Summary
소설의 형광
Abstract
원위치 하이브리드화 (물고기)의 형광은 특정 DNA 시퀀스는 세포 핵 1 metaphase이나 계면 염색체를 감지할 수 있도록하는 기법이다. 기술은 전체 염색체 또는 특정 염색체 지역에 잡종을 고유한 시퀀스와 DNA 프로브를 사용하며 고전 cytogenetics에 대한 강력한 보조 역할을합니다. 예를 들어, 많은 이전의 연구는 고전 cytogenetic 분석 2를 사용하여 벤젠 노출, 벤젠 - 중독 환자 및 벤젠에 노출된 건강한 노동자와 관련된 백혈병 환자의 증가 염색체 aberrations의 자주 감지했다. 물고기를 사용하여, 백혈병 특정 염색체 변경은 벤젠 유발 leukemogenesis의 cytogentic 변화의 중요한 역할을 나타내는 벤젠 3-6에 노출 분명히 건강한 노동자로 상승하는 관찰되었습니다.
일반적으로, 하나의 생선 분석은 조사 하나 또는 몇 전체 염색체또는 슬라이드마다 특정 loci, 그래서 여러 hybridizations는 인간의 염색체를 모두 충당하기 위해 여러 슬라이드에 실시해야합니다. 분광 karyotyping (SKY)는 동시에 전체 게놈의 시각화 있지만, 특별한 소프트웨어 및 장비 제한 그 응용 7에 대한 요구 사항을 허용합니다. 여기서는 소설 생선 분석, 우리는 그러한 염색체 전체 aneuploidy 연구와 같은 인간의 연구에서 한 슬라이드에있는 모든 24 인간의 염색체의 동시 분석 (CWAS)로 여기에 정의 Chromosomics에 대해 적용할 수있는 OctoChrome - 물고기, 설명 8. Chromoprobe의 Multiprobe 시스템으로 Cytocell하여 판매 방법의 기초는 세 가지 모든 염색체 페인팅 프로브 (그림 1) 운반 각각 8 사각형으로 나뉘어져 있습니다 OctoChrome 장치입니다. 세 프로브 각각 직접 가지 다른 색의 형광단, 녹색 (FITC), 빨간색 (텍사스 빨강), 파랑 (Coumarin)로 표시됩니다. OctoChrom의 염색체 조합의 정리, T (15, 17), T (8, 21, 전자 장치 인스턴스 t (22 9)에 대해 가장 일반적인 leukemias과 lymphomas에서 발견되지 않은 임의의 구조적 염색체 변경 (translocations)의 식별을 용이하게하도록 설계되었습니다 ), T (14, 18) 9. 또, 염색체의 숫자 변화 (aneuploidy)가 동시에 감지가 가능하다. 해당 템플릿 슬라이드도 metaphase의 확산은 (그림 2) 구속되며, OctoChrome 장치로 배치되는 방향 8 사각형으로 나뉘어져 있습니다. 프로브 및 대상 DNA는 높은 온도와 습기 챔버에 hybridized에 변성이며, 다음 모든 24 인간의 염색체는 동시에 시각이 될 수 있습니다.
OctoChrome 물고기는 백혈병과 림프종의 임상 진단 및 모든 염색체의 aneuploidies의 검출을위한 유망 기술입니다. 우리는 벤젠 노출 중국어 노동자 8,10의 CWAS 연구에서이 새로운 Chromosomic 접근 방식을 적용했습니다.
Protocol
1. 샘플 슬라이드 준비
- OctoChrome 생선을 포함하여 인간 세포의 확산 metaphase의 염색체 변화를 검토하도록 설계하지만 교양 말초 혈액 세포, 줄기 / 전구 세포 및 세포 라인에 국한되지 않습니다. 샘플은 metaphases에게 3,11-13 수확을위한 표준 절차에 따라 작성하여야한다 : 세포를 팽창하는 metaphase, hypotonic 치료 세포를 체포하고 colcemid 치료를 채용하여, 약 0.5-1 X 10 6 세포에서 정학에 세포를 해결하는 Carnoy의 정착액 ML 당.
