En funksjonell Motor Unit i Kultur Dish: Co-kulturen av ryggmarg explants og muskelceller

Summary

Dyrkede muskelceller er en utilstrekkelig modell å rekapitulere innerverte muskler

Abstract

Humane primære muskelceller dyrket aneurally i monolayer sjelden kontrakt spontant fordi, i fravær av en nerve komponent, er celledifferensiering begrenset og motoriske nevroner stimulering mangler ^en. Disse begrensningene hemme in vitro studie av mange nevromuskulære sykdommer i dyrkede muskelceller. Viktigere, kan de eksperimentelle begrensninger av monolayered, kulturperler muskelceller overvinnes ved funksjonell innervasjon av myofibers med ryggmargsskader explants i co-kulturer.

Her viser vi de ulike trinnene som kreves for å oppnå en effektiv, riktig innervasjon av menneskelige primære muskelceller, som fører til fullføre differensiering og fiber sammentrekning i henhold til metoden utviklet av Askanas ^to. For å gjøre dette, er muskelceller samtidig kultiveres med ryggmargsskader explants av rotte embryoer ved ED 13.5, med den dorsal root ryggmargen fortsatt festet til ryggmargen skiver. Etter noen dager, muskel fimedlemmer begynner å avtale og til slutt bli cross-tverrstripet gjennom innervasjon av funksjonelle neurites utstikkende fra ryggmargen explants som forbinder til muskelcellene. Denne strukturen kan opprettholdes i mange måneder, ganske enkelt ved regelmessig utveksling av kulturen medium.

De anvendelser av denne uvurderlig verktøy er mange, som det representerer en funksjonell modell for tverrfaglige analyser av menneskelig muskel utvikling og innervasjon. Faktisk skjer det en fullstendig de novo nevromuskulære krysset installasjon i en kultur tallerken, slik at en enkel måling av mange parametere på hvert trinn, i en grunnleggende og fysiologisk sammenheng.

Bare for å nevne noen eksempler, genomisk og / eller proteomikk studier kan utføres direkte på co-kulturer. Videre kan pre-og postsynaptiske effekter spesifikt og separat vurdert ved nevromuskulære krysset, fordi begge komponentene kommer fra forskjellige arter,rotte og menneske, henholdsvis. Nerve-muskel co-kulturen kan også utføres med menneskelige muskelceller isolert fra pasienter som lider av muskel eller nevromuskulære sykdommer ^3, og dermed kan brukes som et screeningverktøy for kandidat narkotika. Til slutt er det ikke spesielt utstyr, men en vanlig BSL2 anlegg trengs for å reprodusere en funksjonell motorenheten i en kultur tallerken. Denne metoden er derfor verdifullt for både muskel samt nevromuskulære forskningsmiljøene for fysiologiske og mekanistisk studier av nevromuskulær funksjon, i en normal og sykdom sammenheng.

Protocol

1. Klargjøring av primære humane muskelcellen Kultur

1. Etablere de menneskelige muskel cellekulturer ifølge Forklaring-re-Forklaring teknikk ^4. Først fjerner ikke-muskel vev fra biopsier. Deretter legge 1 mm ³ muskel explants i en coagulum av plasma, som gjør at fibroblaster å komme fra explants.
2. De innebygde explants blir overført til en plasma-gelatin belagt fatet og la dem vokse i normal vekst medium (MEM supplert med 25% medium 199, 10% fosterets bovint serum [FBS], 1% penicillin / streptomycin, 10 mikrogram / ml insulin, 10 ng / ml human epidermal vekstfaktor [EGF], 12,5 ng / ml humant fibroblast vekstfaktor [FGF]) i en monolayer. Cellene som fremkommer fra de explants under disse forholdene er muskelceller. Disse cellene vil fortsette å vokse i en monolayer etter fjerning av explants.
3. Kultur cellene aneurally på 0,1% gelatin-belagte plater i normal vekst medium. Cellene kan væreaneurally kultiveres og forsterkes etter behov. Det er bedre å bruke muskelcellene ved en passasje mellom 3 og 8 for å utføre de øvrige kulturer. Det er viktig å innervate unge myotubes; etter dette punktet, de øvrige kulturer har en høy risiko for sviktende. Videre bør myotubes ikke være for stort og for tykke.
4. To dager før innervasjon er planlagt, plate muskelcellene på 35 mm vevskulturstudier retter (eller 6 og plater) på en tetthet på 500.000 celler per fat i normal vekst medium. På den tetthet, cellene er på riktig confluency å starte fusjon påfølgende dag, og påfølgende innervasjon dagen etter det. Ved hjelp av disse forholdene, de myotubes er på rett tidspunkt for optimal innervasjon og dermed påfølgende fiber sammentrekning.
5. På den neste dagen, erstatte normal vekst medium med en sammensmelting medium består av MEM supplert med 25% medium 199, 5% FBS, 10 mikrogram / ml insulin og 1% av penicillin / streptomycin.

