Summary
Dyrkede muskelceller er en utilstrækkelig model til rekapitulere innerverede muskel
Abstract
Humane primære muskelceller dyrket aneurally i monolag sjældent kontrakt spontant fordi, i fravær af en nerve komponent, celledifferentiering begrænset og motorisk neuron stimulering mangler en. Disse begrænsninger hæmmer in vitro-undersøgelse af mange neuromuskulære sygdomme i dyrkede muskelceller. Vigtigt, kan de eksperimentelle begrænsninger monolayered, dyrkede muskelceller overvindes ved funktionel innervation af myofibre med rygmarv eksplantater i co-kulturer.
Her viser vi de forskellige trin, der kræves for at opnå en effektiv og korrekt innervation af humane primære muskelceller, hvilket fører til fuldstændig differentiering og fiber kontraktion ifølge fremgangsmåden udviklet af Askanas 2. At gøre dette, er muskelceller co-dyrket med rygmarvsneuroner eksplantater af rotteembryoer ved ED 13,5, med den dorsale rodganglier stadig fastgjort til rygmarven skiver. Efter et par dage, fi musklenmedlemmer begynder at kontrakt og bliver til sidst på tværs af tværstribede gennem innervation af funktionelle neurites fremspringende fra rygmarven eksplantater, der forbinder til muskelceller. Denne struktur kan opretholdes i mange måneder, simpelthen ved regelmæssig udskiftning af dyrkningsmediet.
De anvendelser af denne uvurderligt værktøj er mange, da den udgør en funktionel model for tværfaglige analyser af menneskelig muskel udvikling og innervation. Faktisk forekommer en fuldstændig de novo neuromuskulære junction installation i en dyrkningsskål, der tillader en nem måling af mange parametre ved hvert trin i en grundlæggende og fysiologisk sammenhæng.
Blot for at nævne et par eksempler, genomiske og / eller proteom undersøgelser kan udføres direkte på co-kulturer. Endvidere kan præ-og post-synaptiske virkninger specifikt og separat vurderet ved den neuromuskulære junction, fordi begge komponenter kommer fra forskellige arter,rotte og human hhv. Nerven-muskel co-kultur kan også udføres med humane muskelceller isoleret fra patienter, der lider af muskelvæv eller neuromuskulære sygdomme 3, og kan således anvendes som et screeningsværktøj til lægemiddelkandidater. Endelig er ikke særligt udstyr, men en regulær BSL2 facilitet bruges til at danne en funktionel motorenheden i en kultur fad. Denne metode er således værdifuldt for både muskler samt de neuromuskulære forskningsmiljøer for fysiologiske og mekanistiske studier af neuromuskulære funktion, i en normal og sygdom sammenhæng.
Protocol
1. Fremstillinq af den primære human muskel Cell Culture
- Etabler de menneskelige muskel cellekulturer efter explantation-re-explantation teknik 4. Først fjerne ikke-muskelvæv fra biopsier. Derefter indkapsle 1 mM 3 muskel eksplantater i et koagel af plasma, som tillader fibroblaster kan udledes af de eksplantater.
- De indlejrede eksplantater overføres til en plasma-gelatine overtrukket skål og lod dem vokse i normalt vækstmedium (MEM suppleret med 25% medium 199, 10% føtalt bovint serum [FBS], 1% penicillin / streptomycin, 10 ug / ml insulin, 10 ng / ml human epidermal vækstfaktor [EGF], 12,5 ng / ml human fibroblast-vækstfaktor [FGF]) i et monolag. De celler, der opstår fra eksplantaterne under disse betingelser er muskelceller. Disse celler vil fortsætte med at vokse i et monolag efter fjernelse af eksplantater.
- Dyrkning af cellerne aneurally på 0,1% gelatine-overtrukne plader i normalt vækstmedium. Cellerne kan væreaneurally dyrket og amplificeret efter behov. Det er bedre at anvende muskelceller ved en passage mellem 3 og 8 til udførelse af co-kulturer. Det er vigtigt at innerverer unge muskelrør; efter dette tidspunkt, har de cokulturer en høj risiko for at fejle. Endvidere bør myorør ikke være for stor og for tyk.
- To dage før innervation er planlagt, plade muskelceller på 35 mm vævskulturskåle (eller plader med 6 brønde) ved en densitet på 500.000 celler pr skål i normalt vækstmedium. Ved denne densitet, er cellerne i den korrekte konfluens at starte fusion på den følgende dag, og efterfølgende innervation dagen efter. Ved hjælp af disse betingelser, de muskelrør er på det rigtige tidspunkt for optimal innervation og dermed efterfølgende fiber sammentrækning.
- Den næste dag, erstatter den normale vækstmedium med fusionsmedium bestående af MEM suppleret med 25% medium 199, 5% FBS, 10 ug / ml insulin og 1% penicillin / streptomycin.
