Summary
Процедура демонстрирует методику магнитного резонанса эластографии для мониторинга инженерных результат жировой ткани и остеогенной инженерных конструкций по неинвазивной оценки местных механических свойств с помощью микроскопических магнитных эластографии резонанса (μMRE).
Abstract
Традиционные механические испытания часто приводит к разрушению образца, а в случае долгосрочного ткани разработан построить исследований, использования деструктивных оценка не является приемлемым. Предлагаемая альтернатива использования изображений процесс, называемый магнитный резонанс эластографии. Эластография является неразрушающий метод определения конструктивных результатов путем измерения локальных механических значений свойств (например, комплексного модуля сдвига), которые имеют существенное значение маркеров для определения структуры и функциональных тканей. В неинвазивных средств для оценки, мониторинга инженерных конструкций с изображениями условий, таких как магнитно-резонансная томография (МРТ) наблюдается повышенный интерес в последние десятилетия 1. Так, например, магнитного резонанса (МР), методы распространения и relaxometry смогли охарактеризовать изменения в химических и физических свойств при инженерных развитие тканей 2. Метод, предложенный вследующий протокол использует микроскопические магнитные эластографии резонанса (μMRE) в качестве неинвазивного MR на основе методики измерения механических свойств малых мягких тканей 3. ИМО достигается путем соединения звуковой механический привод с тканью, в записи сдвиговых волн с сканер MR 4. В последнее время μMRE был применен в тканевой инженерии получить важную информацию, что рост традиционно измеряется с помощью разрушительного механические методы макроскопических 5. В следующей процедуре, эластография достигается за счет визуализации инженерных конструкций с модифицированной Хан спин-эхо последовательность в сочетании с механическим приводом. Как показано на рисунке 1, изменение последовательности синхронизации захвата изображения с передачей внешних волн сдвига, впоследствии, движение сенсибилизированных с помощью колеблющихся биполярных пар. После коллекции изображений с положительным и отрицательным движением сенсибилизацияТион, комплекс разделения данных производят сдвиг изображения волны. Затем, изображение оценивается с помощью инверсии алгоритм для генерации сдвиг карты жесткости 6. В результате измерений на каждом воксела было показано, что сильно коррелирует (R 2> 0,9914) с данными, собранными с использованием динамического механического анализа 7. В этом исследовании, эластография интегрирована в процесс развития тканей для мониторинга человеческих мезенхимальных стволовых клеток (МСК ч) дифференциация в адипогенной и остеогенной конструкции, как показано на рисунке 2.
Protocol
1. Подготовка ткани Construct
Ткани построить процесс подготовки состоит из трех основных этапов: расширение популяции клеток, посев клеток на биоматериал леса и дифференциации за счет использования химических молекул сигнализации. Порядок подготовки конструкция основана на методах проведенного Деннис и соавт., Hong и соавт., И Марион и Мао 8,9,10.
- После того, как культура и расширение клеточной линии, семена человеческих мезенхимальных стволовых клеток (МСК ч) на желатиновой губки (диаметром 4 мм, 3,5 мм толщиной) при плотности 1х10 6 кл / мл для костей и 3х10 6 кл / мл жировой образования.
- Для дифференциации ч МСК в жировой, применять жировой индукции сред, состоящих из 1 мкМ дексаметазона, 0,5 мкМ изобутил-метилксантина, 10 мкг / мл рекомбинантного человеческого инсулина и 200 мкМ индометацин в клеточной среде расширенияраз клетки появляются сливающийся на эшафот. После трех дней, заменить средства массовой информации с 10 мкг / мл рекомбинантного человеческого инсулина в расширение средств массовой информации в течение 24 часов, после чего вернуться к индукции СМИ. Повторите цикл три раза, а затем обменять только в обеспечении средств массовой информации каждые два дня.
- Для стимулирования остеогенеза, подготовить средства массовой информации остеогенной индукции, сделав конечной концентрации 0,1 мкМ дексаметазон, 50 мкМ L-аскорбиновая кислота-2phosphate и 10 мМ β-глицерофосфата в клеточной среде расширения. Замените свежие остеогенной среды каждые два дня.
2. Характеристика привода
Характеристики привода является важным шагом для ИМО эксперимента. ИМО зависит от распространения механических волн сдвига для оценки местного значения механических свойств, поэтому эти механические колебания должны быть получены и охарактеризованы в ткани интерес помощью пьезоэлектрического привода. Иллюстрированный EXAmple характеризации процесс показан на рисунке 3. Целью этой процедуры является оптимизация движения привода в целях получения безвредной поперечных волн со значительной амплитудой (~ 250 микрон).
