Summary
Роман флуоресценции
Protocol
1. Подготовка образцов слайдов
- OctoChrome FISH предназначен для изучения изменений хромосом в метафазе распространяется клеток человека, в том числе, но не ограничиваясь культурно клеток периферической крови, стволовых / прогениторных клеток и клеточных линиях. Образцы должны быть подготовлены следующие стандартные процедуры для уборки метафаз 3,11-13: за счет использования колцемид лечения арест клеток в метафазе, гипотонической обработки клеток набухать, и Карнуа фиксатор, чтобы исправить клеток в суспензии примерно в 0,5-1 х 10 6 клеток на мл.
- Очистите 8 квадратных слайде (при условии, в OctoChrome Kit, Catalogue #: PMP 803, Cytocell Ltd, Кембридж, Великобритания, 2) путем погружения в чистом этаноле в течение 2 мин.
- Перед образца слайдов, поместите небольшое количество клеток на слайд, чтобы проверить плотность клеток. Если плотность клеток слишком высок (слишком много перекрывающихся ячеек), разбавленные суспензии свежей фиксатором. Если плотность клеток является слишком низкой (слишком мало клеткис на слайде), спином вниз клетки и вновь приостановить меньший объем свежего фиксатора. Внесите 5-10 мкл клеточной суспензии на каждом из 8 районов шаблон слайда в последовательности чередующихся квадратов 1/7 - 2/8 - 3/5 - 4/6. После первых двух квадратов имеет воздушно-сухой, определить оставшиеся площади в том же порядке. Это позволит предотвратить клетке передается от мешая друг другу.
- Высушенные слайд можно хранить при температуре -20 ° С в атмосфере азота в течение более 5 лет, прежде чем гибридизации.
2. Локализация метафаз использованием автоматизированной системы
- Применение 20 мкл 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (0,2 мкг / мл) в центре каждой половине слайда, а затем накрыть покровным стеклом.
- Выполнять автоматизированное сканирование образцов слайдов локализовать метафазных клеток с использованием программного обеспечения Metafer (метасистемы, Altlussheim, Германия). Это облегчает расположение всех метафаз и будущие переоценки всех клеточных изображений.
- Просмотр результатов сканирования вручную и удалять без метафазы артефактов.
3. Гибридизация
- Подготовка слайд образца и устройство OctoChrome
- Опустите образец слайда в буфер 2x SSC при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы смыть DAPI.
- Высушить образца слайдов с помощью ряда этанола мойки (2 минуты в 70%, 85% и 100% этилового спирта), дать высохнуть и поместить на 37 ° С плиты на 5 минут.
- Поместите гибридизации Chromoprobe Multiprobe палаты (при условии, в OctoChrome Kit) при 37 ° С на водяной бане и дать, чтобы уравновесить до 37 ° C (+ / - 1 ° C).
- Смешать гибридизации решение (если в OctoChrome Kit) повторными пипетирования и предварительно теплой 25 мкл в OctoChrome устройства до 37 ° C.
- Предварительно каждый теплый OctoChrome устройства (при условии, в OctoChrome Kit, см. рисунок 2) до 37 ° C, поместив стороны устройства этикеткой вверх на плите. Не прикасайтесь тОн тиснением поверхности OctoChrome устройства, поскольку они содержат зондов.
- Позиционирование образца слайдов на OctoChrome устройство (рис. 2)
- Добавить 2 мкл предварительно нагретой гибридизации решение каждой из восьми областей на предварительно нагретой OctoChrome устройство, пока оно остается при 37 ° C.
- Аккуратно перевернуть шаблон скользят по OctoChrome устройства, такие, что число 1, который в настоящее время с ног на голову, находится в верхней правой рукой область устройства OctoChrome. Чтобы найти площадь 1, свою позицию по устройству был отмечен в Orange.
- Убедитесь, что шаблон слайда тщательно согласованы с соответствующими области на OctoChrome устройства. Осторожно опустите скользят по OctoChrome устройство так, чтобы капли гибридизации решение вступить в контакт с горкой. Применить нежный, даже давление для того, чтобы гибридизация решение распространяется на краю каждой из областей подняли на OctoChrome устройства.
