Summary
Las células cultivadas del músculo son un modelo inadecuado para recapitular músculo inervado
Abstract
Las células musculares primarias cultivaron en monocapa aneurally raramente contraen espontáneamente porque, en ausencia de un componente de nervio, la diferenciación celular y el motor se limita la estimulación de neuronas que falta 1. Estas limitaciones dificultan el estudio in vitro en el de muchas enfermedades neuromusculares en las células musculares cultivadas. Es importante destacar que las limitaciones experimentales de células monocapa, músculo cultivadas pueden ser superados por la inervación funcional de miofibras con explantes de médula espinal en co-cultivos.
Aquí, se muestran los diferentes pasos necesarios para lograr una inervación eficiente, adecuada de las células musculares primarios, que conduce a completar la diferenciación y la contracción de fibra de acuerdo con el método desarrollado por Askanas 2. Para ello, las células musculares son co-cultivadas con explantes de la médula espinal de embriones de rata en el ED 13,5, con los ganglios de la raíz dorsal todavía unido a las rebanadas de la médula espinal. Después de unos días, el músculo fibros comenzará a contraerse y, eventualmente, convertirse en la cruz-estriado a través de inervación por neuritas funcionales que se proyectan desde los explantes de la médula espinal que se conectan a las células musculares. Esta estructura puede mantenerse durante muchos meses, simplemente por intercambio regular del medio de cultivo.
Las aplicaciones de esta herramienta de valor incalculable son numerosas, ya que representa un modelo funcional para realizar análisis multidisciplinarios de desarrollo de los músculos humanos y la inervación. De hecho, una completa instalación de novo unión neuromuscular se produce en un plato de cultivo, permitiendo una fácil medición de muchos parámetros en cada paso, en un contexto fundamental y fisiológicas.
Sólo para citar algunos ejemplos, genómica y / o estudios de proteómica se puede realizar directamente en la co-culturas. Además, los efectos de pre y post-sináptica puede ser específica y se evaluó por separado en la unión neuromuscular, debido a que ambos componentes provienen de diferentes especies,rata y humano, respectivamente. El nervio-músculo co-cultivo también puede realizarse con células musculares humanas aisladas de pacientes que sufren de enfermedades neuromusculares músculo o 3, y por lo tanto puede ser utilizado como una herramienta de detección para los fármacos candidatos. Finalmente, ningún equipo especial, pero una instalación normal BSL2 se necesita para reproducir una unidad de motor funcional en una placa de cultivo. Este método, por lo que es valioso tanto para el músculo, así como las comunidades de investigación neuromusculares para estudios fisiológicos y mecanicista de la función neuromuscular, en un contexto normal y la enfermedad.
Protocol
1. Preparación de la primaria la cultura humana de la célula muscular
- Establecer los cultivos de músculo de células humanas de acuerdo con la técnica de re-explantación-4 explantación. En primer lugar, eliminar los no-tejido muscular de las biopsias. A continuación, incorporar 1 mm 3 explantes de músculo en un coágulo de plasma, lo que permite salir de los fibroblastos para los explantes.
- Los explantes incrustadas se transfieren a un plato recubierto de plasma gelatina y dejarlas crecer en medio de crecimiento normal (MEM suplementado con 25% medio 199, 10% de suero fetal bovino [FBS], 1% de penicilina / estreptomicina, 10 mg / ml de insulina, 10 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico humano [EGF], 12,5 ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos humanos [FGF]) en una monocapa. Las células que surgen de los explantes bajo esas condiciones son las células musculares. Estas células continuará creciendo en una monocapa después de la eliminación de los explantes.
- Cultivar las células aneurally en gelatina al 0,1% recubiertos con placas en medio de crecimiento normal. Las células pueden seraneurally cultivaron y se amplifica cuando sea necesario. Es mejor utilizar células del músculo en un paso entre 3 y 8 para realizar los co-cultivos. Es de suma importancia para inervar miotubos jóvenes, después de este punto, los co-cultivos tienen un alto riesgo de fracasar. Además, miotubos no debe ser demasiado grande y demasiado grueso.
- Dos días antes de la inervación está previsto, la placa de las células musculares en placas de 35 mm de cultivo de tejidos (o placas de 6 pocillos) a una densidad de 500.000 células por placa en medio de crecimiento normal. En ese densidad, las células están en la confluencia adecuado para iniciar la fusión en el día siguiente, y la inervación posterior del día después. Utilizando esas condiciones, los miotubos se encuentran en la etapa correcta de la inervación y la contracción de la fibra óptima, por tanto posterior.
