Summary
הקרינה רומן
Abstract
הקרינה ב ההכלאה באתרם (דגים) היא טכניקה המאפשרת רצפי DNA ספציפיים כדי להתגלות על הכרומוזומים metaphase או שלבי הביניים בגרעין התא 1. הטכניקה משתמשת בדיקות DNA עם רצפים ייחודיים כדי להכליא כרומוזומים שלמים או אזורי כרומוזומים מסוימים, ומשמש כתוספת חזקה cytogenetics קלאסיים. למשל, מחקרים קודמים רבים דיווחו על גילוי תכופה של סטיות כרומוזום מוגברת בחולים לוקמיה הקשורים עם חשיפה בנזן, בנזין, הרעלת חולים, עובדים בריאים שנחשפו בנזן, באמצעות ניתוח קלאסי cytogenetic 2. באמצעות דגים, לוקמיה ספציפיים שינויים כרומוזומליים נצפו להיות גבוהות עובדים בריאים לכאורה שנחשפו בנזן 3-6, המציין את התפקידים הקריטיים של שינויים cytogentic ב leukemogenesis בנזן המושרה.
באופן כללי, assay דג בוחן אחד בלבד או כמה כרומוזומים שלמיםאו לוקוסים ספציפיות לכל שקופית, כך הכלאות מרובות צריך להתנהל על שקופיות מרובות כדי לכסות את כל הכרומוזומים האנושיים. Karyotyping ספקטרלי (SKY) המאפשר הדמיה של הגנום כולו בו זמנית, אבל את הדרישה תוכנה מיוחדת לתחום ציוד היישום שלה 7. כאן אנו מתארים assay דגים רומן, OctoChrome-FISH, אשר יכול להיות מיושם על Chromosomics, שאנו מגדירים כאן ניתוח סימולטני של כל 24 הכרומוזומים האנושיים בשקופית אחת מחקרים בבני אדם, כגון מחקר כרומוזום רחב aneuploidy (CWAS) 8. הבסיס של השיטה, המשווקים על ידי Cytocell כמערכת Multiprobe Chromoprobe, הוא מכשיר OctoChrome אשר מחולק 8 ריבועים, שכל אחת מהן נושאת שלוש שונים שלמים ציור בדיקות כרומוזומים (איור 1). כל אחת משלוש הבדיקות מסומן ישירות עם fluorophore בצבע אחר, ירוק (FITC), אדום (Red טקסס), וכחול (קומארין). סידור הכרומוזומים על שילובים OctoChromמכשיר ה תוכנן כדי להקל על זיהוי שאינו כרומוזום אקראיים שינויים מבניים (טרנסלוקציות) שנמצאו לוקמיה לימפומה ו הנפוצים ביותר, עבור T למשל (9, 22), t (15; 17), t (8; 21 ), t (14, 18) 9. יתר על כן, שינויים מספריים (aneuploidy) בכרומוזומים ניתן לאתר בו זמנית. השקופית תבנית המקביל מחולק גם ל -8 ריבועים על המשתרע metaphase המאוגדים (איור 2), והוא ממוקם מעל המכשיר OctoChrome. בדיקות ו-DNA היעד הם מפוגל על בטמפרטורה גבוהה ו הכלאה בתא לח ולאחר מכן כל 24 הכרומוזומים האנושיים ניתן דמיינו בו זמנית.
דגים OctoChrome היא טכניקה מבטיחה אבחנה קלינית של לוקמיה ולימפומה וכן זיהוי של aneuploidies בכרומוזומים כל. יש לנו ליישם את הגישה הזאת Chromosomic חדש במחקר CWAS של בנזן שנחשפו פועלים סינים 8,10.
Protocol
1. שקופיות מדגם הכנה
- דגים OctoChrome נועד לבחון שינויים כרומוזומלית מתפשט metaphase של תאים אנושיים, כולל אך לא רק תאים בתרבית דם היקפיים, גזע / אבי תאים, שורות תאים. דוגמאות יש להכין בעקבות הליך סטנדרטי עבור קצירת metaphases 3,11-13: על ידי העסקת טיפול colcemid לעצור תאים metaphase, טיפול hypotonic להתנפח תאים, Carnoy של מקבע לתקן תאים ההשעיה על כ 0.5-1 x 10 6 תאים לכל מ"ל.
- נקו את השקופית 8 מרובע (בתנאי בערכה OctoChrome, קטלוג #: PMP 803, Cytocell בע"מ, קיימברידג', בריטניה, איור 2) על ידי טובל אתנול טהור דקות 2.
