Summary
Kültür kas hücreleri innerve kas özetlemek için yetersiz bir modeli vardır
Abstract
Bir sinir bileşeni yokluğunda, hücre farklılaşması sınırlıdır ve motor nöron stimülasyon 1 eksik kendiliğinden, çünkü İnsan primer kas hücreleri tek tabaka içinde aneurally nadiren sözleşme kültüre. Bu sınırlamalar, kültürlü kas hücrelerinde birçok nöromüsküler hastalıklar, in vitro çalışma engelleyebilir. Önemlisi, tek sıralı, kültürlü kas hücrelerinin deneysel kısıtlamaları ortak kültürlerinde omurilik eksplant ile myofibers fonksiyonel innervasyonu aşılabilir.
Burada, Askanas 2 tarafından geliştirilen yönteme göre farklılaşmasını ve fiber kasılması tamamlamak için açan, insan birincil kas hücreleri için etkili, uygun innervasyon elde etmek için gerekli adımları gösteren farklıdır. Bunu yapmak için, kas hücreleri hala omurilik dilim bağlı dorsal kök gangliyon ile ED 13.5 olarak sıçan embriyolarında omurilik eksplant ile birlikte kültüre edilir. Birkaç gün sonra, kas fiyle sözleşme başlar ve sonunda kas hücrelerine bağlanan bu omurilik eksplantlarının çıkıntı fonksiyonel neurites tarafından innervasyonu ile çapraz çizgili olur. Bu yapı, basit bir kültür ortamında düzenli değişimi ile, çok sayıda ay boyunca muhafaza edilebilir.
Insan kas gelişimi ve innervasyon multidisipliner analiz için işlevsel bir model temsil ettiği bu paha biçilmez aracı uygulamaları çoktur. Aslında, tam bir de novo nöromusküler kurulum temel ve fizyolojik bağlamda her adımda birçok parametre kolay bir ölçüm, izin, bir kültür çanak oluşur.
Birkaç örnekleri, genomik ve / veya proteomik çalışmaları anmakta co-kültürler doğrudan uygulanabilir. Her iki bileşenler farklı türlerden gelir çünkü Ayrıca, pre-ve post-sinaptik etkiler özellikle ve ayrı ayrı, nöromüsküler kavşakta değerlendirilebilirSıçan ve insan idi. Sinir-kas co-kültürü ayrıca kas veya nöromüsküler hastalıklar 3 muzdarip hastaların izole insan kas hücreleri ile yapılabilir, ve böylece aday ilaçlar için bir tarama aracı olarak kullanılabilir. Son olarak, hiçbir özel ekipman, ancak düzenli bir BSL2 tesisi bir kültür kabına fonksiyonel bir motor ünite üretmek için gereklidir. Bu yöntem, normal ve hastalık bağlamında, kas gibi nöromüsküler fonksiyon fizyolojik ve mekanik çalışmalar için nöromüsküler araştırma her iki toplum için değerlidir.
Protocol
1. Primer İnsan Kas Hücre Kültürü Hazırlama
- Eksplantasyonu-re-eksplantasyonu tekniği 4'e göre insan kas hücre kültürü oluşturulması. İlk olarak, biyopsi dışı kas dokusu kaldırın. Sonra, fibroblastlar eksplantlarının çıkmaya olanak plazma, bir pıhtı 1 mm 3 kas eksplantları embed.
- Gömülü eksplantları bir plazma-jelatin kaplı çanağı aktarılır ve bunları (MEM% 10 fetal bovin serumu [FBS],% 1 penisilin / streptomisin, 10 ug / ml insülin,% 25 orta 199, takviye normal büyüme ortamında büyümesine izin edilir 10 ng / ml insan epidermal büyüme faktörü [EGF], 12.5 ng / ml insan fibroblast büyüme faktörü, bir mono tabakasında [FGF]). Bu koşullar altında eksplantlarının ortaya hücreleri kas hücreleri vardır. Bu hücreler eksplantlarının uzaklaştırıldıktan sonra, bir mono tabakasında büyümeye devam edecektir.
