Summary
Cellule muscolari coltivate sono un modello inadeguato per ricapitolare muscolo innervato
Abstract
Le cellule muscolari primarie aneurally coltivate in monostrato raramente contratto spontaneamente perché, in assenza di un componente nervo, la differenziazione cellulare è limitata e la stimolazione motore neurone manca 1. Queste limitazioni ostacolano lo studio in vitro di molte patologie neuromuscolari in cellule muscolari coltivate. È importante sottolineare che i vincoli sperimentali monostrato di coltura, le cellule muscolari possono essere superate innervazione funzionale di miofibre con espianti midollo spinale in co-culture.
Qui, si mostrano le diverse fasi necessarie per ottenere un efficiente, innervazione corretto di cellule muscolari primarie, portando a completare contrazione differenziazione e fibra secondo il metodo sviluppato da Askanas 2. Per fare ciò, le cellule muscolari sono co-coltura con espianti del midollo spinale di embrioni di ratto a 13,5 ED, con gangli delle radici dorsali ancora attaccato le fette del midollo spinale. Dopo pochi giorni, il muscolo fibri iniziare a contratto e alla fine diventare cross-striata attraverso innervazione da neuriti funzionali sporgenti dalle espianti del midollo spinale che collegano alle cellule muscolari. Questa struttura può essere mantenuta per molti mesi, semplicemente regolare scambio del terreno di coltura.
Le applicazioni di questo prezioso strumento sono numerosi, in quanto rappresenta un modello funzionale per l'analisi multidisciplinari di sviluppo umano e innervazione del muscolo. In realtà, un completo de novo installazione giunzione neuromuscolare avviene in un piatto di coltura, consentendo una misurazione di facile molti parametri ad ogni passo, in un contesto fondamentale e fisiologico.
Solo per citare alcuni esempi, genomici e / o studi di proteomica può essere effettuata direttamente sulle co-culture. Inoltre, gli effetti pre-e post-sinaptica può essere specificamente e separatamente valutati a livello della giunzione neuromuscolare, perché entrambi i componenti provengono da diverse specie,ratto e umano, rispettivamente. Il nervo-muscolo co-coltura può essere eseguita anche con cellule muscolari umane isolate da pazienti affetti da patologie neuromuscolari muscolo o 3, e quindi può essere utilizzato come strumento di screening per farmaci candidati. Infine, nessuna attrezzatura speciale, ma un normale BSL2 struttura è necessaria per riprodurre un unità funzionale motore in un piatto di coltura. Questo metodo è quindi utile sia per il muscolo, nonché le comunità di ricerca neuromuscolari per studi fisiologici e meccanicistica della funzione neuromuscolare, in un contesto normale e malattia.
Protocol
1. Preparazione della coltura principale umano delle cellule muscolari
- Stabilire le colture di cellule muscolari umane secondo il espianto-re-tecnica di espianto 4. In primo luogo, rimuovere non-tessuto muscolare dalle biopsie. Poi, incorporare 1 mm 3 espianti muscolari in un coagulo di plasma, che consente di fibroblasti di emergere dalle espianti.
- Gli espianti sono incorporati trasferita su un piatto di plasma-gelatina rivestita e farli crescere in mezzo di crescita normale (MEM supplementato con 25% di media 199, 10% siero bovino fetale [FBS], 1% di penicillina / streptomicina, 10 ug / ml di insulina, 10 ng / ml di fattore di crescita epidermico umano [EGF], 12,5 ng / ml di fattore di crescita dei fibroblasti umani [FGF]) in un monostrato. Le cellule che emergono dalle espianti in queste condizioni sono cellule muscolari. Queste cellule continuerà a crescere in un monostrato dopo la rimozione degli espianti.
- Coltivare le cellule aneurally sul 0,1% di gelatina rivestite con lastre in terreno di crescita normali. Le cellule possono essereaneurally coltivate e amplificato come necessario. È preferibile usare cellule muscolari a un passaggio tra 3 e 8 per eseguire i co-culture. E 'fondamentale per innervare miotubi giovani, dopo questo punto, i co-culture hanno un alto rischio di fallire. Inoltre, miotubi non deve essere troppo grande e troppo spessa.
- Due giorni prima della innervazione è previsto, piatto le cellule muscolari su piastre da 35 mm di coltura tissutale (o piastre da 6 pozzetti) ad una densità di 500.000 cellule per piatto in mezzo una crescita normale. A tale densità, le cellule sono a confluenza corretto per avviare la fusione il giorno seguente, e la successiva innervazione il giorno dopo. Utilizzando queste condizioni, i miotubi sono allo stadio giusto per innervazione ottimale e quindi la successiva contrazione della fibra.