- Подниматьслайд / OctoChrome, тщательно проведения замороженный конец стекло, и инвертировать, чтобы слайд под OctoChrome устройства. Убедитесь, что устройство не мазка через шаблон слайда, так как это может привести к перекрестного загрязнения проб.
- Место на 37 ° C (+ / - 1 ° С) плиты на 10 минут.
- Денатурация
- Передача устройства образца слайдов / OctoChrome к плите с особой тщательностью, чтобы держать его уровня. Убедитесь, что образец слайдов равномерно контакты плиту.
- Денатурировать на плите при температуре 75 ° C (+ / - 1 ° C) в течение 5 минут.
- Гибридизация
- Место слайд образца / OctoChrome устройства в гибридизации палаты Multiprobe Chromoprobe.
- Замените крышку и плавать камеры в 37 ° C (+ / - 1 ° C) водяной бане (не - перемешивания) в течение ночи. Пожалуйста, обратите внимание: НЕ уплотнения крышки на камеру гибридизации; НЕ запечатать крышкой на водяной бане, не гибридизуются винкубатора. Эти меры имеют важное значение для контроля влажности.
- После гибридизации мойки
- Приготовление раствора мытья
Решение 1: Подготовка Коплин / Hellendahl сосуд 0.4x SSC. Равновесие до 72 ° C (+ / - 1 ° C) на водяной бане и регулирования рН до 7,0.
Решение 2: Подготовка Коплин / Hellendahl сосуд 2x SSC и 0,05% Tween 20. Дать постоять при комнатной температуре. - Удалить OctoChrome устройство тщательно от слайдов и поместить слайд в раствор 1 на 2 минуты.
- Поместите в слайде Решение 2 в течение 30 секунд.
4. Монтаж и визуализации результатов
- Применение 20 мкл DAPI в центре каждой половине слайда и применить покровным.
- Инкубировать в темноте в течение 10 минут при комнатной температуре перед просмотром с помощью флуоресцентной микроскопии.
5. Представитель Результаты
ФигуRe 3A показывает нормальную клетку метафазе на площади 2. (1) - (3): хромосомы 8, 21 и 12 были окрашены в красный цвет, зеленый и синий, и визуализируются через Texas Red, FITC, и DEAC фильтр, соответственно, (4): визуализация с помощью DAPI / FITC / Texas Red тройной фильтр. В целом, хромосомах окрашена синим цветом, не ясно, через тройной фильтр и должны рассматриваться в соответствии с конкретными фильтр DEAC.
Рисунок 3Б показывает, представитель аномальных клеток с лейкемией конкретной хромосомной транслокации и анеуплоидии. (1): т (8, 21), распространенных хромосомных транслокаций в острой миелоидной лейкемией (2): трисомии 21, три копии хромосомы 21, общей анеуплоидии при лейкозах.
Рисунок 1. Расположение хромосом комбинации на OctoChrome устройства и ожидаемые результаты хромосомных живописи.
Рисунок 2. Позиционирования образца слайдов на OctoChrome устройства.
Рисунок 3. Представитель результатыполучены из OctoChrome FISH (площадь 2).
3А. Нормальной клетки с хромосомами 8, 12, 21 окрашены в площади 2.
Рисунок 3B. Представитель аномальных клеток с лейкемией конкретной хромосомной транслокации и анеуплоидия на площади 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот роман OctoChrome-FISH анализ позволяет одновременно изучить все 24 хромосом человека в одной гибридизации на одном слайде. Расположение хромосом комбинации на 8 квадратов был разработан, чтобы облегчить идентификацию неслучайных хромосомных перестроек в наиболее распространенных лейкозов и лимфом. Таким образом, анализ может обнаружить численного (анеуплоидия), а также структурные (транслокации) хромосом изменения одновременно.
Наиболее важным шагом в этом анализе контролирует влажность во время ночной гибридизации в плавающей камеры в водяной бане. FISH зондов и гибридизации буфер легко высыхает при низкой влажности, или слишком разводить, поглощая слишком много влаги при высокой влажности. Любой результат может отрицательно сказаться на результатах. Возможные модификации для преодоления этой проблемы является для герметизации OctoChrome устройства и образцы слайдов с лентой и гибридизации на 37 °, С плиты в темноте ночи.