- До начала эксперимента, применяют 0,5% агарозном геле вложить в конструкцию 10 мм пробирке. Температура геля должна быть около 37 ° C, чтобы минимизировать повреждения конструкции.
- После разрешения агарозном геле пять минут, чтобы установить при комнатной температуре, вставьте наконечник пьезоэлектрического мотора на изгиб поверхности геля.
- Приложите пробирку с образцом и привод на жесткой опоре и ориентации пучка виброметр лазерной доплеровской на кончике механического привода. Отрегулируйте расположение системы для оптимизации отраженного сигнала, использование светоотражающей лентой, если необходимо.
- На основании ожидаемых резонансной частоте механического привода, установите функцию генератора подметать гesired диапазоне частот (то есть от 20 до 2000 Гц в этом эксперименте), используя рабочее напряжение 20 В пик-пик с белым сигнал шум.
- Просмотр характеризуется спектром по программе Polytec Vibrosoft определить резонансную частоту в системе и установить программу FFT и скоростью, что и у оси.
- Для измерения перемещений, установить привод для доставки непрерывного синусоида на указанной частоте резонанса использованием рабочее напряжение 200 В пик-пик, и обратите внимание на сгенерированные перемещение доставляется на поверхность геля. Установите Vibrosoft просмотров FFT со смещением, как у оси.
3. Image Acquisition
- После завершения привода характеристика, место образца и привода в центр магнитно-резонансной томографии. Для экспериментов ткани конструкцию, используют небольшие и более чувствительным РФ катушка (например, 10 мм в этом эксперименте) для передачи и приема радиосигнала. (Процедура показана использует 9,4 твертикальное отверстие магнита оснащены тройным градиентами оси, 100 г / см).
- Получить разведчик изображение для идентификации конструкция места.
- Установите параметры для приобретения. Типичным в пробирке сагиттальном сканировании будет повторение время 1000 мс, время эхо 20-40 мс, толщина среза 0,5-1,0 мм, поле зрения 12x10 мм 2 с матрицей размером 128х128 пикселей.
- Для эластографии параметры, установить привод частоты до значения определяются виброметр характеристики лазерной доплеровской. В текущем исследовании, одной биполярной пары было необходимо с градиентом амплитуды 50 г / см. Другие параметры настройки включают задержки, которые должны быть установлены в ноль миллисекунд для первоначального приобретения.
- Изменение функции генератора для режима серийной съемки и настроить параметры функции генератора, чтобы они совпадали в эластографии приобретение параметров, включая частоту и количество циклов. Кроме того, установить функциюТион генератор для внешней сигнализации.
- Для сагиттального изображения, установить чувствительность движения, чтобы быть в положительном направлении кусочек и начать проверку. После приобретения, проверьте изображение и изменять чувствительность в отрицательном направлении среза.
- Выполнение программы MATLAB, который будет выполнять комплекс разделение генерации сдвига изображения волны.
- Оценить изображение на наличие поперечных волн и возможные артефакты, такие как этап упаковки.
- Если нет настройки изображения необходимо, отрегулировать размер массива параметров до восьми равноотстоящих значений в диапазоне от нуля секунд весь период характеризуется резонансной частоте.
- Получить сканирования как в положительном и отрицательном направлениях срез.
- После того, изображение приобрело, использовать программу MATLAB предназначена для создания сдвига данных волна из массива изображений.
4. ИМО эксперимент обработки изображений
- Thэлектронной заключительном этапе ИМО является вычисление сдвига жесткости от сдвига изображения волны. Размещение данных в программе MATLAB, который будет оценивать трехмерных данных (2 пространственных, временных 1).
Примечание: В предположении плоской волны сдвига, уравнения движения позволяет отделить оценки комплекснозначных модуль сдвига в зависимости от смещения и Лапласа. Алгоритм приближает пространственную вторые производные конечных разностей и вычисляет модуль сдвига на пиксель за пикселем основе. Из этого комплексного числа, много механических параметров можно сделать вывод, таких как скорость сдвига волны, затухание волны, сдвиг жесткость, упругость сдвиг, сдвиг вязкости и т.д. Алгоритм также позволяет выбрать регионы, представляющие интерес для которой среднее значение и стандартное отклонение каждый параметр вычисляется.
- Визуализации параметры должны быть определены в начале программы. Кроме того, гоэлектронной верхний предел эластограмма могут быть скорректированы для оптимизации контрастности в образце.
