Summary
Un roman de fluorescence
Abstract
L'hybridation fluorescente in situ (FISH) est une technique qui permet des séquences d'ADN spécifiques à détecter sur les chromosomes en métaphase ou en interphase en 1 noyaux des cellules. La technique utilise des sondes d'ADN avec des séquences uniques qui s'hybrident aux chromosomes entiers ou régions chromosomiques spécifiques, et sert de complément à la cytogénétique classique. Par exemple, de nombreuses études antérieures a signalé la détection fréquente des aberrations chromosomiques dans les patients atteints de leucémie a augmenté en rapport avec l'exposition au benzène, le benzène-intoxication des patients, et les travailleurs en bonne santé exposés au benzène, à l'aide d'une analyse cytogénétique classique 2. Utiliser du poisson, la leucémie spécifiques des altérations chromosomiques ont été observées à être élevée chez les travailleurs apparemment en bonne santé exposés au benzène 3-6, indiquant les rôles critiques de changements cytogentic dans la leucémogenèse induite par le benzène.
En règle générale, un test FISH unique examine seulement un ou quelques chromosomes entiersou des loci spécifiques par diapositive, etc hybridations multiples doivent être menées sur plusieurs diapositives pour couvrir l'ensemble des chromosomes humains. Caryotype spectral (SKY) permet la visualisation de l'ensemble du génome simultanément, mais l'exigence d'un logiciel spécial et les limites de son application matériel 7. Ici, nous décrivons un test FISH roman, OctoChrome-FISH, qui peut être appliqué pour Chromosomics, que nous définissons ici comme l'analyse simultanée de tous les 24 chromosomes humains sur une lame dans les études de l'homme, telles que l'étude aneuploïdie chromosomique à l'échelle (CWA) 8. La base de la méthode, commercialisé par Cytocell que le système Chromoprobe Multiprobe, est un dispositif OctoChrome qui est divisée en 8 carrés, dont chacun porte trois différentes sondes de peinture chromosomique entières (Figure 1). Chacun des trois sondes sont directement marquées avec un fluorophore de couleur différente, verte (FITC), rouge (Texas Red), et le bleu (coumarine). L'agencement des combinaisons chromosomiques sur le OctoChromdispositif de e a été conçue pour faciliter l'identification des altérations chromosomiques non aléatoires structurelles (translocations) trouvés dans les leucémies et les lymphomes les plus courantes, pour t par exemple (9, 22), t (15; 17), t (8; 21 ), t (14; 18) 9. En outre, les changements numériques (aneuploïdie) dans les chromosomes peuvent être détectés simultanément. La diapositive modèle correspondant est également divisée en 8 carrés sur lequel se propage en métaphase sont liés (figure 2), et est positionné sur le dispositif OctoChrome. Les sondes et l'ADN cible sont dénaturés à haute température et hybridé dans une chambre humide, puis tous les 24 chromosomes de l'homme peuvent être visualisées simultanément.
POISSON OctoChrome est une technique prometteuse pour le diagnostic clinique de la leucémie et le lymphome et pour la détection d'aneuploïdies dans tous les chromosomes. Nous avons appliqué cette nouvelle approche chromosomique dans une étude de la CWA travailleurs exposés au benzène chinois 8,10.
Protocol
1. Exemple de préparation des lames
- POISSON OctoChrome est conçu pour examiner les changements chromosomiques dans les étalements métaphasiques de cellules humaines, y compris mais non limité à des cultures de cellules du sang périphérique, cellules souches / progénitrices et des lignées cellulaires. Les échantillons doivent être préparés selon la procédure standard pour la récolte métaphases 3,11-13: en employant le traitement colcémide d'arrêter les cellules en métaphase, un traitement hypotonique à gonfler les cellules, et fixateur de Carnoy à réparer les cellules en suspension à environ 0,5-1 x 10 6 cellules par ml.
- Nettoyez la lame 8-carré (fourni dans le kit OctoChrome, Catalogue #: PMP 803, Cytocell Ltd, Cambridge, Royaume-Uni, figure 2) par immersion dans l'éthanol pur pendant 2 min.
- Avant de prendre la diapositive échantillon, déposer une petite quantité de cellules sur une lame pour vérifier la densité cellulaire. Si la densité cellulaire est trop élevée (trop de cellules qui se chevauchent), diluer la suspension avec du fixateur frais. Si la densité cellulaire est trop faible (trop peu de celluless sur la diapositive), ralentit les cellules et remettre en suspension dans un petit volume de fixateur frais. Introduire à la pipette ul 5-10 de suspension cellulaire sur chacune de 8 zones de la lame échantillon dans une séquence d'une alternance de carrés 1/7 - 2/8-3/5 - 4/6. Une fois les deux premières places a séché à l'air, repérer les cases restantes de la même manière. Cela permettra d'éviter les écarts de cellules d'interférer les uns avec les autres.
- La diapositive séché peut être stocké à -20 ° C sous atmosphère d'azote pendant plus de 5 ans avant l'hybridation.