- Al día siguiente, reemplazar el medio de crecimiento normal con un medio de fusión compuesta de MEM suplementado con 25% medio 199, 5% de FBS, insulina 10 ug / ml y 1% de penicilina / estreptomicina.
2. Isolati el de la rata explantes embrionarias de la médula espinal
Todo el procedimiento para aislar los explantes de médula espinal se realiza bajo un microscopio binocular, en solución salina equilibrada de Hank (HBSS, Gibco / Invitrogen ref 14170) que contiene 10% suero bovino fetal (FBS).
- Es crucial que los embriones de rata se encuentran entre 13 y 14 de la disfunción eréctil como una etapa de desarrollo diferente pondría en peligro todo el procedimiento. El sacrificio de una mujer embarazada de CO 2 y recoger toda la cadena de embriones en un medio de HBSS. Aislar cada embrión y decapitar a favor de la eutanasia.
- Disecar el cordón espinal de embriones desde el resto del cuerpo de una sola pieza y quitar músculo que rodea y tejido conectivo. Tenga mucho cuidado de mantener los ganglios de raíz dorsal (GRD) conectados a la médula espinal para garantizar la inervación funcional.
- Corte cada médula espinal transversalmente de manera que cada explante contiene al menos 2 DRG unido a él (explantes de 1 mm 3).
- Eliminar el medio de fusión en el cultivo de células del músculo, dejando una fina capa de medio sobre la monocapa.
- Coloque los explantes con cuidado en la capa de células musculares, cinco explantes uniformemente espaciados por placa de 35 mm.
- Añadir muy lentamente, gota a medio sabio, la fusión en cada explante. Es necesario añadir medio para las células musculares para sobrevivir, pero no demasiado para permitir que los explantes de adherirse primero y hacer contacto con las células. Si el medio no se agrega correctamente (demasiado fuerte o demasiado medio), los explantes se flotará y no podrá inervan las células musculares.
- Una vez que los explantes de empezar a cumplir, arriba del medio de la fusión de 2 ml por placa de 35 mm, y poner los platos con mucho cuidado de nuevo en la incubadora.
4. El mantenimiento de los heterólogos nervio-músculo Co-culturas
- Cambiar el medio de la fusión dos veces por semana.
Tan pronto como dos días después de la inervación, es posible ver las neuritas que salen de cada explante y establecer contactos con las células musculares, representadas por las estructuras como botón-(Fig. 1).
Ya en 4-6 días después de la inervación, unos pocos fibras individuales comenzará a contraerse.
Las contracciones persistir durante muchos meses, mantiene simplemente cambiando el medio de cultivo dos veces a la semana.
Después de aproximadamente 2 semanas, el explante de la médula espinal se degenera, pero la inervación se conserva. Esto es normal. Una fina capa de componente nervio queda en la superficie de la capa de células del músculo. Esta red nervioso es suficiente para mantener la funcionalidad de la unidad de motor.
Si los explantes flotar en el medio el día después de inervación, nunca se adherirá. Esto ocurre cuando la capa de células del músculo esno suficientemente confluente, o cuando el medio se añade demasiado áspero. A veces, los explantes se adhiere, pero no saldrá neuritas. Esto es probablemente debido a la falta de DRG adjunto a la misma. En este caso también, la inervación no se establecerá. Manipular los platos con mucho cuidado la primera semana, ya que los explantes todavía se puede separar fácilmente. Para intercambiar los medios de fusión, añadir el líquido gota a gota con una velocidad mínima para evitar el desprendimiento de células.
Figura 1. De la médula espinal, las células musculares explantes co-cultivos a partir del día 1 al día 15.
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Discussion
Una herramienta fisiológica in vitro para estudiar la función de las células musculares en el contexto normal y lo patológico es de mayor interés para los myologists, debido a cultivos de células musculares no suelen recapitular la importancia de las células y las conexiones múltiples de tipo celular. La adición de las neuronas motoras purificadas a las células musculares no es suficiente para lograr una unidad de motor funcional ya que la presencia de células de Schwann se requiere para la inervación para ser eficaz 5 y no es topológicamente (3D + distribución especial) pertinente El protocolo descrito aquí ha ha utilizado con éxito para establecer las células musculares inervados in vitro y los resultados en una completa maduración NMJ que pueden ser fácilmente evaluados.
