Summary
新規蛍光
Abstract
蛍光 in situハイブリダイゼーション （FISH）は細胞核1に中期または間期の染色体上に検出される特定のDNA配列を可能にする技術です。技術は、全体の染色体または特定の染色体領域にハイブリダイズするユニークな配列を有するDNAプローブを使用しており、古典的な細胞遺伝学への強力な補助としての役割を果たします。例えば、多くの以前の研究は、古典的な細胞遺伝学的分析2を使用して 、ベンゼン暴露、ベンゼン中毒の患者、およびベンゼンにさらされる労働者の健康との関連性白血病患者で増加した染色体異常を頻繁に検出を報告した。 FISHを用いて、白血病に特異的な染色体の変化は、ベンゼン誘発性白血病におけるcytogentic変化の重要な役割を示し、ベンゼン3月6日にさらされ、明らかに健康な労働者で上昇することが観察されている。
一般に、単一のFISHアッセイは、1つまたは少数の全体の染色体検査またはスライドごとに特定の遺伝子ので、複数のハイブリダイゼーションは、ヒト染色体のすべてをカバーするために複数のスライドに実施する必要があります。スペクトル核型分析（SKY）は、同時に全ゲノムの可視化が、特別なソフトウェアや機器の制限とその応用7の要件を可能にします。ここでは、新たなFISHアッセイ、我々はこのような染色体全体の異数性試験などの人間研究では、1つのスライド全24ヒト染色体の同時分析（CWAS）としてここで定義Chromosomicsに適用することができるOctoChrome-FISHを、記述し8。 ChromoprobeのマルチプローブシステムとしてCytocellにより市販されている方法の基礎は、3つの異なる全染色体ペイントプローブ（図1）を運び、それぞれが8マスに分割され、OctoChromeデバイスです。 3つのプローブの各々は、直接に異なる色の蛍光体、緑色（FITC）、赤（テキサスレッド）、青（クマリン）が付いています。 OctoChrom上で染色体の組み合わせの配置は、t（15; 17）は、t（8; 21;電子デバイスは、インスタンスt（22 9）は、最も一般的な白血病およびリンパ腫に見られる非ランダム染色体構造変化（転座）の識別を容易にするために設計されています）は、t（14; 18）9。また、染色体の数値の変化（異数性）を同時に検出することができます。対応するテンプレートのスライドは、中期スプレッドがバインドされているその上に8マス（図2）に分割され、OctoChromeデバイス上に配置されています。プローブとターゲットDNAは高温多湿のチャンバー内でハイブリダイズした時に変性し、全24ヒト染色体を同時に可視化することができる。
OctoChrome FISHは、白血病とリンパ腫の臨床診断のために、全ての染色体の異数性を検出するための有望な技術です。我々は、ベンゼンにさらされた中国人労働者のCWAS研究8,10のこの新しい染色体のアプローチを適用している。
Protocol
1。サンプルスライドの準備
- OctoChrome FISHは含むが、培養された末梢血細胞、幹細胞/前駆細胞、および細胞株に限らず、ヒト細胞の分裂中期スプレッドの染色体の変化を調べるために設計されています。中期の細胞を逮捕するためにコルセミド処理を採用することにより、細胞を膨潤する低張処理し、約0.5×10 6細胞懸濁液で細胞を固定するためのカルノア固定液：サンプルは分裂3,11-13を収集するための標準手順に従って準備する必要がありますmlあたり。
- 2分間純エタノールに浸漬：8平方スライド（PMP 803、Cytocell株式会社は、英国ケンブリッジ、図2 OctoChromeキットで提供され、カタログ＃）を清掃してください。
- サンプルスライドを作成する前に、細胞密度を確認するにはスライド上に細胞を少量のドロップします。細胞密度が（あまりにも多くの重複セル）が高すぎる場合は、新鮮な固定液で懸濁液を希釈してください。細胞密度（細胞数が少なすぎる低すぎる場合スライド上のs）は、新鮮な固定液の少量の細胞をスピンダウンし、再懸濁する。 2月8日 - - 5分の3〜6分の4の正方形1月7日を交互シーケンスのテンプレートのスライドの8の各分野への細胞懸濁液をピペット5〜10μlの。最初の二つの正方形は、空気乾燥させていたら、同じ方法で残りの四角形を見つける。これは、互いに干渉するからセルのスプレッドを防ぐことができます。
- 乾燥したスライドは、ハイブリダイゼーションの前に5年以上のために窒素雰囲気下で-20℃で保存することができます。
2。自動化システムを使用して、中期の局在
- スライドの各半分の中央に4を20μl ',6-ジアミジノ-2 - フェニルインドール（0.2μg/ ml）を適用し、カバースリップでカバーしています。