- לפני ביצוע שקופיות מדגם, ולשחרר כמות קטנה של תאים לשקופית כדי לבדוק את צפיפות התאים. אם צפיפות התאים גבוהה מדי (התאים חופפים יותר מדי), לדלל את ההשעיה עם מקבע טרי. אם צפיפות התאים נמוך מדי (תא מעטים מדיזה בשקופית), לסובב את התאים מחדש להשעות בהיקף קטן יותר של מיצב טרי. פיפטה μl 5-10 של השעיה על כל תא של 8 אזורים של שקופיות תבנית ברצף של ריבועים לסירוגין 1/7 - 2/8 - 3 / 5-4 / 6. ברגע הראשון שני ריבועים יש אוויר יבש, לזהות את הריבועים הנותרים באותה צורה. זה ימנע את המרווחים סלולריים מלהתערב אחד עם השני.
- שקופית יבשים ניתן לאחסן ב -20 ° C באווירה של חנקן גדול יותר מ -5 שנים לפני ההכלאה.
2. לוקליזציה של metaphases באמצעות מערכת אוטומטית
- החל 20 μl של 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (0.2 מיקרוגרם / מ"ל) למרכז של כל מחצית של השקופית ולאחר מכן מכסים coverslip.
- לבצע סריקה אוטומטית של שקופיות מדגם למקם את התאים באמצעות metaphase Metafer תוכנה (MetaSystems, Altlussheim, גרמניה). זה מאפשר מיקום של כל metaphases ועתיד הערכה מחדש של כל התמונות סלולריים.
- להציג את תוצאות הסריקה באופן ידני ולמחוק ללא metaphase חפצים.
3. הכלאה
- הכנת שקופיות מדגם מכשיר OctoChrome
- טובלים את השקופית מדגם במאגר SSC 2x בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לשטוף DAPI.
- מייבשים את השקופית מדגם באמצעות סדרה של שוטף אתנול (2 דקות כל אחד ב 70%, 85% ו 100% אתנול), לאפשר לו להתייבש ומניחים על 37 מעלות צלזיוס פלטה חשמלית במשך 5 דקות.
- מניחים את Multiprobe Chromoprobe הכלאה הקאמרית (בתנאי בערכה OctoChrome) על אמבט מים 37 ° C כדי לאזן ולאפשר ל 37 ° C (+ / - 1 ° C).
- מערבבים את הפתרון ההכלאה (בתנאי בערכה OctoChrome) על ידי pipetting חזר מראש חם aliquot 25 μl לכל מכשיר OctoChrome ל 37 ° C.
- טרום חם כל התקן OctoChrome (בתנאי בערכה OctoChrome, ראה איור 2) על 37 מעלות צלזיוס על ידי הנחת הצד תווית המכשיר על פלטה חשמלית. לא לגעת לאהוא משטחים בולטות של המכשיר OctoChrome כפי שהם מכילים את הבדיקות.
- המיקום של השקופית על מכשיר מדגם OctoChrome (איור 2)
- הוסף 2 μl של פתרון מחומם מראש ההכלאה לכל אחד משמונה אזורים על מכשיר מחומם מראש OctoChrome בזמן שהוא נשאר ב 37 ° C.
- להפוך בזהירות את השקף בתבנית על המכשיר OctoChrome כך מספר 1, הנמצא כעת הפוך, ממוקם על שטח היד הימנית העליונה של המכשיר OctoChrome. כדי לסייע באיתור ריבוע 1, את מיקומו על גבי המכשיר סומן בכתום.
- ודא כי את השקופית תבנית מיושר היטב עם האזורים תואמים במכשיר OctoChrome. להוריד בזהירות את השקף על המכשיר OctoChrome כך טיפות של תמיסת הכלאה ליצור קשר עם שקופיות. החל עדין, אפילו ללחוץ על מנת להבטיח כי הפתרון ההכלאה היא להפיץ את הקצוות של כל אחד מהאזורים שהועלו על המכשיר OctoChrome.
- להריםאת השקופית / OctoChrome, מחזיק בזהירות את קצה קפוא של שקופיות זכוכית, להפוך כך השקופית הוא מתחת למכשיר OctoChrome. יש לוודא שהמכשיר לא למרוח על פני השקופית תבנית כמו זו עלול לגרום בין זיהום של הבדיקות.
- מניחים על 37 ° C (+ / - 1 ° C) פלטה חשמלית במשך 10 דקות.
