Summary
خلايا العضلات مثقف هي نموذج غير كافية لتلخيص العضلات معصب
Abstract
خلايا عضلة الابتدائي تربيتها في aneurally أحادي الطبقة عقد نادرا لأن عفويا، في ظل عدم وجود عنصر العصب، ويقتصر تمايز الخلايا وتنشيط الخلايا العصبية الحركية مفقود 1. هذه القيود تعوق الدراسة في المختبر من العديد من الأمراض العصبية والعضلية في خلايا العضلات مثقف. الأهم من ذلك، يمكن التغلب على المعوقات التجريبية من monolayered، مثقف خلايا العضلات بواسطة الغدد العرقية وظيفية من myofibers مع explants الحبل الشوكي في الثقافات المشتركة.
هنا، نعرض مختلف الخطوات اللازمة لتحقيق فعال وتعصيب السليم للخلايا عضلة الأولية، مما أدى إلى إكمال التفاضل والألياف الانكماش وفقا للطريقة التي وضعتها Askanas 2. للقيام بذلك، وخلايا العضلات شارك في تربيتها مع explants الحبل الشوكي لأجنة الفئران في ED 13.5، مع العقد الجذرية الظهرية لا تزال تعلق لشرائح الحبل الشوكي. بعد بضعة أيام، في عضلة فايbers بدء العقد وتصبح في نهاية المطاف عبر مخططة من خلال تعصيب بواسطة neurites الوظيفية تتوقع من explants النخاع الشوكي الذي يربط إلى خلايا العضلات. يمكن الحفاظ على هذا الهيكل لعدة شهور، وذلك ببساطة عن طريق التبادل المنتظم للثقافة المتوسط.
تطبيقات هذا أداة لا تقدر بثمن هي عديدة، كما أنه يمثل نموذج وظيفي لتحاليل متعددة التخصصات للتنمية البشرية وتعصيب العضلات. في الواقع، مجموعة كاملة من جديد تركيب الموصل العصبي العضلي يحدث في طبق والثقافة، والسماح لقياس سهولة العديد من المعلمات في كل خطوة، في سياق الأساسية والفسيولوجية.
ويمكن لمجرد ذكر بعض الأمثلة، الجينومية و / أو دراسات البروتين أن يؤديها بشكل مباشر على الثقافات المشتركة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن الآثار قبل وبعد متشابك، على وجه التحديد وبشكل منفصل المقررة في الوصل العصبي العضلي، لأن كلا من مكونات تأتي من مختلف الأنواع،الفئران والبشر على التوالي،. ويمكن أيضا أن العصب العضلات المشاركة في ثقافة يتعين القيام بها مع الخلايا العضلية البشرية المعزولة من المرضى الذين يعانون من الأمراض العصبية والعضلية في العضلات أو 3، وبالتالي يمكن أن تستخدم كأداة لفحص المخدرات مرشح. أخيرا، ليس هناك حاجة إلى معدات خاصة ولكن منتظمة مرفق BSL2 لإعادة إنتاج وحدة محرك وظيفي في صحن الثقافة. هذا الأسلوب هو وبالتالي قيمة لعضلة على حد سواء، فضلا عن الأوساط البحثية العصبي العضلي للدراسات الفسيولوجية والميكانيكية وظيفة الاعصاب، في سياق طبيعي والمرض.
Protocol
1. إعداد الإنسان الأساسية العضلات خلية ثقافة
- إنشاء خلية عضلة الإنسان الثقافات وفقا لتقنية explantation إعادة explantation-4. أولا، عدم إزالة الأنسجة العضلية من الخزعات. ثم، تضمين 1 explants مم 3 في عضلة خثرة من البلازما، والذي يسمح الليفية للخروج من explants.
- يتم نقل explants جزءا لا يتجزأ من على طبق من البلازما الجيلاتين المغلفة وتركها لتنمو في المتوسط النمو الطبيعي (MEM تستكمل مع متوسط 25٪ 199، 10٪ الجنين المصل البقري [FBS]، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، 10 ميكروغرام / مل الأنسولين، 10 نانوغرام / مل الإنسان عامل نمو البشرة [EGF]، 12.5 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الإنسان [جمعية جيل المستقبل]) في أحادي الطبقة. الخلايا التي تخرج من explants في ظل هذه الظروف هي خلايا العضلات. وهذه الخلايا تستمر في النمو في أحادي الطبقة بعد إزالة explants.