Пример слайда, которые были в возрасте слишком много, могут не подходить для использования в данном анализе напрямую. В то время переваривания таких образцов с пепсином улучшить гибридизации, хранения подготовленных слайдов образца в атмосфере азота при температуре -20 ° C, настоятельно рекомендуется свести к минимуму старения.
OctoChrome-FISH является перспективной техники для клинической диагностики лейкемии и лимфомы. Это также очень полезно для изучения наиболее конкретным хромосомных перестроек, связанных с человеческой лейкемии и лимфомы в популяции подвергаются потенциальной leukemogens и lymphomagens и для изучения анеуплоидия вызывающих воздействия химических веществ в хромосоме всей форме. Наши предыдущие исследования CWAS использовании этого метода показало, что определенные хромосомы может быть больше, чем другие пострадавшие от воздействия бензола 8,10, основной промышленный химикат и вездесущий загрязнителем окружающей среды, что вызывает лейкемии человека 14.Это явление "избирательного анеуплоидия" можно было бы изучить в других воздействия химических веществ, использование CWAS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра М. Cliona Макхейл для критического чтения и редактирования рукописей. Эта работа финансировалась Национальным институтом экологических наук, Национальный институт здравоохранения грант R01ES017452 в L Чжан.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OctoChrome Kit | Cytocell Ltd. | PMP 803 | |
| phytohaemagglutinin (PHA) | Invitrogen | 10576-015 | |
| Colcemid | Invitrogen | 15212-012 | |
| Carnoy’s fixative | Methanol : glacial acetic acid = 3: 1 | ||
| Fluorescence microscope | Equipped with filters to view DAPI, Texas Red, FITC, and Coumarin spectra individually and a DAPI/FITC/Texas Red triple filter to view different colors simultaneously | ||
| Metafer software | MetaSystems, Altlussheim, Germany | Facilitate to locate all metaphases and to re-evaluate the abnormalities |
References
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell. Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Zhang, L., Eastmond, D. A., Smith, M. T. The nature of chromosomal aberrations detected in humans exposed to benzene. Crit. Rev. Toxicol. 32, 1-42 (2002).
- Zhang, L. Aberrations in chromosomes associated with lymphoma and therapy-related leukemia in benzene-exposed workers. Environ. Mol. Mutagen. 48, 467-474 (2007).
- Zhang, L. Benzene increases aneuploidy in the lymphocytes of exposed workers: a comparison of data obtained by fluorescence in situ hybridization in interphase and metaphase. Environ. Mol. Mutagen. 34, 260-268 (1999).
- Zhang, L. Increased aneusomy and long arm deletion of chromosomes 5 and 7 in the lymphocytes of Chinese workers exposed to benzene. Carcinogenesis. 19, 1955-1961 (1998).
- Smith, M. T. Increased translocations and aneusomy in chromosomes 8 and 21 among workers exposed to benzene. Cancer. Res. 58, 2176-2181 (1998).
- Bayani, J., Squire, J. A. Advances in the detection of chromosomal aberrations using spectral karyotyping. Clin. Genet. 59, 65-73 (2001).
- Zhang, L. Chromosome-wide aneuploidy study (CWAS) in workers exposed to an established leukemogen, benzene. Carcinogenesis. 32, 605-612 (2011).
- Rowley, J. D. The role of chromosome translocations in leukemogenesis. Semin. Hematol. 36, 59-72 (1999).
- Zhang, L. Use of OctoChrome fluorescence in situ hybridization to detect specific aneuploidy among all 24 chromosomes in benzene-exposed workers. Chem. Biol. Interact. , 153-154 (2005).
- Barch, M. J., Lawce, H. J., Arsham, M. S. In The ACT cytogenetics laboratory. Barch, M. J. , Raven Press. 17-30 (1991).
- Zhang, L., Yang, W., Hubbard, A. E., Smith, M. T. Nonrandom aneuploidy of chromosomes 1, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, and 21 induced by the benzene metabolites hydroquinone and benzenetriol. Environ. Mol. Mutagen. 45, 388-396 (2005).
- Smith, M. T. Hydroquinone, a benzene metabolite, increases the level of aneusomy of chromosomes 7 and 8 in human CD34-positive blood progenitor cells. Carcinogenesis. 21, 1485-1490 (2000).
- Smith, M. T. Advances in understanding benzene health effects and susceptibility. Annu. Rev. Public. Health. 31, 133-148 (2010).
