Summary
Um de fluorescência romance
Abstract
De fluorescência de hibridização in situ (FISH) é uma técnica que permite que seqüências específicas de DNA a ser detectado em cromossomos metafásicos ou de interfase em núcleos de células 1. A técnica utiliza sondas de DNA com sequências únicas que hibridizam a cromossomos inteiros ou específicas regiões cromossômicas, e serve como um adjunct poderosa para citogenética clássicos. Por exemplo, muitos estudos anteriores relataram a ocorrência freqüente de aberrações cromossômicas maiores em pacientes com leucemia relacionados com exposição ao benzeno, benzeno envenenamento de pacientes e trabalhadores saudáveis expostos ao benzeno, utilizando análise citogenética clássica 2. Usando FISH, leucemia específicos alterações cromossômicas foram observadas a ser elevados em trabalhadores aparentemente saudáveis expostos ao benzeno 3-6, indicando os papéis críticos de mudanças citogênicas em benzeno induzida leucemogênese.
Geralmente, um teste FISH único examina apenas um ou poucos cromossomos inteirosou loci específicos por slide, etc hibridizações múltiplas precisam ser realizados em vários slides para cobrir todos os cromossomos humanos. Cariotipagem espectral (SKY) permite a visualização de todo o genoma simultaneamente, mas a necessidade de software especial e limitações do equipamento a sua aplicação 7. Aqui, descrevemos um teste FISH romance, OctoChrome FISH, que pode ser aplicado para Chromosomics, que definimos aqui como a análise simultânea de todos os 24 cromossomos humanos em um slide em estudos humanos, tais como estudo de todo o cromossomo aneuploidia (CWA) 8. A base do método, comercializado pela Cytocell como o Sistema de Multiprobe Chromoprobe, é um dispositivo de OctoChrome que está dividido em 8 quadrados, contendo cada um dos quais transporta três diferentes sondas cromossômicas inteiras de pintura (Figura 1). Cada uma das três sondas está diretamente rotulado com um fluoróforo colorido diferente, verde (FITC), vermelho (Texas Red), e azul (A cumarina). O arranjo de combinações cromossómicas sobre a OctoChrome dispositivo foi projetado para facilitar a identificação das não-aleatórias alterações cromossômicas estruturais (translocações) encontrados nas leucemias e linfomas mais comuns, por exemplo t (9; 22), t (15; 17), t (8; 21 ), t (14; 18) 9. Além disso, mudanças numéricas (aneuploidia) em cromossomos pode ser detectada concorrentemente. O slide de modelo correspondente também é dividido em 8 quadrados sobre a qual spreads em metafase são vinculados (Figura 2), e é posicionado sobre o dispositivo de OctoChrome. As sondas e DNA-alvo são desnaturado a alta-temperatura e hibridizadas em uma câmara úmida, e, em seguida, todos os 24 cromossomos humanos podem ser visualizados simultaneamente.
FISH OctoChrome é uma técnica promissora para o diagnóstico clínico de leucemia e linfoma e para a detecção de aneuploidias em todos os cromossomos. Nós aplicamos esta nova abordagem cromossômica em um estudo CWA de benzeno expostos os trabalhadores chineses 8,10.
Protocol
1. Preparação da lâmina de amostra
- FISH OctoChrome é projetado para examinar as alterações cromossômicas em spreads metafásicos de células humanas, incluindo, mas não se limitando a culturas de células de sangue periférico, estaminais / progenitoras células, e linhas celulares. As amostras devem ser preparado seguindo o procedimento padrão para a colheita metáfases 3,11-13: através do emprego de tratamento Colcemid para prender células em metáfase, o tratamento hipotónico a inchar células e, em fixador de Carnoy para consertar células em suspensão em aproximadamente 0,5-1 x 10 6 células por ml.
- Limpe o slide 8-quadrado (fornecido no Kit OctoChrome, Catálogo #: PMP 803, Cytocell Ltd, Cambridge, Reino Unido, a Figura 2) por meio de imersão em etanol puro para 2 min.
- Antes de fazer o slide de amostra, deixe cair uma pequena quantidade de células em uma corrediça de para verificar a densidade de célula. Se a densidade de célula é demasiado elevado (demasiado muitas células sobrepostas), diluir a suspensão com fixador fresco. Se a densidade de célula é demasiado baixo (célula demasiado poucoss em slide), girar as células e re-suspensão em um volume menor de fixador fresco. Pipetar uL 5-10 de suspensão de células para cada uma das 8 áreas de o slide modelo em uma seqüência de alternando quadrados 1/7 - 2/8 - 3/5 - 4/6. Uma vez que os primeiros dois quadrados tem ar-dried, manchar os quadrados restantes na mesma maneira. Isto irá prevenir os spreads celulares a partir de interferindo uns com os outros.