- ثقافة الخلايا aneurally على 0،1 لوحات الجيلاتين المغلفة٪ في متوسط النمو الطبيعي. يمكن للخلايا أن يكونمثقف aneurally وتوسيعها حسب الحاجة. فمن الأفضل أن تستخدم خلايا العضلات في ممر بين 3 و 8 لأداء المشترك الثقافات. من المهم جدا أن يعصب myotubes الشباب، وبعد هذه المرحلة، شارك في والثقافات وارتفاع مخاطر الفشل. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن myotubes لا تكون كبيرة جدا وسميكة جدا.
- قبل يومين من يخطط للتعصيب، لوحة خلايا العضلات على 35 مم أطباق زراعة الأنسجة (أو 6 لوحات أيضا) في مناطق ذات كثافة من 500000 خلية لكل طبق في متوسط النمو الطبيعي. في ذلك الكثافة، كانت الخلايا في confluency المناسب لبدء الاندماج في اليوم التالي، وتعصيب لاحق من اليوم بعد ذلك. باستخدام هذه الظروف، وmyotubes في مرحلة حق لتعصيب الأمثل واللاحقة وبالتالي تقلص الألياف.
- في اليوم التالي، بدلا من متوسط النمو الطبيعي مع وسيلة اندماج تتألف من MEM تستكمل مع متوسط 25٪ 199، 5٪ FBS، الانسولين 10 ميكروغرام / مل و 1٪ من البنسلين / الستربتومايسين عقار.
2. Isolati على من الفأر الجنينية Explants الحبل الشوكي
يتم تنفيذ الإجراء بأكمله لعزل explants الحبل الشوكي تحت المجهر مجهر، في الحل هانك في سولت المتوازن (HBSS، Gibco / إينفيتروجن المرجع 14170) التي تحتوي على 10٪ الجنين مصل بقري (FBS).
- فمن الأهمية بمكان أن أجنة الفئران ما بين 13 و 14 ED كمرحلة التنمية المختلفة من شأنه أن يعرض للخطر الإجراء بالكامل. تضحية امرأة حامل مع CO 2 وجمع سلسلة جنين كامل في المتوسط HBSS. عزل كل جنين والقضاء على راس منهم للقتل الرحيم.
- تشريح الحبل الشوكي من جنين وباقي الجسم في قطعة واحدة وإزالة العضلات المحيطة بها، والنسيج الضام. نكون حذرين للغاية للحفاظ على ganglions الجذر الظهري (DRGs) تعلق على الحبل الشوكي لضمان تعصيب وظيفي.
- كل شريحة الحبل الشوكي عرضيا بطريقة كل يزدرع يحتوي على الأقل 2 DRG مرفقة به (explants من 1 ملم 3).
- إزالة المتوسطة الانصهار في ثقافة الخلية العضلية، وترك طبقة رقيقة من المتوسط على أحادي الطبقة.
- وضع explants بعناية على طبقة الخلايا العضلية، وخمسة explants متباعدة بالتساوي في صحن 35 ملم.
- إضافة ببطء شديد، وانخفاض متوسط الحكمة الانصهار، وعلى كل ازدراع. فمن الضروري إضافة المتوسطة لخلايا العضلات على قيد الحياة، ولكن ليس كثيرا للسماح للexplants الالتزام الأولى، واجراء اتصالات مع الخلايا. إذا لا يتم إضافة المتوسطة بشكل صحيح (أيضا بقوة أو المتوسطة أكثر من اللازم)، فإن explants تطفو، وسوف تفشل في عصب خلايا العضلات.
- وبمجرد أن تبدأ explants إلى الالتزام بها وتتصدر المتوسطة الانصهار إلى 2 مل لكل طبق 35 ملم، ووضع أطباق بعناية جدا العودة الى الحاضنة.
4. صيانة غيروي العصب العضلات الثقافات المشارك
- تغيير وسيلة اندماج مرتين في الأسبوع.
في أقرب وقت ممكن بعد يومين من تعصيب، فمن الممكن أن نرى neurites الخارجة من كل ازدراع وإقامة اتصالات مع خلايا العضلات، ممثلا في هياكل تشبه الازرار (الشكل رقم 1).
في أقرب وقت 4-6 أيام بعد تعصيب، فإن بعض الألياف الفردية تبدأ في العقد.