- Il giorno successivo, sostituire il mezzo di crescita normale con un mezzo fusione composta MEM supplementato con 25% di media 199, 5% FBS, 10 ug / ml di insulina e 1% di penicillina / streptomicina.
2. Intercettaz Uno degli Rat Espianti embrionali del Midollo Spinale
L'intera procedura di isolare gli espianti midollo spinale viene eseguita al microscopio binoculare, in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS, Gibco / ref 14.170 Invitrogen) contenente 10% siero fetale bovino (FBS).
- E 'fondamentale che gli embrioni di ratto sono tra ED 13 e 14, come uno stadio di sviluppo diverso metterebbe a repentaglio l'intera procedura. Sacrifica una femmina gravida di CO 2 e raccogliere l'intera catena embrione in media HBSS. Isolare ogni embrione e decapitare per loro l'eutanasia.
- Sezionare il midollo spinale embrione dal resto del corpo in un unico pezzo e rimuovere muscolo circostante e tessuto connettivo. Fate molta attenzione a mantenere i gangli della radice dorsale (DRG) collegati al midollo spinale per assicurare innervazione funzionale.
- Tagliare ogni midollo spinale trasversalmente in modo che ogni espianto contiene almeno 2 DRG collegato ad esso (espianti di 1 mm 3).
- Rimuovere il mezzo fusione sulla coltura cellula muscolare, lasciando uno strato sottile di supporto sul monostrato.
- Porre gli espianti attenzione sul livello delle cellule muscolari, cinque espianti equidistanti per piastra da 35 mm.
- Aggiungere molto lentamente, goccia a goccia, la fusione di media su ogni espianto. È necessario aggiungere mezzo per le cellule muscolari per sopravvivere, ma non troppo per consentire gli espianti di aderire prima e in contatto con le cellule. Se il mezzo non viene aggiunto correttamente (troppo forte o media troppo), gli espianti galleggia e non riescono a innervare le cellule muscolari.
- Una volta che gli espianti iniziano ad aderire, all'inizio del mezzo di fusione a 2 ml per piastra da 35 mm, e mettere i piatti con molta attenzione nuovamente dentro l'incubatrice.
4. Manutenzione delle eterologhe nervo-muscolo Co-culture
- Cambia il mezzo di fusione due volte a settimana.
Appena due giorni dopo l'innervazione, è possibile vedere le neuriti emergono da ciascun espianto e stabilire contatti con le cellule muscolari, rappresentati dai pulsante strutture simili (Fig. 1).
Già nel 4-6 giorni dopo l'innervazione, poche fibre singole inizierà a contrarsi.
Le contrazioni persistono per molti mesi, mantenuto semplicemente cambiando il terreno di coltura due volte a settimana.
Dopo circa 2 settimane, l'espianto del midollo spinale si degenera, ma l'innervazione è conservata. Questo è normale. Uno strato sottile di componente nervo rimane sulla superficie dello strato di cellule muscolari. Questa rete nervosa è sufficiente a mantenere la funzionalità del gruppo motore.
Se gli espianti galleggiano nel mezzo il giorno dopo innervazione, non potranno mai aderire. Ciò accade quando lo strato cellula muscolare ènon sufficientemente confluenti, o quando il mezzo viene aggiunto troppo grosso. A volte, aderisce espianti, ma non neuriti emergerà. Ciò è probabilmente dovuto alla mancanza di DRG attaccata ad essa. In questo caso anche l'innervazione non verrà stabilita. Manipolare i piatti con molta attenzione la prima settimana, come gli espianti può ancora staccare facilmente. Per scambiare i mezzi di comunicazione di fusione, aggiungere il liquido goccia a goccia con una velocità minima per evitare il distacco delle cellule.
Figura 1. Midollo spinale espianti-cellule muscolari co-colture dal giorno 1 al giorno 15.
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Discussion
Uno strumento fisiologico in vitro per studiare la funzionalità delle cellule muscolari in un contesto normale e patologico è di maggior interesse per i myologists, perché le colture di cellule muscolari di solito non ricapitolare l'importanza delle cellule multiple e delle cellule di tipo connessioni. L'aggiunta di purificato motoneuroni di cellule muscolari non è sufficiente per ottenere un'unità funzionale motore in quanto la presenza di cellule di Schwann è richiesto per l'innervazione sia efficiente e 5 non è topologicamente (3D + distribuzione speciale) pertinente Il protocollo qui descritto ha stati utilizzati con successo per stabilire cellule muscolari innervati in vitro ed i risultati di una completa maturazione NMJ che può essere facilmente valutare.
