Summary
Искусственный клеток являются недостаточными модель повторять иннервируемых мышц
Abstract
Человека первичных клеток культивировали в монослое aneurally редко контракт спонтанно, потому что, при отсутствии нервного компонента клеточной дифференцировки ограничены и двигательных нейронов возбуждение отсутствует 1. Эти ограничения препятствуют в пробирке исследования многих нервно-мышечных заболеваний в культуре клеток. Важно отметить, что экспериментальные ограничения monolayered, культивируемых клетках мышц может быть преодолен функциональный иннервации мышечных волокон с спинного мозга в эксплантов со-культур.
Здесь мы покажем, различные шаги, необходимые для достижения эффективных, надлежащих иннервации человека первичных клеток, приводит к полной дифференциации и сокращения волокна в соответствии с методом, разработанным Askanas 2. Для этого, мышечные клетки культивировали совместно со спинальной эксплантов шнур эмбрионов крыс на ED 13.5, со спинной ганглий корень все еще прикреплены к спинной кусочки мозга. Через несколько дней, мышцы FiБерс начать сокращаться и в конечном итоге стать поперечно-полосатой через иннервации функциональной невриты, выступающую из спинного мозга, что эксплантаты подключения к мышечным клеткам. Эта структура может сохраняться в течение многих месяцев, просто регулярный обмен питательной среде.
Применение этого бесценного инструмента являются многочисленными, как он представляет собой функциональную модель междисциплинарного анализа человеческого развития мышц и иннервации. На самом деле, полное заново нервно-мышечного соединения установка происходит в культуре блюдо, позволяющий легко определить многие параметры на каждом шагу, в фундаментальные и физиологические контексте.
Просто приведу несколько примеров, геномных и / или протеомных исследований могут быть выполнены непосредственно на со-культур. Кроме того, в пред-и пост-синаптические эффекты могут быть специально и отдельно оценивается в нервно-мышечном соединении, так как компоненты из разных видов,крысы и человека, соответственно. Нервно-мышечного со-культуры могут быть выполнены с человеческими клетками, выделенных от больных страдают от мышечной или нервно-мышечными заболеваниями 3, и таким образом может быть использован в качестве инструмента отбора кандидатов для лекарств. Наконец, ни специального оборудования, но регулярно BSL2 объект, необходимых для воспроизведения функциональных двигательных единиц в культуре блюдо. Этот метод так ценен как для мышц, а также нервно-мышечных общин исследования физиологических и механических исследований нервно-мышечных функций, в нормальные и заболевание контексте.
Protocol
1. Подготовка первичной человеческой культуры мышечных клеток
- Установить культуре человеческих клеток мышц в соответствии с эксплантации-ре-эксплантации техника 4. Во-первых, удалите не-мышечной ткани биопсии. Затем вставлять 1 мм 3 эксплантатах мышцы в сгусток плазмы, что позволяет фибробластов, чтобы выйти из эксплантов.
- Встроенный эксплантов переносятся на плазменных желатин покрытием блюдо, и пусть они растут в нормальных среднего роста (MEM дополнена с 25% средних 199, 10% эмбриональной телячьей сыворотки [FBS], 1% пенициллина / стрептомицина, 10 мкг / мл инсулина, 10 нг / мл человеческого эпидермального фактора роста [EGF], 12,5 нг / мл, человеческий фактор роста фибробластов [FGF]) в монослое. Клетки, которые возникают из эксплантов в этих условиях являются мышечные клетки. Эти клетки будут продолжать расти в монослоя после удаления эксплантов.
- Культура клеток aneurally на 0,1% желатина покрытие пластин в нормальном среднего роста. Клетки могут бытьaneurally культивировали и усиливается по мере необходимости. Лучше использовать мышечные клетки в проход между 3 и 8 для выполнения совместного культур. Очень важно, чтобы молодые иннервируют myotubes, после этой точки, со-культуры имеют высокий риск неудачи. Кроме того, myotubes не должны быть слишком большими и слишком толстая.
- За два дня до иннервации Планируется, плиты мышечных клеток на 35 мм культуры тканей блюд (или 6 и плит) при плотности 500000 клеток на чашку в нормальном среднего роста. При этом плотность клеток на должном слияния, чтобы начать сплав на следующий день, и последующие иннервации на следующий день после этого. Используя эти условия, myotubes в правильном этап для оптимального иннервации и, следовательно, последующего сокращения волокна.
- На следующий день, заменить нормального среднего роста слияние среды, состоящей из MEM дополнена с 25% среды 199, 5% FBS, 10 мкг / мл инсулина и 1% пенициллина / стрептомицина.