2. Isolati på fra rotte Embryoniske rygmarv Eksplantater
Hele proceduren til isolering rygmarv eksplantaterne udføres under et binokulært mikroskop i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, Gibco / Invitrogen ref 14.170) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS).
- Det er afgørende, at de rotteembryoer er mellem ED 13 og 14 som en anden udviklingsfase ville bringe hele proceduren. Sacrifice en gravid kvinde med CO 2 og samle hele embryo kæden i HBSS medium. Isolere hvert embryo og halshugge dem for euthanasi.
- Skær embryo rygmarven fra resten af kroppen i ét stykke og fjerne omkringliggende muskler og bindevæv. Vær meget omhyggelig med at holde de dorsale ganglier (DRG) er knyttet til rygmarven for at sikre funktionel innervation.
- Skive hver rygmarv tværs på en sådan måde, at hvert eksplantat indeholder mindst to DRG fastgjort til den (eksplantater af 1 mm3).
- Fjerne fusionsmedium på musklen cellekultur, hvilket efterlader et fint lag af medium på monolagets.
- Placer eksplantaterne forsigtigt på muskel cellelag, fem jævnt fordelte eksplantaterne per 35 mm skål.
- Tilsæt meget langsomt, drop klog, fusion medium på hvert eksplantat. Det er nødvendigt at tilføje medium for muskelceller at overleve, men ikke for meget til at tillade eksplantater til at adhærere første og komme i kontakt med cellerne. Hvis mediet ikke er tilføjet korrekt (for stærkt eller for meget medium), vil de eksplantaterne flyde og vil ikke innerverer muskelceller.
- Når eksplantaterne begynder at klæbe, toppen fusionen mediet til 2 ml pr 35 mm skål, og læg de retter meget forsigtigt tilbage i kuvøsen.
4. Vedligeholdelse af de heterologe Nerve-muskel cokulturer
- Ændre fusionsmedium to gange om ugen.
Så snart to dage efter innervation, er det muligt at se neuritter nye fra hvert eksplantat og etablere kontakt med muskelceller, repræsenteret ved det knaplignende strukturer (fig. 1).
Så tidligt som 4-6 dage efter innervation, vil nogle enkelte fibre begynder at falde.
Kontraktionerne vare ved i mange måneder, opretholdt ved simpelthen at ændre dyrkningsmediet to gange om ugen.
Efter cirka 2 uger, degenererer rygmarven eksplantatet sig selv, men innervation er bevaret. Dette er normalt. Et tyndt lag af nerve komponent forbliver på overfladen af muskelcellen lag. Dette nervøs netværk er tilstrækkelig til at opretholde funktionalitet motorenheden.
Hvis eksplantaterne flyder i mediet dagen efter innervation, vil de aldrig følge. Dette sker, når musklen cellelag erikke tilstrækkeligt konfluent, eller når mediet tilsættes for ca. Nogle gange vil de eksplantering klæber men ingen neuritter opstår. Dette er sandsynligvis på grund af manglen på DRG knyttet til den. I så fald så godt, vil innervation ikke blive etableret. Manipulere retter meget omhyggeligt den første uge, da eksplantaterne stadig kan løsne nemt. At udskifte fusion medierne, tilføjer flydende dråbevist med en minimal hastighed for at undgå celle løsrivelse.
Figur 1. Rygmarv eksplantater-muskelcelle-cokulturer fra dag 1 til dag 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En fysiologisk in vitro værktøj til at studere muskelcelle funktion i normal og patologisk forbindelse er af stor interesse for myologists, fordi musklerne cellekulturer normalt ikke gentage betydningen af multiple celler og celle-typen forbindelser. Tilsætning af renset motoriske neuroner til muskelceller, er ikke tilstrækkeligt til at opnå en funktionel motorenhed, eftersom tilstedeværelsen af Schwann-celler er nødvendig for innervation at være effektiv 5 og det er ikke topologisk (3D + særlig fordeling) relevant Protokollen beskrevet her er blevet anvendt med succes til at etablere innerverede muskelceller in vitro, og resulterer i en komplet NMJ modning, som let kan vurderes.