- Kültür aneurally normal büyüme ortamı içinde% 0.1 jelatin kaplı levhalar üzerine hücreleri. Hücreler olabiliraneurally kültüre ve gerekli olarak abartılıyor. Bu ko-kültürler gerçekleştirmek için 3 ile 8 arasında bir geçiş alanı olarak kas hücrelerinin kullanımı daha uygundur. Bu genç myotubes innerve önemlidir, bu noktadan sonra, ortak kültürlerin başarısız bir yüksek riske sahiptir. Ayrıca, myotubes çok büyük ve çok kalın olmamalıdır.
- Innervasyon planlanan iki gün önce, plaka normal büyüme ortamında tabağı başına 500,000 hücre yoğunluğunda 35 mm doku kültür tabaklarına (ya da 6 oyuklu plakalar) üzerine kas hücreleri. Bu yoğunlukta, hücreler, bundan sonra da bir sonraki gün füzyon başlatmak için uygun konfluent, ve takip eden innervasyon günde altındadır. Bu koşullar kullanarak, myotubes optimum innervasyon ve dolayısıyla sonraki lif kasılması için doğru aşamadadır.
- Ertesi gün,% 25 orta 199,% 5 FBS, 10 ug / ml insülin ve penisilin / streptomisin ile desteklenmiş% 1 MEM oluşan bir füzyon ortam ile normal büyüme ortamı yerini alır.
2. Isolati Sıçan Embriyonik Omurilik Eksplantlarından ile ilgili
Spinal kord eksplantlarının izole etmek için tüm prosedürü% 10 fetal bovin serumu (FBS) içeren Hank'in dengeli tuz Çözelti (HBSS, Gibco / Invitrogen ref 14170), bir mikroskop altında yapılır.
- Bu sıçan embriyolarında farklı bir gelişme aşaması olarak ED 13 ve 14 arasında olduğunu tüm prosedürü tehlikeye atacak çok önemlidir. CO 2 ile hamile bir kadın kurban ve HBSS ortamda bütün embriyo zinciri toplamak. Her embriyo izole edin ve ötanazi için onları işten çıkarmak.
- Tek parça halinde vücudun geri kalanından embriyo omurilik inceleyin ve çevresindeki kas ve bağ dokusu çıkarın. Fonksiyonel innervasyon sağlamak için omuriliği bağlı dorsal kök ganglion (DRG) tutmak için çok dikkatli olun.
- Her eksplant en az 2 DRG (1 mm ile 3 eksplantları) kendisine bağlı bulunduğu bir şekilde enine her spinal kord dilim.
- Tek tabaka üzerinde orta ince bir tabaka bırakarak, kas hücre kültürü üzerine füzyon orta çıkarın.
- Kas hücre tabakası, 35 mm çanak başına beş eşit aralıklı eksplant üzerinde dikkatle eksplantlarının yerleştirin.
- Çok yavaş ekleyin, her eksplant üzerine bilge, füzyon orta bırakın. Bu eksplantları birinci yapışması ve hücreler ile temas etmesi için izin vermek için çok fazla hayatta kalmak için kas hücreleri için orta eklemek için gerekli olan, fakat değildir. Orta düzgün (çok güçlü veya çok fazla orta) ilave değilse, eksplantlarının yüzer ve kas hücreleri innerve başarısız olur.
- Eksplantlarının uymaları başladığınızda, 35 mm çanak başına 2 ml füzyon orta top ve inkübatör geri çok dikkatli yemekleri koymak.
4. Heterolog Sinir-kas Co-kültürlerin Bakım
- Haftada iki kez füzyon orta değiştirin.
En kısa zamanda iki gün olarak innervasyon sonra, her bir eksplant çıkan ve benzeri yapılara düğmesi (Şekil 1) tarafından temsil edilen kas hücreleri, ilişkiler kurulması neurites görmek mümkündür.
Gibi erken innervasyon sonra 4-6 gün gibi, birkaç bireysel liflerin sözleşme başlayacaktır.
Kasılmalar sadece haftada iki kez kültür ortamı değiştirerek muhafaza, aylarca devam etmektedir.
