Summary
Odlade muskelceller är ett otillräckligt modell för att rekapitulera innerverad muskler
Abstract
Humana primära muskelceller odlade aneurally i monoskikt sällan kontraktet spontant, eftersom det i avsaknad av en nerv komponent, celldifferentiering begränsad och motor neuron stimulering saknas 1. Dessa begränsningar hämma in vitro-studie av många neuromuskulära sjukdomar hos odlade muskelceller. Viktigare är att de experimentella begränsningarna i monolayered, odlade muskelceller övervinnas genom funktionell innervation av myofibers med ryggmärgen explantat i samkulturer.
Här visar vi de olika stegen som krävs för att uppnå en effektiv, korrekt innervation av humana primära muskelceller, vilket leder till fullständig differentiering och fiber kontraktion enligt den metod som utvecklats av Askanas 2. För att göra detta är muskelceller samodlade med ryggmärgen explantat av råttembryon på ED 13,5, med dorsalrotsganglier fortfarande sitter i ryggmärgen skivor. Efter några dagar muskeln fimedlemmar börjar att dra ihop sig och så småningom bli över tvärstrimmig genom innervation av funktionella neurites skjuter från ryggmärgen explantat som ansluter till muskelcellerna. Denna struktur kan bibehållas under flera månader, helt enkelt genom regelbundet utbyte av odlingsmediet.
De tillämpningar av denna ovärderliga verktyg är många, eftersom det utgör en funktionell modell för tvärvetenskapliga analyser av människans muskler utveckling och innervation. I själva verket sker en fullständig de novo neuromuskulära förbindelsen installation i en odlingsskål, vilket tillåter en enkel mätning av många parametrar vid varje steg, i en fundamental och fysiologisk sammanhang.
Bara för att nämna några exempel, genomiska och / eller proteomik studier kan utföras direkt på de båda kulturerna. Dessutom kan pre-och postsynaptiska effekter specifikt och separat bedömas vid den neuromuskulära förbindelsen, eftersom båda delarna kommer från olika arter,råtta och människa, respektive. Den nerv-muskel samodling kan också utföras med humana muskelceller isolerade från patienter som lider av muskel-eller neuromuskulära sjukdomar 3, och således kan användas som ett screeningsverktyg för läkemedelskandidater. Slutligen krävs ingen speciell utrustning, men en vanlig BSL2 hjälpmedel som behövs för att återskapa en funktionell motorenhet i en kultur maträtt. Denna metod är således värdefullt för både muskel samt neuromuskulära samhällen forskning för fysiologiska och mekanistiska studier av neuromuskulär funktion, i en normal och sjukdom sammanhang.
Protocol
1. Beredning av primär Human Muscle Cell Culture
- Fastställa mänskliga kulturer muskel cell enligt explantation-RE-explantation tekniken 4. Först ta bort icke-muskelvävnad från biopsier. Sedan bädda 1 mm 3 muskel explantat i en koagel av plasma, vilket gör att fibroblaster att dyka från explantaten.
- De inbäddade Explantaten överförs till en plasma-gelatinbelagda skålen och låta dem växa i normalt tillväxtmedium (MEM kompletterat med 25% mediet 199, 10% fetalt bovint serum [FBS], 1% penicillin / streptomycin, 10 | ig / ml insulin, 10 ng / ml human epidermal tillväxtfaktor [EGF], 12,5 ng / ml humant fibroblast-tillväxtfaktor [FGF]) i ett monolager. De celler som framkommer från explantaten under dessa villkor är muskelceller. Dessa celler kommer att fortsätta att växa i ett monoskikt efter avlägsnande av explantaten.
- Odla cellerna aneurally på 0,1% gelatin-belagda plattor i normalt tillväxtmedium. Cellerna kan varaaneurally odlades och amplifieras efter behov. Det är bättre att använda muskelceller vid en passage mellan 3 och 8 för att utföra co-kulturer. Det är viktigt att innerverar unga myotuber, efter denna punkt, co-kulturer har en hög risk för att misslyckas. Vidare bör myotuber inte vara för stora och för tjocka.
- Två dagar före innervation planeras, plattan muskelcellerna på 35 mm vävnadsodlingsskålar (eller 6-brunnsplattor) vid en densitet av 500,000 celler per skål i normalt tillväxtmedium. Vid denna densitet, cellerna blir rätt sammanflöde att starta fusionen följande dag, och efterföljande innervation dagen efter det. Med dessa villkor är de myotuber är på rätt skede för optimal innervation och därmed efterföljande fiber kontraktion.
- Nästa dag, ersätta den normala tillväxtmediet med en fusion medium sammansatt av MEM kompletterat med 25% mediet 199, 5% FBS, 10 | ig / ml insulin och 1% penicillin / streptomycin.