- Metaferソフトウェア（メタシステム、Altlussheim、ドイツ）を用いて分裂中期細胞をローカライズするためのサンプルスライドの自動スキャンを実行します。これは、すべての分裂と今後のすべてのセル画像の再評価の位置を容易にします。
- 手動でスキャン結果を表示し、非分裂アーティファクトを削除します。
3。ハイブリダイゼーション
- サンプルスライドとOctoChrome装置の準備
- DAPIを洗い流すために30分間室温で2×SSC緩衝液のサンプルスライドを浸します。
- エタノール洗浄（2 70％分ずつ、85％および100％エタノール）の一連のサンプルスライドを脱水、乾燥、37、5分間°C、ホットプレート上に配置することができます。
- 37°Cの水浴中でChromoprobeのマルチプローブハイブリダイゼーションチャンバー（OctoChromeキットで提供）を配置し、37と同じになるように°C（+ / - 1°C）。
- 37℃にOctoChromeデバイスごとに繰り返しピペッティングし、事前暖かい25μlのアリコートでハイブリダイゼーション溶液（OctoChromeキットで提供）ミックス
- ホットプレート上でデバイスのラベル面を下に配置することにより、37°Cまで（図2を参照してくださいOctoChromeキットで提供）は、各OctoChromeデバイスプレ暖かい。 tを触れないでください彼OctoChromeデバイスのエンボス面がプローブを含んでいるので。
- OctoChromeデバイス上のサンプルスライドの位置（図2）
- それは37℃のまま予め温めておいたOctoChromeデバイス上の8つの領域のそれぞれに予め温めておいたハイブリダイゼーション溶液2μlを加え℃に
- 慎重に逆さまになりました数1は、OctoChromeデバイスの右上領域の上に配置されているようなOctoChromeデバイス上のテンプレートスライドを反転させる。正方形の1を見つけやすくするために、デバイス上のその位置はオレンジでマークされています。
- テンプレートのスライドを注意深くOctoChromeデバイス上でマッチング領域に揃えて配置されていることを確認してください。ハイブリダイゼーション溶液の滴スライドに接触するように慎重にOctoChromeデバイス上のスライドを下げる。ハイブリダイゼーション溶液はOctoChromeデバイス上で発生した領域のそれぞれの端に広がっていることを確認するために穏やかな、均一な圧力を適用します。
- 持ち上げるスライド/ OctoChrome、慎重にスライドガラスのフロスト端を保持し、スライドがOctoChromeデバイスの下になるように反転させる。これはプローブの交差汚染を引き起こす可能性があり、デバイスがテンプレートのスライドを越えて塗抹しないことを確認してください。
- 37場所°C（+ / - 1℃）10分間ホットプレート。
- 変性
- それはレベルを保持するために特定の世話をしてホットプレートにサンプルスライド/ OctoChromeデバイスに転送します。サンプルスライド均等に接触するホットプレートを確認します。
- 75ホットプレート上で変性℃（+ / - 1°C）で5分間。
- ハイブリダイゼーション
- Chromoprobeのマルチプローブハイブリダイゼーションチャンバー内の場所のサンプルスライド/ OctoChrome装置。
- 蓋を交換し、37室をフロート°C（+ / - 1℃）の水浴（非 - 攪拌）で一晩。ご注意：ハイブリダイゼーションチャンバーの蓋を密封しないで、水浴上で蓋を密封しないでください。でハイブリダイズしないインキュベーター。これらの手順は、湿度を制御するために重要です。
- ハイブリダイゼーション後の洗浄
- 洗浄溶液の調製
解決策1：20倍拡大SSCを含むコプリン/ Hellendahl jarファイルを準備します。 72平衡℃（+ / - 1℃）の水浴中とpHを7.0に調整します。
解決策2：2×SSC、0.05％Tween 20を含むコプリン/ Hellendahl jarファイルを準備します。室温で放置することができます。 - スライドから慎重にOctoChromeデバイスを削除し、2分間解決方法1のスライドに配置します。
- 30秒間ソリューション2にスライドを配置します。
4。マウントと結果の可視化
- スライドの各半分の中心にDAPI液20μlを適用し、カバースリップを適用します。
- 蛍光顕微鏡で表示する前に室温で10分間、暗所でインキュベートします。
5。代表的な結果
ふぃぎゅ再3Aは、広場2で正常分裂中期細胞を示しています。 （1） - （3）：染色体8、21、12、赤、緑、青を描いた、テキサスレッド、FITC、それぞれDEACフィルターを通して可視化された、（4）：DAPI / FITCを介して可視化/テキサスレッド、トリプルフィルター。一般的には、青色で塗装染色体はトリプルフィルターを通して明らかになっていない、特定のDEACフィルターの下に表示する必要があります。