2. Isolati på av Rat Embryonale ryggmarg explants

Hele prosedyren for å isolere de ryggmarg explants er utført under en kikkert mikroskop, i Hank Balanced Salt Solution (HBSS, Gibco / Invitrogen ref 14170) inneholder 10% fostermedisin Bovine Serum (FBS).

1. Det er avgjørende at rotta embryoene er mellom ED 13 og 14 som et annet utviklingstrinn ville undergrave hele prosedyren. Ofre en gravid kvinne med CO ₂ og samle hele embryoet kjeden i HBSS medium. Isoler hvert embryo og halshugge dem for aktiv dødshjelp.
2. Dissekere embryoet ryggmargen fra resten av kroppen i ett stykke og ta omkringliggende muskel-og bindevev. Vær svært nøye med å holde dorsal root ganglions (DRGs) knyttet til ryggmargen for å sikre funksjonelle innervasjon.
3. Skjær hver ryggmarg tvers på en måte at hver eksplantering inneholder minst to DRG knyttet til det (explants på 1 mm ^3).

ove_title "> 3. innervasjon av menneskelig muskel cellene med Embryonale Rat ryggmarg explants

1. Fjern fusjon medium på muskel cellekultur, etterlot et fint lag av medium på monolayer.
2. Plasser explants nøye på muskel celle laget, fem jevnt fordelt explants per 35 mm parabolen.
3. Legg veldig sakte, slipp klok, fusion medium på hver eksplantering. Det er nødvendig å legge medium for muskelcellene til å overleve, men ikke for mye å la explants å overholde første og ta kontakt med cellene. Hvis mediet ikke er lagt riktig (for sterkt eller for mye medium), vil explants flyte, og vil ikke innervate muskelcellene.
4. Når explants begynner å feste seg, toppe fusjon medium til 2 ml per 35 mm tallerken, og legg rettene svært forsiktig tilbake i inkubatoren.

4. Vedlikehold av heterologe Nerve-muskel Co-kulturer

1. Endre fusjon medium ganger i uken.

_title "> 5. Representative Resultater

Så snart to dager etter innervasjon, er det mulig å se neurites fremvoksende fra hver eksplantering og etablere kontakter med muskelcellene, representert ved knapp-lignende strukturer (Fig 1).

Så tidlig som 4-6 dager etter innervasjon, vil noen få individuelle fibrene begynner å kontrakt.

Riene vedvare i mange måneder, opprettholdes bare ved å endre kulturen medium ganger i uken.

Etter ca 2 uker, utarter ryggmargen eksplantering selv, men innervasjon er bevart. Dette er normalt. Et fint lag av nerve komponent forblir på overflaten av muskel celle laget. Dette nervøs nettverket er tilstrekkelig til å opprettholde funksjonaliteten av motorenheten.

Hvis explants flyte på mellomlang dagen etter innervasjon, vil de aldri overholde. Dette skjer når muskelcellen laget erikke tilstrekkelig konfluent, eller når mediet er lagt altfor grovt. Noen ganger vil de eksplantering fester, men ingen neurites dukke opp. Dette skyldes sannsynligvis manglende DRG knyttet til den. I så tilfellet også vil innervasjon ikke bli etablert. Manipulere rettene svært forsiktig den første uken, da explants kan fortsatt ta lett. Å bytte fusion media, legger væsken drop-messig med en minimal hastighet for å unngå celle løsner.

Figur 1. Ryggmargen explants-muskelcelle co-kulturer fra dag 1 til dag 15.

Discussion

En fysiologisk in vitro verktøy for å studere muskel celle funksjon i normal og patologisk sammenheng er av høyeste interesse for myologists, fordi muskel cellekulturer vanligvis ikke rekapitulere viktigheten av flere celler og celle-type forbindelser. Tilsetning av renset motoriske nerveceller til muskelcellene er ikke nok til å oppnå en funksjonell motorenheten siden tilstedeværelse av Schwann celler er nødvendig for innervasjon å være effektiv ^fem og det er ikke topologisk (3D + spesiell distribusjon) relevant Protokollen er beskrevet her har blitt brukt med hell til å etablere innerverte muskelceller in vitro og resulterer i en fullstendig NMJ modning som lett kan vurderes.