وانقباضات تستمر لعدة أشهر، واصلت ببساطة عن طريق تغيير ثقافة المتوسط مرتين في الأسبوع.
بعد حوالي 2 أسابيع، ويزدرع الحبل الشوكي نفسه ينحط، ولكن يتم الحفاظ على تعصيب. هذا أمر طبيعي. طبقة رقيقة من عنصر العصب يبقى على سطح عضلة طبقة الخلية. هذه الشبكة العصبية كافيا للحفاظ على وظيفة من وحدة السيارات.
إذا كان explants تطفو على المدى المتوسط بعد يوم من تعصيب، فإنها لن تلتزم. هذا يحدث عندما طبقة الخلايا العضلية هييضاف ليس متكدسة بما فيه الكفاية، أو عندما يكون متوسط تقريبا أيضا. في بعض الأحيان، وسوف تلتزم يزدرع neurites لكن لا تظهر. وهذا هو الأرجح بسبب عدم وجود DRG المرتبطة به. في هذه الحالة كذلك، لن تعصيب تنشأ. التلاعب في أطباق بعناية شديدة في الأسبوع الأول، كما يمكن فصل explants لا يزال بسهولة. لتبادل وسائل الاعلام الانصهار، وإضافة السائل التسرب من الحكمة مع سرعة الحد الأدنى لتجنب انفصال الخلية.
الشكل 1. الحبل الشوكي explants العضلات الخلية شارك في الثقافات من يوم 1 إلى يوم 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وهناك أداة الفسيولوجية في المختبر لدراسة العضلات وظيفة الخلية في السياق الطبيعي والمرضي هو أعلى من الفائدة للmyologists، وذلك لأن مزارع الخلايا العضلية عادة لا تلخص أهمية خلايا متعددة واتصالات من نوع الخلية. إضافة تنقية الخلايا العصبية الحركية إلى خلايا العضلات ليست كافية لتحقيق وحدة محرك وظيفي منذ مطلوب من وجود خلايا شوان لتعصيب لتكون فعالة (5) وليس طبوغرافيا (3D + التوزيع الخاصة) ذات الصلة البروتوكول، المذكورة هنا قد استخدمت بنجاح لتأسيس خلايا العضلات معصب في المختبر، والنتائج في نضوج NMJ الكاملة التي يمكن تقييمها بسهولة.
نماذج الفئران متاحة الآن للكثير من الأمراض العصبية والعضلية. للأسف، وتقتصر العديد من هذه النماذج من حيث ترجمة لهذا المرض في المرضى من البشر، على سبيل المثال نماذج الماوس لضمور العضلات الشوكي، دوشينالحثل العضلي أو التصلب الجانبي. ويتسبب ضمور العضلات الشوكي نتيجة تحور في جين SMN1، والتي في جزء منها ويمكن التخفيف من وجود جين SMN الثاني في الجينوم البشري 6. في المقابل، فإن جينوم الفئران يحتوي فقط على جين واحد لشبكة الإدارة العليا، وحذفها قاتلة embryonically 7. وبالتالي، كان من أجل تطوير الفأر الشوكي نماذج ضمور العضلات، وعرض بشكل مصطنع من حقوق الإنسان SMN2 نسخة في الفئران خروج المغلوب SMN 8،9. هذه الحيوانات لا تزال تمثل أقرب نموذج لعلم الامراض الوراثية البشرية، ولكن النمط الظاهري لوحظ في تلك الفئران ويرجع ذلك إلى التعبير عن جينة SMN2 أن الفئران عادة لا تعبر عن 10. في حالة ضمور العضلات دوشين، الفئران MDX لديهم جين مماثل لdystrophin تحور المرضى من البشر، ولكن النتيجة هي أقل حدة مقارنة مع الأعراض التي لوحظت في مرضى 11. نموذج الفأر الأكثر استخداما لamyotrophiج التصلب الجانبي، والفئران SOD1، حتى الآن بخيبة أمل في الرؤى الكاشفة في آليات المرض والطرق العلاجية 12،13. ولذلك، الحبل الشوكي explants العضلات خلية مشتركة لدراسة الثقافات وظيفة، والخصائص الجينية والبروتين في العضلات القادمة من المرضى، في إطار الفسيولوجية تماما، تمثل أداة لا تقدر بثمن لدراسة الأمراض المعقدة من هذا القبيل. وعلاوة على هذا نموذج مغاير الأنواع يساعد على التمييز بين الآليات المرضية العصبية والمنشأ العضلي. 3،14،15
شارك في ثقافة المعروضة هنا أيضا بعض القيود. على سبيل المثال، والتجارب المناعية على خلايا عضلة يصعب أداؤها على هذا الهيكل، وذلك لأن محطة العصبية التي تجسدها يزدرع يغطي جهاز NMJ بعد المشبكي. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا النظام لتقييم آثار عصبية أو التأتر المخدرات في نظام ثقافة متكاملة وناضجة نسبيا، ولكنها لا تسمح ليست عالية الإنتاجيةالفرز، كما أن حجم تكون بعيدة كبيرة جدا. الغريب، ومثلي العصبية للعضلات شارك في الثقافة مع كل من الأعصاب والعضلات مكونات يأتي فقط من فأر أو جرذ ليست وظيفية، وفشل أن يؤدي إلى تقلصات العضلات. لكن في الآونة الأخيرة، تم تعصيب مثلي بين خلايا فأر العضلات الأقمار الصناعية وexplants الماوس الحبل الشوكي أجريت بنجاح من قبل التعديل من تاريخ حصاد الأجنة (Callizot، Steinschneider وزملاؤه، ونتائج غير منشورة). ربما مزيد من التقدم في وضع بروتوكولات الروتيني لمثلي المشترك الثقافات يساعد في التغلب على قيود الأنواع التي يوجد لهذه التقنية اليوم.