- Denaturation
- להעביר את המכשיר שקופיות / OctoChrome מדגם פלטה חשמלית בטיפול בפרט להחזיק אותו ברמה. ודא שקופיות מדגם בצורה שווה הקשר פלטה חשמלית.
- לפגל על פלטה חשמלית ב 75 ° C (+ / - 1 ° C) במשך 5 דקות.
- הכלאה
- במקום מדגם שקופיות / מכשיר OctoChrome ב הקאמרית Multiprobe Chromoprobe הכלאה.
- החלף את המכסה לצוף קאמרית 37 ° C (+ / - 1 ° C) אמבט מים (אי - ערבוב) בין לילה. שימו לב: לא לסגור את מכסה תא ההכלאה, אל לאטום את המכסה על אמבט מים, אל להכליא בחממה. צעדים אלה הם קריטיים שליטה לחות.
- לאחר הכלאה שוטף
- הכנת פתרונות לשטוף
פתרון 1: הכן את הצנצנת Coplin / Hellendahl המכיל 0.4x SSC. לאזן עד 72 ° C (+ / - 1 ° C) באמבט מים להתאים את pH עד 7.0.
פתרון 2: הכן את הצנצנת Coplin / Hellendahl המכיל 2x SSC ו 0.05% Tween 20. אפשר לעמוד בטמפרטורת החדר. - הסר את ההתקן OctoChrome בזהירות משקופית ומניחים שקופית פתרון 1 ל -2 דקות.
- מניחים את השקופית לתוך פתרון 2 במשך 30 שניות.
4. הרכבה ויזואליזציה של תוצאות
- החל 20 μl של DAPI למרכז כל מחצית של השקופית וליישם coverslip.
- דגירה בחושך במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני הצפייה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
5. נציג תוצאות
FiguRe 3A מראה תא metaphase רגיל בכיכר 2. (1) - (3): כרומוזומים 8, 21 ו -12 היו צבועים אדום, ירוק וכחול, הם דמיינו את האדום טקסס, FITC, ו DEAC מסנן, בהתאמה; (4): ויזואליזציה דרך DAPI / FITC / טקסס אדום טריפל מסנן. באופן כללי, הכרומוזומים צבועים בכחול אינם ברורים דרך פילטר משולשת צריך לראות תחת מסנן DEAC ספציפי.
איור 3 ב מציג תאים חריגים עם נציג טרנסלוקציה לוקמיה ספציפי aneuploidy כרומוזומלית ו. (1): t (8; 21), טרנסלוקציה כרומוזומלית שכיח לוקמיה מיאלואידית חריפה, (2): טריזומיה 21, שלושה עותקים של כרומוזום 21, aneuploidy נפוץ לוקמיה.
באיור 1. הסדר של צירופי הכרומוזומים במכשיר OctoChrome וציפו לתוצאות ציור כרומוזומליות.
איור 2. מיקום של שקופית על מכשיר מדגם OctoChrome.
איור 3. תוצאות נציגלהשיג דגים OctoChrome (ריבוע 2).
איור 3 א. תא נורמלי עם 8 כרומוזומים, 12, 21 צבועים בכיכר 2.
איור 3 ב. תאים חריגים עם נציג טרנסלוקציה לוקמיה ספציפי aneuploidy כרומוזומלית ו בכיכר 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זה assay הרומן דגים OctoChrome, מאפשר בו זמנית לבדוק את כל 24 הכרומוזומים האדם הכלאה אחת בשקופית 1. ההסדר של שילובים כרומוזום על 8 ריבועים תוכנן כדי להקל על זיהוי לא אקראיים rearrangements כרומוזום את לוקמיה לימפומה ו הנפוצים ביותר. לכן, assay יכול לזהות מספרי (aneuploidy), כמו גם מבנה (טרנסלוקציות) שינויים כרומוזום במקביל.
השלב הקריטי ביותר assay זה שליטה על הלחות במהלך ההכלאה בין לילה בחדר צף באמבט מים. בדיקות דגים חיץ הכלאה בקלות להתייבש אם הלחות נמוכה, או להיות גם לדלל ידי ספיגת לחות רבה מדי, אם לחות גבוהה. התוצאה גם יכול להשפיע לרעה על התוצאות. שינוי ניתן היה להתגבר על האתגר הזה הוא לאטום את המכשיר OctoChrome ולהחליק המדגם עם הקלטת להכליא על ° 37; C פלטה חשמלית ב לילה חשוך.