- O slide desidratada pode ser armazenada a -20 ° C em atmosfera de azoto durante maior do que 5 anos antes de hibridação.
2. Localisation de metafases usando um sistema automatizado
- Aplicar 20 uL de 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (0,2 ug / ml) para o centro de cada meia do slide e, em seguida, cobrir com uma lamela.
- Executar uma varredura automática do slide de exemplo para localizar as células em metafase, usando Metafer software (MetaSystems, Altlussheim, Alemanha). Isso facilita a localização de todas as metáfases e futuras re-avaliação de todas as imagens das células.
- Ver os resultados da verificação manualmente e excluir não-metáfase artefatos.
3. Hibridização
- Preparação da lâmina de amostra e dispositivo de OctoChrome
- Mergulhe o slide amostra em 2x buffer de SSC à temperatura ambiente durante 30 min para lavar afastado DAPI.
- Desidratar o slide amostra através de uma série de lavagens etanol (2 minutos cada, em 70%, 85% e de etanol 100%), permitir que para secar e coloque sobre um 37 ° placa de aquecimento C durante 5 minutos.
- Coloque o Chromoprobe Secção de Hibridização Multiprobe (fornecido no Kit de OctoChrome) em um 37 banho de água ° C e deixar equilibrar à 37 ° C (+ / - 1 ° C).
- Misture a solução de hibridação (fornecido no Kit de OctoChrome) por pipetagem repetida e pré-morna alíquota um 25 uL por dispositivo OctoChrome para 37 ° C.
- Pré-morna dispositivo de cada OctoChrome (fornecido no Kit de OctoChrome, veja a Figura 2) para 37 ° C, colocando o lado da etiqueta dispositivo para baixo sobre uma placa de aquecimento. NÃO toque tele superfícies em alto relevo do dispositivo de OctoChrome como eles contêm as sondas.
- Posicionamento do slide amostra sobre o dispositivo OctoChrome (Figura 2)
- Adicionar 2 uL de pré-aquecida solução de hibridação a cada uma das oito áreas sobre o dispositivo de pré-aquecida OctoChrome enquanto ele permanece a 37 ° C.
- Cuidadosamente, inverta o slide modelo em cima de o dispositivo de OctoChrome tal que o número 1, que é agora de cabeça para baixo, está localizado sobre a área de mão topo direito do dispositivo OctoChrome. Para ajudar a localizar quadrado 1, a sua posição sobre o dispositivo tem sido marcado em Orange.
- Certifique-se de que o slide de modelo é cuidadosamente alinhadas com as áreas correspondentes no dispositivo de OctoChrome. Cuidadosamente abaixar o slide sobre o dispositivo OctoChrome de modo a que as gotas de solução de hibridação fazer contato com o slide. Aplicar gentil, até mesmo de pressão para garantir que a solução de hibridação é se espalhar para as bordas de cada uma das áreas levantadas sobre o dispositivo OctoChrome.
- Levantaro slide / OctoChrome, cuidadosamente segurando o fim geado da lâmina de vidro, e inverter de modo que o slide é por baixo do aparelho OctoChrome. Verifique se o dispositivo não mancha em todo o slide modelo, pois isso pode causar a contaminação cruzada das sondas.
- Colocá-lo sobre um 37 ° C (+ / - 1 ° C) placa de aquecimento durante 10 minutos.
- Desnaturação
- Transferir a amostra dispositivo slide / OctoChrome para a placa de aquecimento tendo o cuidado especial para mantê-lo nivelado. Verifique se o slide amostra uniformemente contatos da placa.
- Desnaturar sobre a placa de aquecimento, a 75 ° C (+ / - 1 ° C) por 5 minutos.
- Hibridização
- Local de slides amostra / dispositivo OctoChrome na Câmara de Hibridização Chromoprobe Multiprobe.
- Substitua a tampa e flutuar da câmara em o 37 ° C (+ / - 1 ° C) banho de água (não - de agitação) durante a noite. Atenção: não fechar a tampa da câmara de hibridação; não fechar a tampa do banho de água; NÃO hibridizar em umincubadora. Essas etapas são críticas para controlando umidade.
- Pós-hibridação lavagens
- Preparação de soluções de lavagem
Solução 1: Prepare uma jarra de Coplin / Hellendahl contendo 0.4x SSC. Equilibre com a 72 ° C (+ / - 1 ° C) em um banho de água e ajustar o pH a 7,0.
Solução 2: Prepare a uma jarra de Coplin / Hellendahl contendo 2x SSC e 0,05% de Tween 20. Permitir que a repousar à temperatura de quarto. - Remova o dispositivo OctoChrome cuidadosamente a partir do slide e coloque o slide no Solution 1 por 2 minutos.