Murine modeller er nu tilgængelige i mange neuromuskulære sygdomme. Uheldigvis er mange af disse modeller er begrænset med hensyn til oversættelse af sygdommen hos humane patienter, for eksempel musemodeller for spinal muskelatrofi, Duchennemuskulær dystrofi eller amyotrofisk lateral sklerose. Spinal muskelatrofi skyldes en mutation i SMN1 genet, som delvist kan afbødes ved tilstedeværelsen af et andet SMN genet i det humane genom 6. I modsætning hertil indeholder mus genomet kun et gen for SMN, og deletion er embryonically letal 7. Således, for at udvikle muse spinal muskelatrofi modeller, blev en human SMN2 kopi kunstigt indført i SMN-knockout-mus 8,9. Disse dyr er stadig den nærmeste genetisk model for den humane patologi, men fænotypen observeret i disse mus skyldes ekspression af et SMN2 gen, mus normalt ikke udtrykker 10. I tilfælde af Duchennes muskeldystrofi, har mdx-mus et muteret dystrofin-gen svarende til humane patienter, men resultatet er meget mindre udtalt sammenlignet med de symptomer, der observeres hos patienter 11. Den mest almindeligt anvendte musemodel for amyotrophic lateral sklerose, de SOD1 musene hidtil skuffet i afslørende indsigt i sygdomsmekanismer og terapeutiske tilgange 12,13. Derfor rygmarv eksplantater-muskelcelle co-kulturer for at undersøge funktionen genomiske og proteomik egenskaber musklen fra patienter, i en fuldstændig fysiologisk indstilling et uvurderligt værktøj til at studere disse komplekse sygdomme repræsenterer. Desuden denne hetero-art model hjælper til at skelne mellem neurogene og myogene patologiske mekanismer. 3,14,15
Den co-kultur præsenteres her også har visse begrænsninger. For eksempel er immunhistokemi eksperimenter på muskelceller vanskelig at udføre på denne struktur, fordi den nerveterminalen udformet af eksplantatet omfatter postsynaptiske NMJ apparatet. Dette system kan også anvendes til at vurdere de neurotrofiske eller myotonisk virkninger af lægemidler i en integreret og relativt modne kultur-systemet, men ikke tillader høj-throughputscreening, da mængden ville være alt for stor. Mærkværdigvis den homologe nerve-muskel co-kultur med både nerve-og muskelceller komponenter kommer kun fra mus eller rotte, er ikke funktionelle og ikke at resultere i muskelkontraktioner. Nylig har imidlertid homolog innervation mellem muse satellit muskelceller og muse rygmarv eksplanteret blevet udført ved modifikation af den dato embryo høst (Callizot, Steinschneider og kolleger, upublicerede resultater). Yderligere fremskridt med oprettelse af rutinemæssige protokoller for homologe co-kulturer kan hjælpe til at overvinde de arter, begrænsning, der eksisterer for denne teknik i dag.
På trods af disse begrænsninger, beskriver vi her en fremgangsmåde, der muliggør undersøgelse af mange aspekter af muskel-og motorisk neuron fysiologi, en teknik, som ikke er vanskelig at udføre, kræver ikke nogen speciel materiale, og at resultaterne i stabil rygmarv eksplantater-muskel co- kulturer, der let kan opretholdes, og studieresd for mange måneder.
Visse aspekter ved protokollen er af særlig betydning og har behov for særlig pleje for at sikre en korrekt innervation. Dels de rotteembryoer være mellem 13 og 14 ED alderen. Sekund, 500.000 celler pr 35 mm skål sikrer korrekte niveau for cellulær konfluens for at lette vedhæftning af de eksplantater, der tilsættes til muskelceller samme når cellefusion starter. Endelig, som det understreges i protokollen, tilføjelsen af mediet efter deponeringen af eksplantaterne på muskelcellerne er den sværeste del af denne procedure og bør udføres med største omhu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vores arbejde er støttet af den schweiziske National Science Foundation (SNF), det schweiziske initiativ i Systembiologi (SystemsX.ch), den Muskelsvindfonden Association USA (MDA), de Association Française contre les Myopati (AFM), De Forenede mitochondrial sygdom Foundation (umdf), den Gebert-Ruf Fonden Sjældne sygdomme Programme (GRF), den schweiziske Selskab for Forskning i de muskelsygdomme (SSEM / FSRMM), den schweiziske Life "Jubiläumsstiftung für Volksgesundheit und Medizinische Forschung", Roche Grundforskningsfond og universitetet af Basel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| MEM | GIBCO, by Life Technologies | 31095 | |
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 31153 | |
| Fetal Bovine Serum | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 | |
| Insuline | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Human EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Human FGF | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Penicillin/streptomycin solution | GIBCO, by Life Technologies | 15140 |
References
- Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions. Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).
- Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation. J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).
- Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy. Lancet. 345, 694-695 (1995).
- Askanas, V., Engel, W. K. A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture. Neurology. 25, 58-67 (1975).
- Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro. Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).
- Lefebvre, S. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell. 80, 155-165 (1995).
- Schrank, B. Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).
- Hsieh-Li, H. M. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).
- Monani, U. R. The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).
- Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).
- Durbeej, M., Campbell, K. P. Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models. 12, 349-361 (2002).
- Schnabel, J. Neuroscience: Standard model. Nature. 454, 682-685 (2008).
- Benatar, M. Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS. Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).
- Dorchies, O. M. Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system. Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).
- McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies. Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).