2. Isolati ett av de råttembryonala ryggmärgen Explantat
Hela förfarandet för att isolera de ryggmärgen explantaten utförs under ett binokulärt mikroskop, i Hanks balanserade saltlösning (HBSS, Gibco / Invitrogen ref 14.170) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS).
- Det är viktigt att råttan embryona är mellan ED 13 och 14 som en annan utvecklingsfas skulle äventyra hela förfarandet. Offra en gravid kvinna med CO 2 och samla hela embryot kedjan i HBSS medium. Isolera varje embryo och halshugga dem för eutanasi.
- Dissekera embryot ryggmärgen från resten av kroppen i ett stycke och ta bort omgivande muskler och bindväv. Var mycket noga med att hålla dorsala rot ganglier (DRG) är knutna till ryggmärgen att de blir funktionellt innervation.
- Skiva varje ryggmärgen transversellt på ett sätt som varje explantat innehåller minst 2 DRG fäst vid den (explantat av 1 mm 3).
- Avlägsna fusionsmedium på muskeln cellkultur, vilket lämnar ett fint skikt av medium på monoskiktet.
- Placera explantaten försiktigt på muskelcellerna lagret, fem jämnt fördelade explantaten per 35 mm skål.
- Lägg mycket långsamt, droppvis, fusion medium på varje explantat. Det är nödvändigt att lägga till medium för muskelcellerna att överleva, men inte för mycket att låta explantaten att fästa först och ta kontakt med cellerna. Om mediet inte läggs på rätt sätt (för starkt eller för mycket medium), kommer de explantaten flyta och kommer inte att innerverar muskelcellerna.
- När explantaten börjar ansluta sig, toppa fusionsmedium till 2 ml per 35 mm skål och satte rätterna mycket noga tillbaka in i inkubatorn.
4. Underhåll av de heterologa Nerve-muskel Samkulturer
- Ändra fusionsmedium två gånger i veckan.
Så snart två dagar efter innervation, är det möjligt att se de neuriter som framkommit varje explantat och etablera kontakter med de muskelceller, som representeras av det knappliknande strukturer (Fig. 1).
Så tidigt som 4-6 dagar efter innervation kommer några enskilda fibrer börjar kontrakt.
Sammandragningarna kvarstår i flera månader, underhålls bara genom att ändra odlingsmediet två gånger i veckan.
Efter ca 2 veckor, urartar i ryggmärgen explantatet sig, men innervation bevaras. Detta är normalt. Ett tunt lager av nerv-komponent stannar på ytan av muskelcellerna lagret. Detta nervös nätverk är tillräcklig för att upprätthålla funktionaliteten i motorenheten.
Om explantaten flyter i mediet dagen efter innervation, kommer de följa aldrig. Detta sker när muskelcellerna skiktet ärinte tillräckligt sammanflytande, eller när mediet tillsätts alltför grovt. Ibland kommer explantatet fastnar men inga neuriter fram. Detta är sannolikt på grund av bristen av DRG fästas därvid. I så fall också, kommer innervation inte fastställas. Manipulera disken mycket noga den första veckan, eftersom explantat fortfarande kan lossna lätt. Att byta Fusion Media, tillsätt vätskan droppvis med en minimal fart för att undvika cell lossnar.
Figur 1. Ryggmärgen explantaten-muskelcellen samkulturer från dag 1 till dag 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En fysiologisk in vitro verktyg för att studera funktionen muskelceller i normal och patologisk sammanhang är av högsta intresse för myologists, eftersom muskelceller cellkulturer vanligtvis inte rekapitulera vikten av multipla celler och cell-typ-anslutningar. Tillsats av renat motoriska nervceller till muskelcellerna är inte tillräckligt för att uppnå en funktionell motorenhet eftersom förekomsten av Schwann celler krävs för att innervation ska vara effektiv 5 och det är inte topologiskt (3D + special distribution) relevant Protokollet beskrivs här har använts framgångsrikt för att etablera innerverade muskelceller in vitro och resulterar i en fullständig NMJ mognad som lätt kan bedömas.
