Summary
体外培养肌细胞是不够的模型来概括神经支配的肌肉
Abstract
人类的主要肌肉细胞单层培养aneurally很少自发的，因为在一个神经组件的情况下，细胞分化是有限的和运动神经元的刺激，失踪1人的合同。这些限制妨碍在体外培养的肌肉细胞中的许多神经肌肉疾病的研究。重要的是，单层，培养肌细胞的实验限制是可以克服的功能神经支配的肌纤维与脊髓外植体，在联合培养。
在这里，我们实现了高效，正确支配人类的主要肌肉细胞所需的不同步骤，根据Askanas 2开发的方法，导致完成分化和纤维收缩。这样做，肌肉细胞共同培养大鼠胚胎脊髓植13.5海关，背根节还连着脊髓切片。几天后，肌肉FIBERS开始合同，并最终成为通过支配跨横纹肌从外植体，连接到肌肉细胞的脊髓投射功能的突起。这种结构可以维持很多个月，只需定期交流培养基。
这宝贵的工具的应用有很多，因为它代表了一种对人体肌肉的发展和支配的多学科分析的功能模型。事实上，一个完整的从头神经肌肉交界处安装发生在培养皿中，让每一步，从根本上和生理范围内，一个容易的多参数测量。
只是举出几个例子，基因和/或蛋白质的研究，可以直接进行联合培养。此外，前和突触后的效果可以明确，并分别在神经肌肉接头处评估，从不同的物种，因为这两个组件，老鼠和人，分别为。共培养神经肌肉也可以从肌肉或神经肌肉疾病患者分离出人体肌肉细胞进行，因而可以作为候选药物的筛选工具。最后，没有特殊的设备，但需要定期BSL2设施重现功能的运动单位在培养皿。因此，这种方法是有价值的肌肉以及肌肉神经肌肉功能的生理和机理研究研究社区，在正常和疾病的情况下。
Protocol
1。小学人体肌肉细胞培养制备
- 建立人体肌肉细胞培养根据对explantation重新explantation的技术4。首先，从非肌肉组织活检的。然后，嵌入在血浆凝块，这使得从外植体成纤维细胞出现1毫米3肌肉植。
- 嵌入植体转入明胶等离子涂层菜，让他们在正常生长介质中成长（的MEM 25％，中型199，10％小牛血清[胎牛血清，1％青霉素/链霉素，10μg/ ml的胰岛素，补充10 ng / ml的重组人表皮生长因子，表皮生长因子]，12.5 ng / ml的人类成纤维细胞生长因子[成纤维细胞生长因子）在单层。出现在这些条件下，从植细胞，肌肉细胞。这些细胞外植体取出后，将继续增长单层。
- 文化aneurally 0.1％明胶涂层板在正常生长介质的细胞。这些细胞可以aneurally培养和扩增的需要。最好是在3日和8之间的通道使用的肌肉细胞进行联合培养。这是至关重要的支配年轻的肌管;这一点后，共同的文化有一个失败的高风险。此外，肌管不宜过大，过厚。
- 35毫米组织培养皿密度每盘50细胞的正常生长培养基（或6孔板）支配计划的前两天，盘上的肌肉细胞。在密度，细胞在适当的汇合于翌日开始融合，一天之后，随后的支配。利用这些条件，肌管是最佳的支配和纤维收缩，因此后续在合适的阶段。
- 第二天，组成一个融合的MEM培养基辅以25％，中型199，5％胎牛血清，10μg/ ml的胰岛素，1％青霉素/替换中的正常生长介质。
2。 isolati大鼠胚胎脊髓植
在双目显微镜下进行隔离脊髓外植体的整个过程，在汉克的含10％胎牛血清（FBS），平衡盐溶液（HBSS中，GIBCO / Invitrogen公司的14170号）。
- 大鼠胚胎ED 13日和14日之间有不同的发展阶段，将危及整个过程，这是至关重要的。牺牲与CO 2的怀孕妇女，并收集在HBSS中型全胚胎链。隔离每个胚胎和安乐死斩首。
- 在一块休息的身体从解剖胚胎脊髓和消除周围的肌肉和结缔组织。必须非常小心，以保持连接到脊髓，以确保功能的神经支配的背根神经节（病种付费）。
- 每个脊髓横向切片的方式，每个外植体包含至少2个（1毫米3植）连接到它的背根神经节。
- 去除肌肉细胞培养融合的媒介，留在单层的中型精细层。
- 将外植体对肌肉细胞层，每35毫米盘5个均匀分布的植仔细。
- 新增很缓慢，下降到每个外植体，融合媒介明智的。这是需要添加肌肉细胞的媒介生存，但不能太多，让植坚持先与细胞接触。如果媒体不加正确（太强烈或过多介质），外植体漂浮，将无法支配肌肉细胞。
- 一旦植开始坚持，顶部的融合中等至2毫升每35毫米的菜，放菜，非常仔细地进入孵化器。
4。异种神经肌肉文化的维护
- 改变的融合中每周两次。
只要两天后的支配，这是可以看到突起，每个外植体和新兴的按钮状结构（ 图1）所代表的肌肉细胞，建立联系。
早4-6天的支配后，个别纤维将开始合同。
宫缩持续许多个月，维持简单地通过改变培养基每周两次。
约2周后，脊髓外植体本身的退化，但保守的支配。这是正常的。罚款的神经元件层停留在表面的肌肉细胞层。这种神经网络是不足以维持电机单元的功能。
如果外植体漂浮在中期的一天支配后，他们将永远坚持。这种情况发生时肌肉细胞层没有充分融合，或当介质添加过于粗略。有时，会出现植坚持，但没有突起。这可能是由于缺乏连接到它的背根神经节。的支配，以及在这种情况下，将不能成立。操纵的菜肴，非常仔细的第一周，为外植体仍然可以容易分离。交换的融合媒体，用最小的速度增加液滴明智地避免细胞脱落。
