있어야합니다. 둘째, 35 mm 접시 당 500,000 세포는 세포 융합이 시작 즉시 때 근육 세포에 추가됩니다 explants의 준수를 촉진하기 위해 셀 합류의 정확한 수준을 보장합니다. 마지막으로, 같은 프로토콜에 강조, 근육 세포에 explants의 입금 후 매체의 또한이 절차의 가장 어려운 부분이며, 극단주의 수행해야합니다.
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
우리의 작품은 스위스 국립 과학 재단 (SNF), 시스템 생물학 (SystemsX.ch), 근육질 영양 장애 협회 미국 (MDA), 협회 테크 프랑세즈 contre 레 Myopathies (AFM), 미국 Mitochondrial 질병 재단에서 스위스의 이니셔티브에 의해 지원됩니다 (UMDF), Gebert-RUF 재단 희귀 질병 프로그램 (GRF), 근육 질환 (SSEM / FSRMM), 스위스 생활 "Jubiläumsstiftung FÜR Volksgesundheit 깨물어 medizinische Forschung", 로슈 학술 진흥 재단과 대학의 연구에 대한 스위스의 학회 바젤의.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| MEM | GIBCO, by Life Technologies | 31095 | |
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 31153 | |
| Fetal Bovine Serum | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 | |
| Insuline | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Human EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Human FGF | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Penicillin/streptomycin solution | GIBCO, by Life Technologies | 15140 |
References
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