Примечание: Программа предусматривает промежуточные результаты (волна после фильтров нижних частот, волна за направленности фильтрации, временной БПФ, профилей линий и т. д.), которые помогают пользователю оценить верность восстановления.
- Некоторые параметры могут быть скорректированы на основе этой информации, такие как уровни низкочастотного фильтра, временное частота движения, направление распространения волны и т.д. стандартное отклонение параметров в конкретном регионе представляет интерес Также показатель качества расчетов.
5. Представитель Результаты
Рисунок 4 отмечается изменение механических свойств на протяжении четырех недель остеогенной и адипогенной конструкцию развития. ИМО была проведена в 730-820 Гц. В то время как семенами губки начали примерно в 3 кПа, osteogeniс направленным тканей в результате жесткость на 22 кПа, в то время, жировой ткани, направленный снизилась в жесткости на 1 кПа. Кроме того, остеогенной конструкций показали заметное уменьшение в размерах по сравнению с начала до конца исследования. Дополнительные свойства полученных из эластографии исследования представлены в таблице 1.
Рисунок 1. Процесс получения изображений магнитного резонанса эластографии. Во время захвата изображений, последовательность импульсов () управляет синхронизацией (б) функции генератора биполярных импульсов градиентов магнитно-резонансной томографии. После приобретения биполярный градиент переключается в положительном и отрицательном направлениях (в) сдвиг изображения волн производится с помощью сложной деления.
Рисунок 2. Технологическая схема ИМО процесс ткани двигательЭред конструкций. Во-первых, клетки (а) сначала выросла и расширилась в численности населения необходимы для проектируемого. Затем клетки высевают (б) на биоматериал леса и химические реагенты применяются для сигнализации дифференциации. Строительные леса характеризуются ИМО, первый шаг (с) определение резонансной частоты привода связаны с конструкцией. Далее, МРТ (г) приобрел для создания сдвига изображения волны (е). Наконец, алгоритм применяется для получения эластограмма (F), которая отображает жесткость конструкции. Одновременно конструкции подразделяются на гистологическое оценку (г) в целях подтверждения дифференциации.
Рисунок 3. Процедура привода характеристику. Желатин эшафот окружен 0,5% агарозном геле. Для характеристики движения передаются в образец белого шума сначала отправили в системе(1а) и в результате движения определяется с помощью лазерной доплеровской виброметр (1b). После того, резонансная частота определяется, непрерывная синусоида сигнала в резонансе (2а) направляется для определения смещения (2b) передаются в желатин окружающей среды.
Рисунок 4. Построить развития карте в течение четырех недель. Адипогенной (А) и остеогенной (O) конструкции показаны слева направо с соответствующей величины и сдвига изображения волн, эластограмма, а средняя жесткость сдвига. Палитры для эластограмма соотносится с цветовой схемой гистограммы и погрешности представляют собой стандартное отклонение в регионе каждой конструкции, представляющие интерес.
Таблица 1. Механические свойства жировой и костно конструкций в течение четырех недель роста.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой процедуре, процесс ИМО для ткани инженерных конструкций показано с мобильного подготовки к поколению эластограмма. Применяя метод неразрушающего контроля механических оценку трубопровода тканевой инженерии, в настоящее время можно оценить изменения в инженерных конструкций по всему несколько этапов развития. Кроме того, ИМО, дополняет другие методы МРТ для мониторинга инженерных конструкций тканей, таких как диффузия, намагниченность передачи и химический сдвиг анализ 1.
При выполнении ИМО экспериментов, некоторые ограничения должны быть отмечены. Оценка в пробирке образцах срочной исследования. Поэтому, рекомендуется, что исследования должны продолжаться не более одного часа, так что любой потенциальный ущерб ткани конструкции сведены к минимуму. Кроме того, верующие восстановления жесткости карта может быть нарушена из-за конструкции являются либо слишком маленькими или жесткой 6. Наэлектронной возможное решение этой проблемы для работы на высокой частоте (> 2,5 кГц), а длина волны обратно пропорциональна частоте. Пьезоэлектрические приводы стек благодаря высоким напряжением усилители способны обеспечить достаточное движение на таких частотах для получения полной длины волны сдвига в образце. Другая возможная поправка к протоколу заключается в использовании быстрее последовательности, такие как быстрое спин-эхо и эхо-планарной томографии 11, 12.