Los modelos murinos están ahora disponibles para muchas de las enfermedades neuromusculares. Por desgracia, muchos de estos modelos son limitados en términos de la traducción a la enfermedad en pacientes humanos, por ejemplo los modelos de ratón para la atrofia muscular espinal, de DuchenneLa distrofia muscular o esclerosis lateral amiotrófica. La atrofia muscular espinal es causada por una mutación en el gen SMN1, que en parte puede ser mitigado por la presencia de un segundo gen SMN en el genoma humano 6. En contraste, el genoma ratones contiene sólo un gen de SMN, y su eliminación es embrionariamente letal 7. Así, con el fin de desarrollar modelos de ratón espinales atrofia muscular, un humano SMN2 copia se introdujo artificialmente en los ratones con el gen SMN 8,9. Estos animales aún representan el modelo más cercano genética a la patología humana, pero el fenotipo observado en estos ratones se debe a la expresión de un gen SMN2 que los ratones no expresan normalmente 10. En el caso de la distrofia muscular de Duchenne, los ratones mdx tiene un gen de la distrofina mutado similar a los pacientes humanos, pero el resultado es mucho menos grave en comparación con los síntomas observados en los pacientes 11. El ratón más ampliamente utilizado de modelo para amyotrophic esclerosis lateral, los ratones SOD1, hasta ahora decepcionó en ideas reveladoras en los mecanismos de la enfermedad y las medidas terapéuticas 12,13. Por lo tanto, la médula espinal, las células musculares explantes co-cultivos para estudiar la función, las características de genómica y proteómica de los músculos procedentes de pacientes, en un entorno completamente fisiológico, representan una herramienta muy valiosa para estudiar enfermedades tan complejas. Además, este modelo heterosexual de la misma especie ayudará a distinguir entre los mecanismos patológicos neurogénica y miogénica. 3,14,15
El co-cultivo se presenta aquí también tiene algunas limitaciones. Por ejemplo, experimentos de inmunohistoquímica en las células musculares son difíciles de realizar en esta estructura, ya que el terminal nervioso encarnado por el explante cubre el aparato NMJ postsináptica. Este sistema también puede utilizarse para evaluar los efectos neurotróficos o miotónica de medicamentos en un sistema de cultivo integrado y maduro relativamente, pero no permite alto rendimientodetección, como el volumen sería demasiado grande. Curiosamente, la homóloga de músculo y nervio co-cultivo con tanto nervio y componentes del músculo proviene sólo de ratón o una rata no es funcional y no dar lugar a contracciones musculares. Recientemente, sin embargo, la inervación homóloga entre las células musculares de ratones de satélite y explantes de ratón de la médula espinal se ha realizado con éxito por la modificación de la fecha de recolección de embriones (Callizot, Steinschneider y sus colegas, los resultados no publicados). Nuevos avances en el establecimiento de protocolos de rutina para homóloga co-cultivos podría ayudar a superar la limitación de especies que existen para que esta técnica hoy en día.
A pesar de estas limitaciones, como se describe aquí un método que permite el estudio de muchos aspectos de los músculos y la fisiología de las neuronas motoras, una técnica que no es difícil de realizar, no requiere ningún material especial y los resultados que en la médula espinal estable explantes de músculo co- cultivos que pueden ser fácilmente mantenidos y Studied durante muchos meses.
Ciertos aspectos del protocolo son de particular importancia y la necesidad de un cuidado especial para asegurar una adecuada inervación. En primer lugar, los embriones de rata tiene que estar comprendida entre 13 y 14 ED de edad. En segundo lugar, 500.000 células por placa de 35-mm asegura el nivel correcto de confluencia celular para facilitar la adhesión de los explantes que se añaden a las células del músculo inmediatamente cuando se inicia la fusión celular. Por último, como se subraya en el protocolo, la adición del medio después del depósito de los explantes en las células del músculo es la parte más difícil de este procedimiento y se debe realizar con sumo cuidado.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Nuestro trabajo es apoyado por la Swiss National Science Foundation (SNF), la Iniciativa de Suiza en Biología de Sistemas (SystemsX.ch), la Asociación de Distrofia Muscular EE.UU. (MDA), la Asociación Francesa contra las Miopatías (AFM), la United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF), la Fundación Gebert-Ruf Enfermedades Raras Programa (GRF), la Sociedad Suiza para la Investigación de las Enfermedades Musculares (SSEM / FSRMM), el Swiss Life "Jubiläumsstiftung für Medizinische Forschung und Volksgesundheit", la Roche Fundación para la Investigación y la Universidad de Basilea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| MEM | GIBCO, by Life Technologies | 31095 | |
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 31153 | |
| Fetal Bovine Serum | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 | |
| Insuline | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Human EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Human FGF | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Penicillin/streptomycin solution | GIBCO, by Life Technologies | 15140 |
References
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