على الرغم من هذه القيود، ونحن هنا وصف طريقة التي تمكن من دراسة جوانب كثيرة من العضلات والخلايا العصبية الحركية علم وظائف الأعضاء، وهو الأسلوب الذي ليس من الصعب القيام بها، لا تتطلب أي مواد الخاصة والنتائج التي في الحبل الشوكي مستقر explants العضلات المشترك الثقافات التي يمكن بسهولة أن الحفاظ على وstudieد لعدة أشهر.
بعض جوانب بروتوكول لهما أهمية خاصة وتحتاج إلى عناية خاصة لضمان وجود تعصيب السليم. الأول، للأجنة الفئران يجب أن تكون بين 13 و 14 ED من العمر. الثانية، 500000 خلية لكل 35 مم طبق يضمن المستوى الصحيح للالتقاء خلية لتسهيل انضمام لexplants التي تمت إضافتها إلى خلايا العضلات عندما يبدأ فورا انصهار الخلية. أخيرا، كما أكد في البروتوكول، إضافة للمتوسطة بعد إيداع explants على خلايا العضلات هو أصعب جزء من هذا الإجراء، وينبغي أن يقوم بعناية فائقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا ما يكشف.
Acknowledgments
ويدعم عملنا من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (SNF)، والمبادرة السويسرية في بيولوجيا الأنظمة (SystemsX.ch)، والضمور العضلي جمعية الولايات المتحدة الأمريكية (نجمة داود الحمراء)، والفرنسية جمعية مناهضة ليه الاعتلالات العضلية (فؤاد)، والميتوكوندريا المتحدة مرض مؤسسة (UMDF)، وغيبرت في الجبهة المتحدة الثورية مؤسسة برنامج الأمراض النادرة (GRF)، والجمعية السويسرية للأبحاث في أمراض العضلات (SSEM / FSRMM)، والسويسري ايف "Jubiläumsstiftung FÜR Volksgesundheit اوند medizinische Forschung" للأبحاث روش المؤسسة والجامعة من بازل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| MEM | GIBCO, by Life Technologies | 31095 | |
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 31153 | |
| Fetal Bovine Serum | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 | |
| Insuline | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Human EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Human FGF | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Penicillin/streptomycin solution | GIBCO, by Life Technologies | 15140 |
References
- Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions. Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).
- Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation. J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).
- Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy. Lancet. 345, 694-695 (1995).
- Askanas, V., Engel, W. K. A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture. Neurology. 25, 58-67 (1975).
- Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro. Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).
- Lefebvre, S. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell. 80, 155-165 (1995).
- Schrank, B. Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).
- Hsieh-Li, H. M. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).
- Monani, U. R. The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).
- Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).
- Durbeej, M., Campbell, K. P. Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models. 12, 349-361 (2002).
- Schnabel, J. Neuroscience: Standard model. Nature. 454, 682-685 (2008).
- Benatar, M. Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS. Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).
- Dorchies, O. M. Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system. Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).
- McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies. Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).