- Coloque o slide em Solução 2 por 30 segundos.
4. Montagem e visualização de resultados
- Aplicar 20 uL de DAPI para o centro de cada meia do slide e aplicar uma lamela.
- Incubar no escuro, durante 10 minutos à temperatura ambiente antes de visualizar por microscopia de fluorescência.
5. Os resultados representativos
FIGUre 3A mostra uma célula de metáfase normal de na Praça de 2. (1) - (3): Os cromossomos 8, 21 e 12 foram pintadas de vermelho, verde e azul, e são visualizados através de um Red Texas, FITC, e filtro DEAC, respectivamente; (4): A visualização através de um DAPI / FITC / Texas Red triplo filtro. Geralmente, os cromossomos pintadas com azul não são claras através do filtro triplo e precisam de ser encarados sob o filtro DEAC específico.
Figura 3B mostra representativas células anormais com leucemia-específico translocação cromossômica e aneuploidias. (1): t (8; 21), uma translocação cromossômica comum na leucemia mielóide aguda, (2): Trissomia 21, três cópias do cromossomo 21, a aneuploidia comum na leucemia.
Figura 1. Arranjo de combinações de cromossomos no dispositivo OctoChrome e resultados esperados pintura cromossômicas.
Figura 2. De Posicionamento da lâmina de poços amostra sobre o dispositivo OctoChrome.
Figura 3. Os resultados representativosobtido a partir de FISH OctoChrome (Praça 2).
Figura 3A. Uma célula normal com cromossomos 8, 12, 21 pintados na Praça 2.
Figura 3B. Representante células anormais com leucemia-específico translocação cromossômica e aneuploidias na Praça 2.
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Discussion
Este teste FISH-OctoChrome romance permite, simultaneamente, examinar todos os 24 cromossomos humanos em uma hibridação única em um slide. O arranjo de combinações cromossómicas sobre os 8 quadrados foi projetado para facilitar a identificação de os rearranjos não-aleatórios cromossómicas estruturais nas leucemias mais comuns e linfomas. Assim, o ensaio pode detectar numérica (aneuploidia), bem como estruturais alterações (translocações) cromossómicas concorrentemente.
O passo mais crítico neste ensaio está a controlar a umidade durante a hibridação noite para o dia na câmara de flutuante no banho de água. As sondas de FISH e tampão de hibridação facilmente secar se a umidade é baixa, ou tornar-se demasiado diluída por absorver muita umidade, se a umidade é alta. Qualquer resultado poderia afetar negativamente os resultados. Uma modificação possível para superar este desafio é para selar o dispositivo OctoChrome e slide amostra com fita e hibridizar em um ° 37; Placa de aquecimento C na noite para o dia escuro.
Slides de exemplo que têm sido com idades entre demasiada pode ser inadequado para uso neste ensaio diretamente. Enquanto digerindo que tais amostras com pepsina irá melhorar de hibridação, armazenando slides de amostras preparadas em uma atmosfera de azoto à temperatura de -20 ° C é fortemente recomendada para minimizar o envelhecimento.
OctoChrome-FISH é uma técnica promissora para o diagnóstico clínico de leucemia e linfoma. É também muito útil para examinar mais específicas rearranjos cromossômicos relacionadas com a leucemia humana e linfoma em populações expostas a leukemogens potenciais e lymphomagens e para estudar os efeitos aneuploidia-indutoras de produtos químicos no uma maneira cromossomo-wide. Nosso estudo anterior CWA utilizando esta técnica demonstraram que certos cromossomas podem ser mais afetado do que outros por exposição ao benzeno 8,10, um produto químico industrial primário e um poluente ubíquo ambiental que causa a leucemia humana 14.Este fenômeno de "aneuploidia seletiva" poderia ser explorada em exposições a substâncias químicas que utilizam CWA.
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. M. Cliona McHale pela leitura crítica e edição do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Ciências de Saúde Ambiental, Instituto Nacional de Saúde para concessão R01ES017452 L Zhang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OctoChrome Kit | Cytocell Ltd. | PMP 803 | |
| phytohaemagglutinin (PHA) | Invitrogen | 10576-015 | |
| Colcemid | Invitrogen | 15212-012 | |
| Carnoy’s fixative | Methanol : glacial acetic acid = 3: 1 | ||
| Fluorescence microscope | Equipped with filters to view DAPI, Texas Red, FITC, and Coumarin spectra individually and a DAPI/FITC/Texas Red triple filter to view different colors simultaneously | ||
| Metafer software | MetaSystems, Altlussheim, Germany | Facilitate to locate all metaphases and to re-evaluate the abnormalities |
References
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