Yaklaşık 2 hafta sonra, spinal kord eksplant kendisi soysuzlar, fakat innervasyon muhafaza edilir. Bu normal bir durumdur. Sinir bileşenin bir ince tabaka kas hücre tabakasının yüzeyinde kalır. Bu sinir ağ motor ünitesi işlevselliğini korumak için yeterli olur.
Eksplantlarının innervasyon sonra orta günde yüzer, bunlar bağlı asla. Kas hücre tabakası olduğunda bu oluryeterince konfluent, veya orta değil çok yaklaşık olarak ilave edilir. Bazen, eksplant yapışır ama neurites ortaya çıkacaktır. Bu büyük olasılıkla ona bağlı DRG eksikliği kaynaklanmaktadır. Yanı sıra, bu durumda, innervasyon kurulan edilmeyecektir. Eksplantlarının hala kolayca ayırmak gibi, ilk hafta çok dikkatli yemekleri işleyin. Füzyon medya alışverişi, hücre dekolmanı önlemek için en az bir hız ile damla sıvı-bilge ekleyin.
Şekil 1. Omurilik eksplantları-kas hücresi gün 15 gün 1 co-kültürler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kas hücre kültürlerinde genellikle birden çok hücre ve hücre tipi bağlantılar önemini recapitulate çünkü normal ve patolojik bağlamda kas hücre fonksiyonu incelemek için bir fizyolojik in vitro aracı, myologists için en ilgi biridir. Kas hücreleri için motor nöron saflaştırılmış Ayrıca Schwann hücreleri varlığında 5 verimli olmasını innervasyon için gerekli olan ve ilgili protokolü burada açıklanan (3B + özel bir dağıtım) topolojik sahiptir olmadığı için işlevsel bir motor ünitesi elde etmek için yeterli değildir in vitro ve kolayca tespit edilebilir tam bir NMJ olgunlaşmasında sonuçlarında innerve kas hücreleri oluşturmak için başarıyla kullanılmaktadır.
Sıçan modellerinde birçok nöromüsküler hastalıklar için artık kullanılabilir. Ne yazık ki, bu modellerin çoğu örneğin spinal müsküler atrofi için fare modelleri, Duchenne, insan hastalarda hastalık çeviri açısından sınırlıdırmüsküler distrofi, amiyotrofik lateral skleroz ya. Spinal müsküler atrofi kesiminde insan genomu 6 ikinci bir SMN geninin varlığı ile hafifletilebilir SMN1 geni, mutasyon nedeniyle oluşur. Bunun aksine, farelerin genomunun SMN için sadece bir gen içeriyorsa, ve silinmesine 7 embryonically ölümcüldür. Böylece, fare spinal müsküler atrofi modelleri geliştirmek amacıyla, bir insan SMN2 kopya yapay SMN nakavt fareler 8,9 sokuldu. Bu hayvanların hala insan patoloji modelinin yakın genetik temsil eder, fakat bu farelerde gözlenen fenotipin farelerin normal olarak 10 açıklanmamıştır bir SMN2 genin ekspresyonu kaynaklanmaktadır. Duchenne kas distrofisi durumda, mdx farelere insan hastalara benzer mutasyona uğramış bir distrofinin geni olması, ancak sonucu hastalarda görülen 11 semptomları ile karşılaştırıldığında çok daha az ciddi bir durumdur. Amyotrophi için en yaygın olarak kullanılan fare modelindec lateral skleroz, SOD1 farelerde, bugüne kadar hastalık mekanizmaları ve tedavi yaklaşımları 12,13 içine açıklayıcıdır ufuklar hayal kırıklığına uğrattı. Bu nedenle, spinal kord eksplantları-kas hücre ko-kültür, hastaların gelen kas genomik ve proteomik özellikleri işlevini incelemek için tamamen fizyolojik bir ortamda, böylesine karmaşık hastalıkları incelemek için paha biçilmez bir aracı temsil eder. Ayrıca bu hetero-türler modeli nörojenik ve miyojenik patolojik mekanizmalar arasında ayırım yardımcı olur. 3,14,15
Burada sunulan ko-kültür, aynı zamanda bazı sınırlamalar vardır. Eksplant tarafından somutlaşan sinir terminali postsinaptik NMJ aparatı kapsar çünkü Örneğin, kas hücreleri üzerinde immunohistokimyasal deneyler, bu yapının üzerinde gerçekleştirmek zordur. Bu sistem aynı zamanda entegre ve nispeten olgun kültür sistemde ilaçların nörotrofik veya miyotonik etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir, ama izin vermez yüksek verimliliktarama, hacmi kadar çok büyük olurdu gibi. Merakla, homolog sinir-kas, sinir ve kas bileşenleri hem de sadece fare veya sıçan gelen ile ko-kültür işlevsel değildir ve kas kasılmaları neden başarısız olur. Ancak son zamanlarda, fare uydu kas hücreleri ve fare omurilik eksplantları arasındaki homolog innervasyon başarıyla embriyo hasat tarihinden modifikasyonu (Callizot, Steinschneider ve arkadaşları, yayınlanmamış sonuçlar) tarafından yapılmıştır. Homolog co-kültürler için rutin protokol kurulması konusunda ilerleme bugün bu tekniği için mevcut türlerin sınırlama üstesinden gelmek için yardımcı olabilir.
