Summary
Células musculares cultivadas são um modelo inadequado para recapitular músculo inervado
Abstract
Humanos células musculares primárias cultivadas em monocamada aneurally raramente contrato espontaneamente, porque, na ausência de um componente do nervo, diferenciação celular é limitada e motor estimulação neuronal está ausente 1. Estas limitações dificultar o estudo in vitro de muitas doenças neuromusculares em células musculares em cultura. Importante, as restrições experimentais de monolayered, células musculares em cultura pode ser superado pela inervação funcional de miofibras com explantes da medula espinal em co-cultura.
Aqui, nós mostram os diferentes passos necessários para atingir um inervação, eficiente adequado de células musculares humanos primários, levando à completa contracção diferenciação e de fibras de acordo com o método desenvolvido por Askanas 2. Para fazer isso, as células musculares são co-cultivadas com explantes espinal medula de embriões de ratos em ED 13,5, com o gânglio da raiz dorsal ainda ligado às fatias de medula espinhal. Depois de alguns dias, o músculo fibros começar a contrato e, eventualmente, tornar-se cruz-estriado através inervação por neurites funcionais projetando a partir dos explantes da medula espinhal que ligam para as células musculares. Esta estrutura pode ser mantida durante vários meses, simplesmente por troca regular do meio de cultura.
As aplicações desta ferramenta de valor inestimável são numerosas, pois representa um modelo funcional para análises multidisciplinares de desenvolvimento muscular humana e inervação. Na verdade, uma completa de novo instalação junção neuromuscular ocorre em um prato de cultura, permitindo uma fácil medição de muitos parâmetros em cada passo, num contexto fundamental e fisiológico.
Só para citar alguns exemplos, genômicos e / ou estudos de proteômica pode ser realizada diretamente sobre as co-culturas. Além disso, os efeitos pré e pós-sináptica pode ser e especificamente avaliados separadamente na junção neuromuscular, porque ambos os componentes vêm de diferentes espécies,de rato e humano, respectivamente. O nervo músculo-co-cultura pode também ser realizada com células musculares humanas isoladas de pacientes que sofrem de músculo ou doenças neuromusculares 3, e assim pode ser usado como uma ferramenta de rastreio de drogas candidatas. Finalmente, nenhum equipamento especial, mas uma instalação de BSL2 regular é necessária para reproduzir uma unidade de motor funcional em um prato de cultura. Este método, assim, é valiosa para ambos o músculo, bem como as comunidades de investigação neuromusculares para estudos fisiológicos e mecanicista da função neuromuscular, num contexto normal e doença.
Protocol
1. Preparação da cultura de células humanas muscular primária
- Estabelecer as culturas de células humanas musculares de acordo com a técnica de explante-re explante-4. Primeiro, remova não-tecido muscular das biópsias. Em seguida, incorporar 1 mm 3 explantes musculares em um coágulo de plasma, que permite que os fibroblastos de emergir dos explantes.
- Os explantes incorporados são transferidos para um prato de plasma gelatina revestido e deixá-los crescer em meio de crescimento normal (MEM suplementado com meio de 25% 199, 10% de soro fetal bovino [FBS], 1% de penicilina / estreptomicina, 10 insulina ug / ml, 10 ng / ml factor de crescimento epidérmico humano [EGF], 12,5 ng / ml factor de crescimento fibroblástico humano [FGF]) em uma monocamada. As células que surgem a partir dos explantes sob essas condições são as células musculares. Estas células continuam a crescer em uma monocamada após a remoção dos explantes.
- Cultura das células aneurally 0,1% de gelatina em placas revestidas em meio de crescimento normal. As células podem seraneurally cultivadas e amplificadas, conforme necessário. É preferível utilizar células musculares em uma passagem entre 3 e 8 para executar os co-culturas. É fundamental para inervar miotubos jovens, após este ponto, as co-culturas têm um alto risco de fracassar. Além disso, miotubos não deve ser demasiado grande e muito espessa.
- Dois dias antes da inervação está prevista placa, as células musculares em 35 pratos de tecido mm de cultura (ou 6 placas de poços) com uma densidade de 500.000 células por placa em meio de crescimento normal. Em que a densidade, as células estão na confluência adequada para iniciar a fusão no dia seguinte, e subsequente inervação do dia depois disso. Utilizando essas condições, os miotubos estão na fase certa para inervação ideal e contração das fibras, portanto, posterior.