Murint modeller er nå tilgjengelig for mange nevromuskulære sykdommer. Dessverre er mange av disse modellene begrenset når det gjelder oversettelse til sykdommen hos mennesker, for eksempel de musemodeller for spinal muskelatrofi, Duchennemuskeldystrofi eller amyotrofisk lateral sklerose. Spinal muskelatrofi er forårsaket av en mutasjon i genet SMN1, som delvis kan reduseres ved tilstedeværelsen av et sekund SMN gen i det menneskelige genom ^6. I kontrast, inneholder mus genomet bare ett gen for SMN, og dens sletting er embryonically dødelig ^7. Derfor, for å utvikle mus Spinal muskelatrofi modeller, ble en menneskelig SMN2 kopi kunstig introdusert i SMN knockout mus ^8,9. Disse dyrene utgjør fortsatt den nærmeste genetiske modellen til den menneskelige patologi, men fenotypen observert i de musene skyldes uttrykk for en SMN2 genet som mus normalt ikke uttrykker ^10. I tilfelle av Duchenne muskeldystrofi, MDX mus har en mutert dystrophin gen ligner menneskelige pasienter, men utfallet er mye mindre alvorlig forhold til symptomene observert hos pasienter ^11. Den mest brukte mus modell for amyotrophic lateral sklerose, de SOD1 mus, så langt skuffet i avslørende innsikt i sykdomsmekanismer og terapeutiske tilnærminger ^12,13. Derfor ryggmargen explants-muskelcelle co-kulturer for å studere funksjonen, genomisk og proteomikk kjennetegn ved muskel kommer fra pasienter, i en fullstendig fysiologisk innstilling, representerer en uvurderlig verktøy for å studere slike komplekse sykdommer. Videre denne hetero-arter modell bidrar til å diskriminere mellom nevrogene og myogenic patologiske mekanismer. ^3,14,15

Den co-kulturen presentert her har også noen begrensninger. For eksempel, immunhistokjemi eksperimenter på muskelcellene er vanskelige å utføre på denne strukturen, fordi nerve terminalen utformes av den eksplantering dekker postsynaptisk NMJ apparat. Dette systemet kan også brukes til å vurdere neurotrophic eller myotonic effekter av narkotika i en integrert og relativt moden kultur system, men det tillater ikke high-throughputscreening, som volumet ville bli altfor stor. Merkelig, det homologe nerve-muskel co-kultur med både nerve og muskel komponenter kommer kun fra mus eller rotte er ikke funksjonell og unnlater å resultere i muskelsammentrekninger. Nylig har imidlertid homolog innervasjon mellom mus satellitt muskelceller og mus ryggmarg explants blitt utført ved modifisering av datoen for embryoet høsting (Callizot, Steinschneider og kolleger, upubliserte resultater). Videre fremdrift i etablering av rutinemessige protokoller for homolog co-kulturer kan bidra til å overvinne den arten begrensning som eksisterer for denne teknikken i dag.

Til tross for disse begrensningene, beskriver vi her en metode som gjør det mulig å studere mange aspekter av muskel-og motoriske nevroner fysiologi, en teknikk som ikke er vanskelig å utføre, krever ikke noen spesiell materiell og at resultatene i stallen ryggmargen explants-muskel co- kulturer som lett kan opprettholdes og Studied i mange måneder.

Visse aspekter av protokollen er av særlig betydning og trenger spesiell omsorg for å sikre en forsvarlig innervasjon. Først rotta embryoene må være mellom 13 og 14 ED alder. Second, sikrer 500.000 celler per 35-mm rett riktig nivå av celle samløpet å lette etterlevelse av explants som er lagt til muskelcellene umiddelbart når cellen fusjon starter. Til slutt, som fremhevet i protokollen, er tillegg av mediet etter deponeringen av explants på muskelcellene den vanskeligste delen av denne prosedyren og skal utføres med ekstrem varsomhet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	GIBCO, by Life Technologies	14170
MEM	GIBCO, by Life Technologies	31095
Medium 199	GIBCO, by Life Technologies	31153
Fetal Bovine Serum	Fetal Clone Perbio	SH30066.03
Insuline	Sigma-Aldrich	I9278
Human EGF	Sigma-Aldrich	E9644
Human FGF	Sigma-Aldrich	F0291
Penicillin/streptomycin solution	GIBCO, by Life Technologies	15140