Musmodeller finns nu tillgängliga för många neuromuskulära sjukdomar. Tyvärr är många av dessa modeller begränsade när det gäller översättning till sjukdomen hos människor, till exempel musmodeller för spinal muskelatrofi, Duchennemuskeldystrofi eller amyotrofisk lateralskleros. Spinal muskelatrofi orsakas av en mutation i SMN1 genen, som delvis kan mildras genom närvaron av en andra SMN gen i det mänskliga genomet 6. I motsats innehåller mössen genomet enda gen för SMN och dess radering embryoniskt dödlig 7. Således, i syfte att utveckla möss spinal muskelatrofi modeller, har en människa SMN2 kopia artificiellt införd i SMN knockoutmöss 8,9. Dessa djur utgör fortfarande den mest nära genetisk modell av human patologi, men fenotypen observerades i dessa möss beror på expressionen av en gen SMN2 att möss som normalt inte uttrycker 10. I fallet av Duchennes muskeldystrofi, de mdx möss har en muterad dystrofingenen som liknar humana patienter, men resultatet är mycket mindre allvarlig än de symptom som observeras hos patienter 11. Den mest använda musmodell för amyotrophic lateral skleros, de SOD1 möss, så länge besviken på avslöjande insikter sjukdomsmekanismer och terapeutiska strategier 12,13. Därför ryggmärgen explantat-muskelcellen co-kulturer för att studera funktionen, genomiska och proteomik egenskaper muskeln kommer från patienter på ett helt fysiologisk miljö, utgör ett ovärderligt verktyg för att studera sådana komplexa sjukdomar. Även denna hetero-arter modellen hjälper till att skilja mellan neurogena och myogena patologiska mekanismer. 3,14,15
Samarbetet kulturen presenteras här har också vissa begränsningar. Till exempel, immunohistokemi experiment på muskelcellerna är svåra att utföra på denna struktur, eftersom den nervänden bildad av nämnda explantat omfattar den postsynaptiska NMJ anordningen. Detta system kan också användas för att bedöma de neurotrofiska eller myotonisk effekterna av läkemedel på ett integrerat och relativt mogna kulturen systemet, men det inte tillåter hög genomströmningscreening, eftersom volymen skulle bli alldeles för stor. Märkligt, den homologa nerv-muskel samodling med både nerv och komponenter muskel kommer bara från mus eller råtta inte är funktionell och inte resultera i muskelsammandragningar. Nyligen har dock homolog innervation mellan muskelceller mus satellit celler och mus ryggmärg vävnadsdelar sladd utförts med godkänt resultat genom modifiering av det datum då embryot skörd (Callizot, Steinschneider och kollegor, opublicerade resultat). Ytterligare framsteg i upprättandet av rutinmässiga protokoll för homologa samkulturer kan hjälpa till att övervinna den art begränsningen som finns för denna teknik i dag.
Trots dessa begränsningar beskriver vi här en metod som gör det möjligt att studera många aspekter av muskel-och motorneuron fysiologi, en teknik som inte är svårt att utföra, inte kräver någon speciell material och som resulterar i en stabil ryggmärgen explantaten-muskel sam- kulturer som lätt kan bibehållas och Studied för många månader.
Vissa aspekter av protokollet är av särskild betydelse och behöver särskild omsorg för att säkerställa en korrekt innervation. Första, de råttembryon måste vara mellan 13 och 14 DE ålder. För det andra säkerställer 500.000 celler per 35-mm skål rätt nivå av cell sammanflödet för att underlätta vidhäftning av explantaten som läggs till muskelcellerna omedelbart när cellfusion startar. Slutligen, som betonas i protokollet, är tillägget av mediet efter deponeringen av explantaten på muskelcellerna den svåraste delen av detta förfarande och bör utföras med stor försiktighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Vårt arbete stöds av den schweiziska National Science Foundation (SNF), det schweiziska initiativet systembiologi (SystemsX.ch), den muskeldystrofi Association USA (MDA), Association francaise contre les Myopatier (AFM), Förenade mitokondriesjukdomar Foundation (umdf), den Gebert-Ruf Foundation sällsynta sjukdomar Programme (GRF), det schweiziska samhället för forskning av Muskelsjukdomar (SSEM / FSRMM), den Swiss Life "Jubiläumsstiftung für Volksgesundheit und Medizinische Forschung", den Roche Research Foundation och universitetet Basel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| MEM | GIBCO, by Life Technologies | 31095 | |
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 31153 | |
| Fetal Bovine Serum | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 | |
| Insuline | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Human EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Human FGF | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Penicillin/streptomycin solution | GIBCO, by Life Technologies | 15140 |
References
- Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions. Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).
- Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation. J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).
- Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy. Lancet. 345, 694-695 (1995).
- Askanas, V., Engel, W. K. A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture. Neurology. 25, 58-67 (1975).
- Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro. Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).
- Lefebvre, S. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell. 80, 155-165 (1995).
- Schrank, B. Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).
- Hsieh-Li, H. M. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).
- Monani, U. R. The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).
- Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).
- Durbeej, M., Campbell, K. P. Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models. 12, 349-361 (2002).
- Schnabel, J. Neuroscience: Standard model. Nature. 454, 682-685 (2008).
- Benatar, M. Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS. Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).
- Dorchies, O. M. Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system. Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).
- McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies. Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).