- 2 분 동안 순수한 에탄올 파버가 : 8 사각형 슬라이드 (PMP 803, Cytocell 공사, 캠브리지, 영국, 그림 2 OctoChrome 키트, 카탈로그 #에서 제공) 청소합니다.
- 샘플 슬라이드를 만들기 전에, 세포 밀도를 확인하기 위해 슬라이드에 세포를 소량 놓습니다. 세포 밀도는 (너무 많이 중복되는 세포) 너무 높은 경우 신선한 정착액으로 현탁액을 희석. 세포 밀도는 (역시 몇 가지 세포 너무 낮으면슬라이드들), 세포를 다운 스핀과 신선한 정착액의 작은 볼륨에서 다시 일시 중지합니다. 8분의 2 - - 5분의 3 - 육분의 사 사각형 7분의 1을 번갈아 일련의 템플릿 슬라이드의 8 각 영역 진입 세포 현탁액의 피펫 5-10 μl. 처음 두 사각형 공기 건조되면 동일한 방식으로 나머지 사각형을 더럽힐. 이것은 서로 방해로부터 세포 확산을 방지할 수 있습니다.
- 마른 슬라이드 하이브리드화 이전보다 5 년 동안 질소 분위기에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. 자동화 시스템을 사용하여 metaphases의 현지화
- 슬라이드의 각 절반 센터는 4의 20 μl ', 6 diamidino-2-phenylindole (0.2 μg / ML)을 적용하고 coverslip으로 덮어.
- Metafer 소프트웨어 (MetaSystems, Altlussheim, 독일)를 사용하여 metaphase 세포를 집중하는 샘플 슬라이드의 자동 스캔을 수행합니다. 이것은 모든 metaphases와 미래의 모든 세포 이미지의 재평가의 위치를 용이하게합니다.
- 수동으로 검사 결과를 확인하고 비 metaphase 유물을 삭제합니다.
3. 이종 교잡
- 샘플 슬라이드와 OctoChrome 장치의 준비
- DAPI 멀리 씻어 30 분 동안 실온에서 2X SSC 버퍼의 샘플 슬라이드를 찍어.
- 에탄올 세차장 (2 70% 분만에 각각 85 % 및 100 % 에탄올)의 시리즈를 통해 샘플 슬라이드를 탈수, 건조하고 37 시간을 15 분 ° C 열판에 게재할 수 있습니다.
- 37 ° C의 물을 욕조에 Chromoprobe의 Multiprobe의 하이브 리다이 제이션 회의소를 (OctoChrome 키트에 제공) 장소 37에 평형 수 있도록 ° C (+ / - 1 ° C).
- 37 ° C.에 OctoChrome 장치마다 반복 pipetting 미리 따뜻한 25 μl 나누어지는하여 하이브 리다이 제이션 솔루션 (OctoChrome 키트에서 제공) 믹스
- 미리 따뜻하게 각 OctoChrome 장치 ° C 열판에 장치 라벨 면을 아래로 배치하여 37로 (OctoChrome 키트에 제공된 그림 2 참조). T를 만지지 마십시오그는 OctoChrome 장치의 양각 표면들은 프로브를 포함하고 있습니다.
- OctoChrome 장치를 통해 샘플 슬라이드의 위치 (그림 2)
- 그것이 37로 유지하면서 미리 예열 OctoChrome 장치의 8 각 영역에 미리 예열 하이브 리다이 제이션 용액 2 μl를 추가 ° C.
- 지금은 거꾸로입니다 숫자 1, OctoChrome 장치의 오른쪽 상단 핸드 영역에 위치해있는 등 OctoChrome 장치로 템플릿 슬라이드를 조심스럽게로 바꾸란. 정사각형 1을 찾을 수 있도록 장치의 위치는 오렌지에 표시되었습니다.