Bu kısıtlamalara rağmen, biz burada kas ve motor nöron fizyolojisi birçok yönüyle çalışma sağlayan bir yöntem tarif; gerçekleştirmek zor değil bir tekniktir, istikrarlı omurilik eksplantları-kas ko-herhangi bir özel malzeme ve sonuçların gerektirmez kolayca korunabilir kültür ve Studieaylarca d.
Protokol belirli yönlerini özellikle dikkat edilmesi gereken ve uygun bir innervasyon sağlamak için özel bakım gerekir. İlk olarak, sıçan embriyosu yaşları 13 ila 14 ED olmalıdır. İkinci olarak, 35 mm tabağı başına 500,000 hücrelerin hücre füzyonunun başlar hemen olduğunda kas hücreleri eklenir eksplantlarının yapışması kolaylaştırmak için hücre birleşiminin doğru seviyesi sağlar. Son olarak, protokol vurguladığı, kas hücreleri üzerinde eksplantlarının yatırıldıktan sonra ortamın yanı sıra bu prosedürün en zor parçası olan ve son derece dikkatli yapılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Çalışmalarımız İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNF), Sistem Biyolojisi (SystemsX.ch), Muskuler Distrofi Derneği USA (MDA), Association Française contre les Miyopatiler (AFM), Birleşik Mitokondriyal Hastalık Vakfı İsviçre Girişimi tarafından desteklenmektedir (UMDF), Gebert-RUF Vakfı Nadir Hastalıklar Programı (GRF), Kas Hastalıkları (SSEM / FSRMM), Swiss Life "Jubiläumsstiftung für Volksgesundheit und Medizinische Forschung", Roche Araştırma Vakfı ve Üniversitesi Araştırma İsviçre Toplum Basel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| MEM | GIBCO, by Life Technologies | 31095 | |
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 31153 | |
| Fetal Bovine Serum | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 | |
| Insuline | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Human EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Human FGF | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Penicillin/streptomycin solution | GIBCO, by Life Technologies | 15140 |
References
- Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions. Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).
- Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation. J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).
- Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy. Lancet. 345, 694-695 (1995).
- Askanas, V., Engel, W. K. A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture. Neurology. 25, 58-67 (1975).
- Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro. Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).
- Lefebvre, S. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell. 80, 155-165 (1995).
- Schrank, B. Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).
- Hsieh-Li, H. M. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).
- Monani, U. R. The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).
- Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).
- Durbeej, M., Campbell, K. P. Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models. 12, 349-361 (2002).
- Schnabel, J. Neuroscience: Standard model. Nature. 454, 682-685 (2008).
- Benatar, M. Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS. Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).
- Dorchies, O. M. Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system. Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).
- McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies. Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).