- No dia seguinte, substituir o meio de crescimento normal, com uma média de fusão composta de MEM suplementado com meio de 25% 199, 5% de FBS, a insulina 10 mg / ml e 1% de penicilina / estreptomicina.
2. Isolati no do rato embrionárias Explantes da Medula Espinal
Todo o procedimento para isolar os explantes da medula espinal é realizada sob um microscópio binocular, em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS, Gibco / Invitrogen ref 14.170) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS).
- É crucial que os embriões de ratos estão entre ED 13 e 14 como um estágio de desenvolvimento diferente comprometeria todo o processo. Sacrifique uma mulher grávida com CO 2 e recolher a cadeia embrião inteiro em meio HBSS. Isolar cada embrião e decapitar as crianças para a eutanásia.
- Dissecar a medula espinal embrionária do resto do corpo de uma só peça e remover o músculo e tecido conjuntivo envolvente. Tenha muito cuidado para manter os gânglios da raiz dorsal (DRGs) ligados à medula espinhal para garantir a inervação funcional.
- Cada fatia da medula espinal transversalmente de uma maneira que cada explante contém pelo menos 2 DRG ligada a ela (explantes de 1 mm 3).
- Remover o meio de fusão sobre a cultura de células do músculo, deixando uma fina camada de meio sobre a monocamada.
- Coloque os frascos cuidadosamente sobre a camada de células musculares, cinco explantes uniformemente espaçadas por 35 prato mm.
- Adicionar muito lentamente, solte meio de fusão sábio, em cada explante. É necessário adicionar meio para as células musculares para sobreviver, mas não demasiado para permitir que os explantes a aderir primeiro e fazer contacto com as células. Se o meio não é adicionado corretamente (muito forte ou médio muito), os explantes irá flutuar e irá falhar para inervar as células musculares.
- Uma vez que os explantes começar a aderir, no topo da média de fusão a 2 ml por 35 prato mm, e pôr os pratos com muito cuidado de volta para a incubadora.
4. Manutenção dos heterólogos nervo-músculo Co-culturas
- Alterar o meio de fusão duas vezes por semana.
Logo que dois dias depois da inervação, é possível ver as neurites que emergem de cada explante e estabelecimento de contactos com as células musculares, representados pelas estruturas botão-like (Fig. 1).
Já em 4-6 dias após a inervação, algumas fibras individuais começará a se contrair.
As contracções persistir durante vários meses, mantida simplesmente mudando o meio de cultura duas vezes por semana.
Após cerca de 2 semanas, o explante medula espinal-se degenera, mas a inervação é conservada. Isto é normal. Uma fina camada de componente do nervo permanece na superfície da camada de células do músculo. Esta rede nervoso é suficiente para manter a funcionalidade do bloco do motor.
Se os explantes flutuar no meio de um dia após a inervação, eles nunca irá aderir. Isto acontece quando a camada de células do músculo énão é suficientemente confluentes, ou quando o meio é adicionado demasiado aproximadamente. Às vezes, os explantes, mas não adere neuritos surgirão. Isto é provavelmente devido à falta de DRG ligado a ele. Neste caso também, a inervação não será estabelecida. Manipular os pratos com muito cuidado na primeira semana, como os explantes ainda pode se desprendem facilmente. Para trocar a mídia de fusão, adicionar o líquido gota a gota com uma velocidade mínima para evitar desprendimento de células.
Figura 1. Da medula espinhal célula muscular explantes co-culturas do dia 1 ao dia 15.
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Discussion
Uma ferramenta fisiológica in vitro para estudar a função da célula muscular em contexto normal e patológico é do maior interesse para os myologists, porque as culturas de células musculares geralmente não recapitular a importância de várias células e células do tipo conexões. A adição de neurónios motores purificado para as células musculares não é suficiente para alcançar uma unidade de motor funcional uma vez que a presença de células de Schwann é necessária para a inervação para ser eficiente 5, e não é topologicamente (distribuição + 3D especial) O protocolo relevante descrita aqui tem sido utilizado com sucesso para estabelecer as células do músculo inervado in vitro e os resultados em uma maturação JNM completa que pode ser facilmente avaliada.