שקופיות לדוגמא, כי כבר בגיל יותר מדי יכול להיות מתאים לשימוש assay זה ישירות. בעוד לעכל דגימות כאלה עם פפסין ישפרו ההכלאה, אחסון שקופיות מדגם מוכן באווירה החנקן ב -20 ° C מומלץ מאוד לצמצם את ההזדקנות.
OctoChrome-FISH היא שיטה מבטיחה אבחנה קלינית של לוקמיה ולימפומה. זה גם מאוד שימושי עבור בחינת rearrangements כרומוזומליות ספציפיות ביותר לגבי לוקמיה לימפומה האדם באוכלוסיות שנחשפו leukemogens ו lymphomagens פוטנציאליים לחקר aneuploidy וישכנע השפעת כימיקלים באופן כרומוזום כולו. CWAS במחקר הקודם שלנו באמצעות טכניקה זו הוכיחה כי כרומוזומים מסוימים עשויים להיות מושפעים יותר מאחרים כתוצאה מחשיפה 8,10 בנזן, כימיקל תעשייתי ראשונית מזהם סביבתי בכל מקום שגורם לוקמיה האדם 14.תופעה זו של "aneuploidy סלקטיבית" ניתן היה לחקור חשיפות כימיים אחרים באמצעות CWAS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לד"ר Cliona מ מקהייל עבור אנושות קריאה ועריכה של כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה, המכון הלאומי לבריאות מענק R01ES017452 ל L 'אנג.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OctoChrome Kit | Cytocell Ltd. | PMP 803 | |
| phytohaemagglutinin (PHA) | Invitrogen | 10576-015 | |
| Colcemid | Invitrogen | 15212-012 | |
| Carnoy’s fixative | Methanol : glacial acetic acid = 3: 1 | ||
| Fluorescence microscope | Equipped with filters to view DAPI, Texas Red, FITC, and Coumarin spectra individually and a DAPI/FITC/Texas Red triple filter to view different colors simultaneously | ||
| Metafer software | MetaSystems, Altlussheim, Germany | Facilitate to locate all metaphases and to re-evaluate the abnormalities |
References
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell. Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Zhang, L., Eastmond, D. A., Smith, M. T. The nature of chromosomal aberrations detected in humans exposed to benzene. Crit. Rev. Toxicol. 32, 1-42 (2002).
- Zhang, L. Aberrations in chromosomes associated with lymphoma and therapy-related leukemia in benzene-exposed workers. Environ. Mol. Mutagen. 48, 467-474 (2007).
- Zhang, L. Benzene increases aneuploidy in the lymphocytes of exposed workers: a comparison of data obtained by fluorescence in situ hybridization in interphase and metaphase. Environ. Mol. Mutagen. 34, 260-268 (1999).
- Zhang, L. Increased aneusomy and long arm deletion of chromosomes 5 and 7 in the lymphocytes of Chinese workers exposed to benzene. Carcinogenesis. 19, 1955-1961 (1998).
- Smith, M. T. Increased translocations and aneusomy in chromosomes 8 and 21 among workers exposed to benzene. Cancer. Res. 58, 2176-2181 (1998).
- Bayani, J., Squire, J. A. Advances in the detection of chromosomal aberrations using spectral karyotyping. Clin. Genet. 59, 65-73 (2001).
- Zhang, L. Chromosome-wide aneuploidy study (CWAS) in workers exposed to an established leukemogen, benzene. Carcinogenesis. 32, 605-612 (2011).
- Rowley, J. D. The role of chromosome translocations in leukemogenesis. Semin. Hematol. 36, 59-72 (1999).
- Zhang, L. Use of OctoChrome fluorescence in situ hybridization to detect specific aneuploidy among all 24 chromosomes in benzene-exposed workers. Chem. Biol. Interact. , 153-154 (2005).
- Barch, M. J., Lawce, H. J., Arsham, M. S. In The ACT cytogenetics laboratory. Barch, M. J. , Raven Press. 17-30 (1991).
- Zhang, L., Yang, W., Hubbard, A. E., Smith, M. T. Nonrandom aneuploidy of chromosomes 1, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, and 21 induced by the benzene metabolites hydroquinone and benzenetriol. Environ. Mol. Mutagen. 45, 388-396 (2005).
- Smith, M. T. Hydroquinone, a benzene metabolite, increases the level of aneusomy of chromosomes 7 and 8 in human CD34-positive blood progenitor cells. Carcinogenesis. 21, 1485-1490 (2000).
- Smith, M. T. Advances in understanding benzene health effects and susceptibility. Annu. Rev. Public. Health. 31, 133-148 (2010).