Modelli murini sono ora disponibili per molte malattie neuromuscolari. Purtroppo, molti di questi modelli sono limitate in termini di traduzione della malattia in pazienti umani, ad esempio i modelli del mouse per l'atrofia muscolare spinale, Duchennedistrofia muscolare o la sclerosi laterale amiotrofica. L'atrofia muscolare spinale è causata da una mutazione nel gene SMN1, che in parte può essere mitigata dalla presenza di un gene SMN secondo nel genoma umano 6. Al contrario, il genoma topi contiene solo un gene per SMN, e la sua soppressione è embrionalmente letale 7. Pertanto, al fine di sviluppare modelli di topo atrofia muscolare spinale, un essere umano SMN2 copia è stata introdotta artificialmente nei topi knockout smn 8,9. Questi animali rappresentano ancora più vicino al modello genetico patologia umana, ma il fenotipo osservato nei topi è dovuta alla espressione di un gene SMN2 topi che normalmente non esprimono 10. Nel caso di distrofia muscolare di Duchenne, i topi mdx hanno un gene mutato distrofina simile a pazienti umani, ma il risultato è molto meno grave rispetto ai sintomi osservati nei pazienti 11. Il modello di topo più utilizzato per amyotrophic sclerosi laterale, i topi SOD1, finora deluso intuizioni rivelatrici sui meccanismi della malattia e gli approcci terapeutici 12,13. Pertanto, midollo spinale, delle cellule muscolari espianti co-colture per studiare la funzione, le caratteristiche di genomica e proteomica del muscolo provenienti da pazienti, in un ambiente completamente fisiologico, rappresentano uno strumento prezioso per studiare queste malattie complesse. Inoltre questo etero-specie modello aiuta a discriminare tra i meccanismi patologici neurogene e miogenico. 3,14,15
La co-coltura qui presentato ha anche alcune limitazioni. Ad esempio, gli esperimenti immunoistochimica sulle cellule muscolari sono difficili da eseguire su questa struttura, poiché il terminale nervoso incarnata dalla espianto copre l'apparato NMJ postsinaptico. Questo sistema può anche essere utilizzato per valutare gli effetti neurotrofici o miotonica di farmaci in un sistema integrato di cultura e relativamente maturo, ma non consente ad elevata capacitàscreening, come il volume sarebbe troppo grande. Curiosamente, la omologa nervo-muscolo co-coltura con sia il nervo e componenti muscolari proveniente da solo topo o ratto non è funzionale e non riesce a causare contrazioni muscolari. Recentemente, tuttavia, omologo innervazione tra le cellule satelliti muscolari di topo e topo espianti del midollo spinale è stata eseguita con successo dalla modifica della data di raccolta degli embrioni (Callizot, Steinschneider e colleghi, risultati non pubblicati). Ulteriori progressi nella creazione di protocolli di routine per omologa co-colture potrebbe aiutare a superare la limitazione delle specie che esiste per questa tecnica di oggi.
Nonostante questi limiti, si descrive qui un metodo che consente lo studio di molti aspetti del muscolo e motoneurone fisiologia, una tecnica che non è difficile da eseguire, non richiede alcun materiale speciale e che i risultati in stabile midollo spinale espianti muscolo-co- culture che possono essere facilmente curati e Studied per molti mesi.
Alcuni aspetti del protocollo sono di particolare importanza e di bisogno di cure particolari per garantire una corretta innervazione. In primo luogo, gli embrioni di ratto devono essere tra 13 e 14 ED di età. In secondo luogo, 500.000 cellule per 35-mm piatto assicura il corretto livello di confluenza cella per facilitare l'adesione degli espianti che vengono aggiunti alle cellule muscolari immediatamente quando inizia la fusione cellulare. Infine, come sottolineato nel protocollo, l'aggiunta del mezzo dopo il deposito degli espianti sulle cellule muscolari è la parte più difficile di questa procedura deve essere eseguita con estrema cura.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il nostro lavoro è sostenuto dal Fondo Nazionale Svizzero (FNS), l'iniziativa svizzera in Systems Biology (SystemsX.ch), la Distrofia Muscolare USA Association (MDA), la Association Française contre les Myopathies (AFM), il Regno Unito mitocondriale Disease Foundation (UMDF), la Fondazione Gebert-Rüf Programma Malattie Rare (GRF), la Società svizzera per la ricerca delle malattie muscolari (SSEM / FSRMM), la Swiss Life "Jubiläumsstiftung Volksgesundheit für Forschung und medizinische", la Roche Research Foundation e l'Università di Basilea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| MEM | GIBCO, by Life Technologies | 31095 | |
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 31153 | |
| Fetal Bovine Serum | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 | |
| Insuline | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Human EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Human FGF | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Penicillin/streptomycin solution | GIBCO, by Life Technologies | 15140 |
References
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