图1。脊髓植肌细胞培养至15天从第一天的合作。
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Discussion
生理体外的工具来研究肌肉细胞的功能，在正常和病理情况下是最高的myologists的利益，因为肌肉细胞培养不重述多种细胞和细胞类型连接的重要性的。增加肌肉细胞纯化的运动神经元是不够的，因为雪旺氏细胞的存在是必需的支配有效率5，它不是拓扑（3D +特约经销）有关的协议描述这里实现功能的运动单位被成功地用于建立神经支配的肌肉细胞， 在体外和在一个完整的NMJ成熟，可以很容易地评估结果。
现已为许多神经肌肉疾病小鼠模型。不幸的是，许多这些模型是有限的翻译在人类患者的疾病，例如脊髓性肌萎缩症的小鼠模型，杜氏肌营养不良症或肌萎缩性侧索硬化症。脊肌萎缩症是由SMN1基因，其中部分可以存在第二SMN基因在人类基因组6减轻突变引起的。与此相反，小鼠基因组包含的SMN唯一的一个基因，将其删除是embryonically致死7。因此，为了开发鼠标脊肌萎缩症模型，人类SMN2基因拷贝被人为引入的SMN基因剔除小鼠8,9。这些动物仍然代表最接近人类病理学的遗传模型，但在这些小鼠中观察到的表型是由于SMN2基因表达的小鼠通常不表达10。在杜氏肌营养不良症的情况下，mdx小鼠有一个突变的dystrophin基因与人类患者类似，但比11例观察症状，结果是严重的要少得多。使用最广泛的为amyotrophi的小鼠模型ç侧索硬化症，SOD1的老鼠，到目前为止，在暴露到发病机制和治疗方法12,13见解感到失望。因此，脊髓植肌细胞共培养研究的功能，肌肉的基因组和蛋白质组从病人的特点，在一个完全生理的设置，代表一个宝贵的工具来研究这种复杂的疾病。此外，这种异质种群模型有助于区分神经和肌的病理机制。3,14,15
这里提出的共同文化也有一定的局限性。例如，对肌肉细胞的免疫组织化学实验是难以执行，这种结构上，外植体所体现占地面积因为神经末梢突触后NMJ器具。该系统还可以用于集成和相对成熟的文化系统，以评估药物的神经营养或强直性影响，但它不允许高通量筛选，体积将远远太大。奇怪的是，同源神经肌肉只小鼠或大鼠的神经和肌肉组成的联合培养是不是功能和失败，导致肌肉收缩。然而最近，同源鼠标卫星肌肉细胞和小鼠脊髓植支配已成功地进行胚胎收获日期的修改（Callizot中，Steinschneider和他的同事，结果未发表）。在建立例行同源联合培养协议的进一步进展可能有助于克服这种技术目前存在的物种限制。
尽管有这些限制，我们在这里描述的方法，使肌肉和运动神经生理学研究的许多方面，这是不是难以执行的技术，不需要任何特殊的材料和稳定的脊髓植肌肉共同结果文化可以很容易地保持和科仪d为许多个月。
该协议的某些方面是特别重要的，需要特别的照顾，以确保适当的支配。首先，大鼠胚胎有13至14岁的海关。其次，每35毫米盘50细胞可确保正确的水平，以促进细胞融合细胞融合开始时，立即被添加到肌肉细胞植坚持。最后，在协议中强调，肌肉细胞植存款后中等除了在此过程中最困难的部分，应格外小心执行。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
支持我们的工作是由瑞士国家科学基金会（民阵），瑞士在系统生物学（SystemsX.ch），美国肌肉萎缩症协会（MDA）含量，协会法国驳LES肌病（AFM），美国线粒体疾病基金会倡议（UMDF的），Gebert联阵基金会罕见疾病计划（GRF），瑞士肌肉疾病（SSEM / FSRMM），瑞士人寿“Jubiläumsstiftung献给Volksgesundheit和medizinische Forschung”，罗氏研究基金会和大学的研究学会巴塞尔。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| MEM | GIBCO, by Life Technologies | 31095 | |
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 31153 | |
| Fetal Bovine Serum | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 | |
| Insuline | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Human EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Human FGF | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Penicillin/streptomycin solution | GIBCO, by Life Technologies | 15140 |
References
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