Modelos murinos agora estão disponíveis para muitas doenças neuromusculares. Infelizmente, muitos destes modelos são limitados em termos da tradução para a doença em pacientes humanos, por exemplo, os modelos de ratos para a atrofia muscular espinal, de Duchennedistrofia muscular ou esclerose lateral amiotrófica. A atrofia muscular espinal é causada por uma mutação no gene SMN1, que em parte pode ser mitigado pela presença de um gene SMN segundo no genoma humano 6. Em contraste, o genoma ratinhos contém apenas um gene para SMN, ea sua supressão é embrionariamente letal 7. Assim, a fim de desenvolver modelos de rato espinais atrofia muscular, uma cópia SMN2 humano foi introduzido artificialmente os ratinhos knockout SMN 8,9. Estes animais continuam a representar o modelo mais próximo genética para a patologia humana, mas o fenótipo observado nos ratos é devido à expressão de um gene SMN2 que os ratos normalmente não expressam 10. No caso de distrofia muscular de Duchenne, os ratinhos tsx têm um gene da distrofina mutado semelhante a pacientes humanos, mas o resultado é muito menos grave em comparação com os sintomas observados em pacientes 11. O modelo do rato mais amplamente utilizado para amyotrophic esclerose lateral, os camundongos SOD1, tanto decepcionado com dados reveladores sobre mecanismos da doença e abordagens terapêuticas 12,13. Portanto, medula espinhal célula muscular explantes co-culturas para estudar a função, as características genômicas e proteômicas do músculo provenientes de pacientes, em um cenário completamente fisiológica, representam uma ferramenta inestimável para o estudo destas doenças complexas. Além disso, este modelo hetero espécie ajuda a discriminar entre neurogênica e miogênica mecanismos patológicos. 3,14,15
A co-cultura aqui apresentada também tem algumas limitações. Por exemplo, experiências de imunohistoquímica nas células musculares são difíceis de realizar sobre essa estrutura, porque o terminal do nervo incorporado pelo explante cobre o aparelho JNM pós-sináptica. Este sistema também pode ser usado para avaliar os efeitos neurotróficos ou miotónica de drogas em um sistema de cultura integrada e relativamente maduro, mas não permite alto rendimentorastreio, como o volume seria demasiado grande. Curiosamente, o homólogo do nervo músculo-co-cultura com tanto nervo e componentes musculares vindo somente a partir do rato ou o rato não é funcional e não resultar em contrações musculares. Recentemente, no entanto, homólogos inervação entre células de ratinho de satélite musculares e de explantes da medula espinal de rato foi realizada com sucesso por modificação da data da colheita de embriões (Callizot, Steinschneider e colegas, resultados não publicados). Os progressos no estabelecimento de protocolos de rotina para homóloga co-culturas pode ajudar a superar a limitação de espécies que existe hoje para esta técnica.
Apesar destas limitações, descrevemos aqui um método que permite o estudo de muitos aspectos do músculo e neurónio motor fisiologia; uma técnica que não é difícil de realizar, não necessita de qualquer material especial e que os resultados na medula espinal estável explantes músculo-co- culturas que podem ser facilmente mantidos e Studied por muitos meses.
Certos aspectos do protocolo são de particular importância e necessita de cuidados especiais para garantir uma inervação adequada. Primeiro, os embriões de rato tem que estar entre 13 e 14 ED de idade. Em segundo lugar, 500.000 células por 35 mm de prato assegura o nível correcto de confluência de células para facilitar a aderência dos explantes que são adicionados para as células musculares imediatamente quando a fusão celular é iniciado. Finalmente, como enfatizado no protocolo, a adição do meio após o depósito dos explantes sobre as células musculares é a parte mais difícil deste procedimento e deve ser realizada com extremo cuidado.
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Nosso trabalho é apoiado pela National Science Foundation suíço (SNF), a Iniciativa Suíça em Biologia de Sistemas (SystemsX.ch), a Muscular Dystrophy Association EUA (MDA), a Associação Française contre les Miopatias (AFM), o United mitocondrial Doença Fundação (UMDF), a Gebert-Ruf Fundação Programa das Doenças Raras (GRF), a Sociedade Suíça de Investigação das doenças musculares (SSEM / FSRMM), a Swiss Life "Jubiläumsstiftung für Volksgesundheit und Forschung medizinische", a Roche Research Foundation e da Universidade de Basileia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| MEM | GIBCO, by Life Technologies | 31095 | |
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 31153 | |
| Fetal Bovine Serum | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 | |
| Insuline | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Human EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Human FGF | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Penicillin/streptomycin solution | GIBCO, by Life Technologies | 15140 |
References
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