図3Bは、白血病に特異的な染色体転座や異数性を持つ代表的な異常細胞を示しています。 （1）：T（8; 21）、急性骨髄性白血病の一般的な染色体転座（2）：21トリソミー、21番染色体の3つのコピー、白血病の一般的な異数性。
図1。OctoChromeデバイスと期待される染色体ペインティングの結果についての染色体の組み合わせのアレンジメント。
図2。OctoChromeデバイス上のサンプルスライドの位置決め。
図3代表的な結果OctoChrome FISH（スクエア2）から得られた。
図3A。スクエア2に描かれた染色体8、12、21と正常細胞。
図3B。広場2で白血病に特異的な染色体転座や異数性を持つ代表的な異常な細胞。
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Discussion
この小説OctoChrome-FISHアッセイは1つが同時に複数のスライド上の単一のハイブリダイゼーションに全24ヒト染色体を調べることができます。 8マスに染色体の組み合わせの配置は、最も一般的な白血病およびリンパ腫の非ランダムな染色体再配列の識別を容易にするために設計されています。したがって、このアッセイは、同時に数値（異数性）だけでなく、構造（転座）染色体の変化を検出することができます。
このアッセイにおいて最も重要なステップは、水浴中でフローティングチャンバー内で一晩ハイブリダイゼーションの間に湿度を制御している。 FISHプローブとハイブリダイゼーションバッファーには、簡単に湿度が低い場合には乾燥、または湿度が高い場合にはあまりにも多くの水分を吸収して希釈になります。どちらかの結果は、結果に悪影響を及ぼす可能性があります。この課題を克服するための可能な変更は、テープでOctoChromeデバイスおよびサンプルスライドを密封し、37℃でハイブリダイズすることです。、暗い晩のCホットプレート。
あまりにも熟成されたサンプルスライドは、直接このアッセイでの使用には適さないかもしれません。ペプシンでそのような試料を消化している間に、-20℃で窒素雰囲気中で調製した試料のスライドを格納し、ハイブリダイゼーションを向上させる°Cが強く老化最小限に抑えることをお勧めします。
OctoChrome-FISHは、白血病とリンパ腫の臨床診断のための有望な技術です。それはまた、潜在的なleukemogensとlymphomagensにさらされる集団において、染色体全体の方法で化学物質の異数性を誘発する効果を研究するためのヒト白血病とリンパ腫に関連した最も具体的な染色体再配列を調べるために非常に便利です。我々の以前のCWASは、この手法を用いて研究を進め、特定の染色体はベンゼン8,10、プライマリ工業用化学物質とヒト白血病14を発生するユビキタス環境汚染物質への暴露によって他のものよりも影響を受ける可能性があることを示した。"選択異数性"のこの現象は、CWASを使用して、他の化学物質への暴露で検討することができます。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、批判的に読み、原稿を編集するための博士Cliona M.マクヘイルに感謝します。この作品は、環境健康科学研究所、Lチャンに健康補助金R01ES017452の国立研究所によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OctoChrome Kit | Cytocell Ltd. | PMP 803 | |
| phytohaemagglutinin (PHA) | Invitrogen | 10576-015 | |
| Colcemid | Invitrogen | 15212-012 | |
| Carnoy’s fixative | Methanol : glacial acetic acid = 3: 1 | ||
| Fluorescence microscope | Equipped with filters to view DAPI, Texas Red, FITC, and Coumarin spectra individually and a DAPI/FITC/Texas Red triple filter to view different colors simultaneously | ||
| Metafer software | MetaSystems, Altlussheim, Germany | Facilitate to locate all metaphases and to re-evaluate the abnormalities |
References
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