- 템플릿 슬라이드 신중 OctoChrome 장치에 일치하는 영역으로 정렬되어 있는지 확인합니다. 하이브 리다이 제이션 솔루션의 드랍스는 슬라이드와 접촉하도록 조심스럽게 OctoChrome 장치를 통해 슬라이드를 낮춥니다. 부드러운 적용, 심지어 하이브 리다이 제이션 솔루션 OctoChrome 장치에 제기된 각 영역의 가장자리에 확산되도록해야할 듯.
- 들어올려슬라이드 / OctoChrome은 신중하게 유리 슬라이드의 서리낀 끝을 잡고, 그리고 슬라이드 OctoChrome 장치 아래가되도록 바꾸란. 이 프로브의 교차 오염을 일으킬 수로 장치 템플릿 슬라이드를 통해 비방하지 않도록 확인하십시오.
- 37 장 소 ° C (+ / - 1 ° C)에 10 분 열판.
- 변성
- 그 수준을 보유하는 특정 돌보는 열판에 샘플 슬라이드 / OctoChrome 장치를 전송합니다. 샘플 슬라이드 균일 연락처 열판을 보장합니다.
- 75시 열판에 변성 ° C (+ / - 1 ° C) 5 분.
- 이종 교잡
- Chromoprobe의 Multiprobe의 하이브 리다이 제이션 상공 회의소에서 개최 샘플 슬라이드 / OctoChrome 장치.
- 뚜껑을 교체하고 37에서 챔버는 역부족 ° C (+ / - 1 ° C) 물 목욕 (비 - 저어) 하룻밤 사이에. 참고 : 하이브리드화 챔버에 뚜껑을 밀봉하지 마십시오; 물을 욕조에 뚜껑을 밀봉하지 마십시오;에 잡종을하지 마십시오보육. 이 단계에서는 습도 조절에 중요합니다.
- 포스트 하이브 리다이 제이션 세차장
- 세차 솔루션의 준비
해결 방법 1 : 0.4x SSC를 포함 Coplin / Hellendahl 항아리를 준비합니다. 72로 평형 ° C (+ / - 1 ° C) 물 목욕과 7.0으로 산도를 조정합니다.
해결 방법 2 : 2X SSC와 0.05 % 십대 초반 20를 포함하는 Coplin / Hellendahl 항아리를 준비합니다. 실온에서 서서하도록 허용합니다. - 슬라이드에서 조심스럽게 OctoChrome 장치를 제거하고 2 분 동안 해결 방법 1에서 슬라이드를 넣습니다.
- 30 초 동안 솔루션이로 슬라이드를 놓습니다.
4. 장착 및 결과의 시각화
- 슬라이드의 각 절반 센터에 DAPI 20 μl를 적용하고 coverslip을 적용합니다.
- 형광 현미경으로 보는 전에 실온에서 10 분 동안 어둠 속에 품어.
5. 대표 결과
Figu다시 3A는 스퀘어 2에서 정상 metaphase 세포를 보여줍니다. (1) - (3) : 염색체 8, 21, 12이 적색, 녹색, 파란색 페인트, 각각 텍사스 빨강, FITC, 그리고 딕 필터를 통해 시각입니다되었다 (4) : DAPI / FITC /를 통해 시각화 텍사스 레드 삼중 필터. 일반적으로, 블루와 그린 염색체는 삼중 필터를 통해 명확하지 있으며 특정 딕 필터 아래에서 볼해야합니다.
그림 3B 백혈병 특정 염색체 translocation과 aneuploidy와 대표 비정상 세포를 보여줍니다. (1) : T (8, 21), 급성 골수양 백혈병에서 흔한 염색체 translocation, (2) : Trisomy 21, 염색체 21, 백혈병의 일반적인 aneuploidy 세 복사합니다.