2. Isolati на из крысы эмбриональных спинного Экспланты шнура
Вся процедура для изоляции эксплантов спинного шнур проводится под бинокулярным микроскопом, в сбалансированный солевой Хэнка Решение (HBSS, Gibco / Invitrogen ссылка 14170), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS).
- Важно, чтобы крыса эмбрионов между ED 13 и 14 разных стадиях развития может поставить под угрозу весь процесс. Пожертвуйте беременной женщины с CO 2 и собрать всю цепочку эмбриона в HBSS среды. Изолировать каждого эмбриона и обезглавить их за эвтаназию.
- Проанализируйте спинного мозга эмбриона от остальной части тела в одну часть и удалите окружающие мышцы и соединительную ткань. Будьте очень осторожны, чтобы сохранить спинной узлы корня (ДРГ), подключенных к спинному мозгу для обеспечения функциональной иннервации.
- Разрежьте каждый спинной мозг поперек таким образом, что каждый эксплантов содержит не менее 2 DRG прилагается к нему (эксплантов в 1 мм 3).
- Удалить слияние среды на культуре мышечных клеток, оставляя тонкий слой среды на монослой.
- Поместите эксплантов внимательно на слой мышечных клеток, пять равномерно распределенных эксплантов на 35 мм блюдо.
- Добавить очень медленно, падение мудрый, слияние среды на каждом эксплантов. Стоит добавить средство для мышечных клеток, чтобы выжить, но не слишком много, чтобы позволить эксплантов соблюдать первую и вступить в контакт с клетками. Если среда не добавляется неправильно (слишком сильно или слишком много средних), эксплантаты будет плавать и не сможет иннервирующих мышечные клетки.
- После эксплантов начинают придерживаться, начало слияния среднего до 2 мл на 35 мм блюдо и поставить блюда очень тщательно обратно в инкубатор.
4. Обеспечение Гетерологичная нервно-мышечной сотрудничества культур
- Изменение средних слияние два раза в неделю.
Как только через два дня после иннервации, то можно увидеть, невриты выходящих из каждого эксплантов и установление контактов с мышечными клетками, представленные на кнопку структуры (рис. 1).
Уже через 4-6 дней после иннервации, несколько отдельных волокон начнет сокращаться.
Сокращения сохраняться в течение многих месяцев, поддерживается только за счет изменения культуральной среде в два раза в неделю.
Примерно через 2 недели, спинной эксплантов шнур, вырождается, но иннервации сохраняется. Это нормально. Тонкий слой нервных компонент остается на поверхности слоя мышечных клеток. Эта нервная сеть, достаточное для поддержания функциональных возможностей мотора.
Если эксплантаты плавать в среду на следующий день после иннервации, они никогда не будут придерживаться. Это происходит, когда мышечный слой клеткиНе достаточно сливной или когда среда добавили слишком грубо. Иногда эксплантов придерживается, но не невриты появятся. Вероятно, это связано с отсутствием DRG прилагается к нему. В этом случае также, иннервации не будет создана. Манипулирование блюда очень тщательно первую неделю, как эксплантов можете отделить легко. Для обмена Fusion Media, добавьте жидкость по каплям с минимальной скоростью, чтобы избежать клетки отряда.
Рисунок 1. Спинной мозг эксплантов-мышечных клеток со-культур от 1 дня до 15-й день.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Физиологические в пробирке инструментом для изучения функции мышечных клеток в норме и патологии контексте наибольший интерес для myologists, потому что культуру мышечных клеток, как правило, не повторять о важности нескольких ячеек и типа соединения. Кроме очищенной моторных нейронов с мышечными клетками, недостаточно для достижения функционального блока двигателя, так как наличие клеток Шванн требуется для иннервации, чтобы быть эффективными 5 и не топологически (3D + специальное распределение) соответствующего протокола описаны здесь успешно используются для создания иннервируемых клеток в пробирке и в результате полного созревания NMJ, которые могут быть легко оценены.