Помимо возможности ИМО для инженерных конструкций ткани в пробирке, на следующем этапе доклинических оценки является оценка развития тканей имплантируется в живой системе. Применение МП в мышь исследования даст еще одну возможность неразрушающего оценить развитие тканей конструкций. Расширение эластографии для лечения кости или хряща дефекты потенциально обеспечить лучшее понимание того, как производить более прочный функциональный е имплантатовили использования в регенеративной медицине. Магнитный резонанс эластографии имеет потенциал, чтобы играть все более важную роль в проверке инженерных конструкций, как в пробирке и в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было частично поддержана NIH RO3-EB007299-02 и NSF EPSCoR Первая премия.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MSCGM-Bullet Kit | Reagent | Lonza Inc. | PT-3001 | Store at 4°C |
| 1X DPBS | Reagent | Invitrogen | 21600-010 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | Store at -20°C |
| Dexamethasone | Reagent | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Reagent | Sigma-Aldrich | I5879 | Store at -20°C |
| Insulin-bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I6634 | Store at -20°C |
| Indomethacin | Reagent | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Β-Glycerophosphate | Reagent | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Reagent | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Gelfoam | Scaffold | Pharmacia Corporation (Pfizer) | 09-0315-08 | |
| Human mesenchymal stem cells | Cell Line | Lonza Inc. | PT-2501 | |
| 9.4T MR Scanner | Equipment | Agilent Technologies | 400MHz WB | |
| 10mm Litz Coil | Equipment | Doty Scientific | ||
| Laser Doppler Vibrometer | Equipment | Polytec | PDV-100 | |
| Vibrosoft (20) | Software | Polytec | ||
| Function generator | Equipment | Agilent Technologies | AFG 3022B | |
| Amplifier | Equipment | Piezo Inc. | EPA-104-115 | |
| Piezo Bending motor | Equipment | Piezo Inc. | T234-A4Cl-203X | |
| Computer-Linux | Equipment | Intel | Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G | |
| Computer-Windows | Equipment | Intel | Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G | |
| MATLAB | Software | Mathworks | 2009b |
References
- Xu, H., Othman, S. F., Magin, R. L. Monitoring tissue engineering using magnetic resonance imaging. J. Biosci. Bioeng. 106, 515-527 (2008).
- Xu, H., Othman, S. F., Hong, L., Peptan, I. A., Magin, R. L. Magnetic resonance microscopy for monitoring osteogenesis in tissue-engineered construct in vitro. Phys. Med. Biol. 51, 719-732 (2006).
- Othman, S. F., Xu, H., Royston, T. J., Magin, R. L. Microscopic magnetic resonance elastography (microMRE. Magn. Reson. Med. 54, 605-615 (2005).
- Muthupillai, R., Lomas, D. J., Rossman, P. J., Greenleaf, J. F., Manduca, A., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography by direct visualization of propagating acoustic strain waves. Science. 269, 1854-1857 (1995).
- Othman, S. F., Curtis, E. T., Plautz, S. A., Pannier, A. P., Xu, H. Magnetic resonance elastography monitoring of tissue engineered constructs. NMR Biomed. , Forthcoming (2011).
- Oliphant, T. E., Manduca, A., Ehman, R. L., Greenleaf, J. F. Complex-valued stiffness reconstruction for magnetic resonance elastography by algebraic inversion of the differential equation. Magn. Reson. Med. 45, 299-310 (2001).
- Ringleb, S. I., Chen, Q., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L., An, K. Quantitative shear wave: comparison to a dynamic shear material test. Magn. Reson. Med. 53, 1197-1201 (2005).
- Hong, L., Peptan, I., Clark, P., Mao, J. J. Ex vivo adipose tissue engineering by human marrow stromal cell seeded gelatin sponge. Ann. Biomed. Eng. 33, 511-517 (2005).
- Dennis, J. E., Haynesworth, S. E., Young, R. G., Caplan, A. I. Osteogenesis in marrow-derived mesenchymal cell porous ceramic composites transplanted subcutaneously: effect of fibronectin and laminin on cell retention and rate of osteogenic expression. Cell Transplant. 1, 23-32 (1992).
- Marion, N. W., Mao, J. J. Mesenchymal stem cells and tissue engineering. Methods Enzymol. 420, 339-361 (2006).
- Rydberg, J., Grimm, R., Kruse, S., Felmlee, J., McCracken, P., Ehman, R. L. Fast spin-echo magnetic resonance elastography of the brain. Proceedings of the International Society of Magnetic Resonance in Medicine, Glasgow, Scotland, , 1647-1647 (2001).
- Kruse, S. A., Grim, R. C., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L. Fast EPI based 3D MR elastography of the brain. Proceedings of the International Society for Magnetic Resonance in Medicine, Seattle, Washington, , 3385-3385 (2006).