그림 1. OctoChrome 장치와 예상되는 염색체 페인팅 결과에서 염색체 조합의 정렬.
그림 2. OctoChrome 장치를 통해 샘플 슬라이드의 위치.
그림 3. 대표 결과OctoChrome 물고기 (스퀘어 2)에서 얻은.
그림 3A. 광장 2에 그린 염색체 8, 12, 21와 정상 세포.
그림 3B. 광장 2 백혈병 특정 염색체 translocation과 aneuploidy와 대표 비정상 세포.
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Discussion
이 소설 OctoChrome - 물고기 분석은 하나가 동시에 슬라이드에 하나의 하이브리드화 모두 24 인간의 염색체를 검사 할 수 있습니다. 8 사각형의 염색체 조합의 배치는 가장 일반적인 leukemias과 lymphomas의 비 임의 염색체 rearrangements의 식별을 용이하게하도록 설계되었습니다. 따라서 분석이 동시에 숫자 (aneuploidy)뿐만 아니라 구조적인 (translocations) 염색체 변경 감지할 수 있습니다.
이 분석에서 가장 중요한 단계는 물을 욕조에 떠있는 챔버에서 하룻밤 하이브리드화 중에 습도를 제어합니다. 생선 프로브 및 하이브리드화 버퍼 쉽게 습도가 낮으면 밖으로 건조하거나 습도가 높으면 너무 너무 많은 수분을 흡수하여 희석된다. 어느 쪽이든 결과는 부정적인 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 도전을 극복하기 위해 가능한 수정 테이프로 OctoChrome 장치 및 샘플 슬라이드를 봉인하고 37 °에 잡종을하는 것입니다; 어두운 야간에의 C 열판.
너무 이상했습니다 샘플 슬라이드를 직접 본 분석에 사용하기에 적합 수도 있습니다. 펩신과 같은 샘플을 소화하는 것은 -20에서 질소 분위기에서 준비한 샘플 슬라이드를 저장, 하이브 리다이 제이션을 향상 시키기는 ° C는 강력하게 노화를 최소화하는 것이 좋습니다.
OctoChrome - 물고기는 백혈병과 림프종의 임상 진단을위한 유망 기술입니다. 그것은 또한 잠재적인 leukemogens 및 lymphomagens에 노출된 인구 및 염색체 전체적으로 화학 물질의 aneuploidy-유도 효과를 연구를위한 인간의 백혈병 및 림프종에 관한 가장 구체적인 염색체 rearrangements를 검사 매우 유용합니다. 이 기법을 사용하여 우리의 이전 CWAS 연구는 특정 염색체가 벤젠 8,10, 주요 산업 화학 물질과 인간의 백혈병에게 14 원인 유비 쿼터스 환경 오염 물질에 대한 노출에 의해 다른 사람보다 더 많은 영향을받을 수있다 보여주었다."선택적 aneuploidy"의 이러한 현상은 CWAS를 사용하는 다른 화학 물질 노출에 탐험 수 있습니다.
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
저자들은 비판적으로 읽고 원고를 편집 박사 Cliona M. 맥헤일을 감사드립니다. 이 작품은 환경 보건 과학, 패 장 건강과 기금 R01ES017452 국립 연구소의 국립 연구소에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OctoChrome Kit | Cytocell Ltd. | PMP 803 | |
| phytohaemagglutinin (PHA) | Invitrogen | 10576-015 | |
| Colcemid | Invitrogen | 15212-012 | |
| Carnoy’s fixative | Methanol : glacial acetic acid = 3: 1 | ||
| Fluorescence microscope | Equipped with filters to view DAPI, Texas Red, FITC, and Coumarin spectra individually and a DAPI/FITC/Texas Red triple filter to view different colors simultaneously | ||
| Metafer software | MetaSystems, Altlussheim, Germany | Facilitate to locate all metaphases and to re-evaluate the abnormalities |
References
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