Мышиной модели теперь доступны для многих нервно-мышечных заболеваний. К сожалению, многие из этих моделей ограничено с точки зрения перевода на заболевание человека пациентов, например, в модели мыши для спинальной мышечной атрофии, Дюшеннамышечная дистрофия или бокового амиотрофического склероза. Спинальная мышечная атрофия вызвана мутацией в гене SMN1, которые частично могут быть смягчены присутствием второго гена SMN в геноме человека 6. В отличие от мышей геном содержит только один ген SMN, и его удаление является смертельной embryonically 7. Таким образом, для того, чтобы развивать мыши спинальной мышечной атрофии модели, человеческий SMN2 копия была искусственно вводится в Smn мышей 8,9. Эти животные по-прежнему представляют собой ближайшие генетические модели патологии человека, но фенотип наблюдается в тех мышей связано с выражением SMN2 генов, что у мышей обычно не выражают 10. В случае с мышечной дистрофией Дюшенна, MDX мышей мутировали ген дистрофина похожи на человеческие пациентов, но в итоге оказывается гораздо менее серьезными по сравнению с симптомы, наблюдаемые у пациентов 11. Наиболее широко используемые модели мыши для amyotrophiс боковой склероз, SOD1 мышей, до сих пор разочарован в выявлении понимание механизмов болезни и терапевтических подходов 12,13. Таким образом, спинной мозг эксплантов-мышечных клеток со-культур для изучения функции, геномики и протеомики характеристик мышц ближайшие от пациентов, в полной физиологической настройки, являются бесценным инструментом для изучения такого сложного заболевания. Кроме того, этот вид гетеро-модель помогает различать нейрогенного и миогенной патологических механизмов. 3,14,15
Со-культуры представлены здесь также имеет некоторые ограничения. Например, иммуногистохимии экспериментов на клетках мышц трудно выступать на эту структуру, потому что нервы терминал воплощенные эксплантов охватывает постсинаптического аппарата NMJ. Эта система может также быть использован для оценки нейротрофические или миотонической воздействия наркотиков на основе комплексного и сравнительно зрелой культуры система, но она не позволяет высокой пропускной способностьюскрининга, так как объем был бы слишком большим. Любопытно, что гомологичные нервно-мышечного со-культуры как нервные и мышечные компоненты выходит только с помощью мыши или крысы не работает и не может привести к мышц. Однако в последнее время, гомологичный иннервации между мышью спутниковой мышечных клеток мыши и спинного эксплантов шнур успешно выполняется изменение даты эмбриона сбора урожая (Callizot, Steinschneider и коллег, неопубликованные результаты). Дальнейший прогресс в создании протоколов для рутинной гомологичных со-культур может помочь преодолеть видов ограничений, которые существуют в этой технике сегодня.
Несмотря на эти ограничения, мы опишем метод, который позволяет изучать многие аспекты мышц и двигательных нейронов физиология, методика, которая не трудно выполнять, не требует никаких специальных материалов и, что приводит к стабильным спинного мозга эксплантов-мышечной со- культур, которые можно легко сохранять и Studieсут в течение многих месяцев.
Некоторые аспекты протокола имеют особое значение и требуют особого ухода, чтобы обеспечить надлежащее иннервации. Во-первых, крысиных эмбрионов должна быть между 13 и 14 ЕД возраста. Во-вторых, 500000 клеток на 35-мм блюдо обеспечивает нужного уровня клеточного слияния оказания содействия соблюдению эксплантов, которые добавляются в мышечные клетки сразу после слияния клеток начинается. Наконец, как подчеркивается в протоколе, кроме среды после сдачи на хранение эксплантов на мышечные клетки является наиболее трудной частью этой процедуры и должна быть выполнена с особой тщательностью.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Наша работа при поддержке Швейцарского национального научного фонда (ОЯТ), швейцарская инициатива в системной биологии (SystemsX.ch), мышечная дистрофия ассоциации США (MDA), Ассоциация Française контр-ле-Миопатии (АСМ), Соединенные митохондриальной болезни фонда (UMDF), Геберт-ОРФ Фонд редких болезней программы (ГРФ), Швейцарского общества исследований мышечных заболеваний (SSEM / FSRMM), Swiss Life "Jubiläumsstiftung für Volksgesundheit унд медицинских исследований", Roche Фонд исследований и университета Базель.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| MEM | GIBCO, by Life Technologies | 31095 | |
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 31153 | |
| Fetal Bovine Serum | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 | |
| Insuline | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Human EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Human FGF | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Penicillin/streptomycin solution | GIBCO, by Life Technologies | 15140 |
References
- Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions. Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).
- Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation. J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).
- Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy. Lancet. 345, 694-695 (1995).
- Askanas, V., Engel, W. K. A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture. Neurology. 25, 58-67 (1975).
- Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro. Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).
- Lefebvre, S. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell. 80, 155-165 (1995).
- Schrank, B. Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).
- Hsieh-Li, H. M. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).
- Monani, U. R. The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).
- Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).
- Durbeej, M., Campbell, K. P. Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models. 12, 349-361 (2002).
- Schnabel, J. Neuroscience: Standard model. Nature. 454, 682-685 (2008).
- Benatar, M. Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS. Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).
- Dorchies, O. M. Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system. Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).
- McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies. Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).