2. Localisation des métaphases utilisant un système automatisé
- Appliquer 20 pi de 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (0,2 pg / ml) au centre de chaque moitié de la diapositive, puis couvrir avec une lamelle.
- Effectuer une analyse automatisée de la lame échantillon à localiser les cellules en métaphase en utilisant le logiciel Metafer (métasystèmes, Altlußheim, Allemagne). Cette facilite la localisation de toutes les métaphases et futurs de réévaluation de l'ensemble des images de cellules.
- Voir les résultats de l'analyse manuelle et supprimer non-métaphase artefacts.
3. Hybridation
- Préparation de la lame échantillon et dispositif OctoChrome
- Plonger la lame échantillon dans 2x SSC tampon à température ambiante pendant 30 min pour laver DAPI.
- Déshydrater la diapositive échantillon à travers une série de lavages éthanol (2 minutes chacun dans 70%, 85% et 100% d'éthanol), laisser sécher et placer sur une plaque de cuisson à 37 ° C pendant 5 minutes.
- Placez la chambre d'hybridation Chromoprobe Multiprobe (fourni dans le kit OctoChrome) dans un bain à 37 ° C et laisser s'équilibrer à 37 ° C (+ / - 1 ° C).
- Mélanger la solution d'hybridation (fourni dans le kit OctoChrome) par pipetage répété et préchauffer une aliquote de 25 pl par dispositif OctoChrome à 37 ° C.
- Préchauffez chaque dispositif OctoChrome (fourni dans le kit OctoChrome, voir figure 2) à 37 ° C en plaçant le côté étiquette de l'appareil vers le bas sur une plaque chauffante. NE TOUCHEZ PAS til surfaces gaufrées du dispositif OctoChrome, car ils contiennent des sondes.
- Positionnement de la lame échantillon au cours de la dispositif OctoChrome (Figure 2)
- Ajouter 2 ul de solution d'hybridation préchauffée à chacun des huit domaines sur le dispositif de pré-chauffée OctoChrome alors qu'il reste à 37 ° C.
- Soigneusement inverser la lame échantillon sur le dispositif OctoChrome tels que le numéro 1, qui est maintenant la tête en bas, est situé sur la zone en haut à droite de l'appareil OctoChrome. Pour vous aider à trouver la case 1, sa position sur le dispositif a été marqué en orange.
- Assurez-vous que la lame échantillon est soigneusement alignées avec les zones correspondantes du périphérique OctoChrome. Redescendez délicatement la diapositive au cours de la dispositif OctoChrome de telle sorte que les gouttes de solution d'hybridation prendre contact avec la diapositive. Appliquer douce, même pression pour s'assurer que la solution d'hybridation est répartie sur les bords de chacune des zones en relief sur le dispositif OctoChrome.
- Leverla diapositive / OctoChrome, attentivement en tenant l'extrémité dépoli de la lame de verre, et inverser de sorte ce que le coulisseau est en dessous de la dispositif OctoChrome. Assurez-vous que l'appareil ne s'étale pas sur la diapositive, ceci pourrait causer une contamination croisée des sondes.
- Placer sur une 37 ° C (+ / - 1 ° C) plaque de cuisson pendant 10 minutes.
- Dénaturation
- Transfert du dispositif échantillon diapositive / OctoChrome à la plaque de cuisson en prenant un soin particulier à maintenir à niveau. Assurez-vous de la diapositive échantillon uniformément en contact avec la plaque de cuisson.
- Dénaturer sur la plaque chauffante à 75 ° C (+ / - 1 ° C) pendant 5 minutes.
- Hybridation
- La lame échantillon Lieu / dispositif OctoChrome dans la chambre d'hybridation Chromoprobe Multiprobe.
- Replacez le couvercle et le flotteur de la chambre dans le 37 ° C (+ / - 1 ° C) bain d'eau (non - agitation) pendant la nuit. S'il vous plaît noter: Ne pas sceller le couvercle sur la chambre d'hybridation; Ne pas sceller le couvercle sur le bain-marie; ne s'hybrident pas dans unincubateur. Ces étapes sont essentielles pour contrôler l'humidité.
- Post-hybridation lavages
- Préparation des solutions de lavage
Solution 1: Préparer une jarre de Coplin / Hellendahl 0.4x SSC. S'équilibrer à 72 ° C (+ / - 1 ° C) dans un bain d'eau et ajuster le pH à 7,0.
Solution 2: Préparer une jarre de Coplin / Hellendahl 2x SSC et 0,05% de Tween 20. Laisser reposer à température ambiante. - Retirez le dispositif OctoChrome attentivement de la lame et placer la lame dans la Solution 1 pendant 2 minutes.
- Placer la lame dans la Solution 2 pendant 30 secondes.
4. De montage et de visualisation des résultats
- Appliquer 20 pi de DAPI au centre de chaque moitié de la lame et recouvrir d'une lamelle.
- Incuber dans l'obscurité pendant 10 minutes à température ambiante avant de visualiser par microscopie à fluorescence.
5. Les résultats représentatifs
Figure 3A montre une cellule en métaphase normale sur la place 2. (1) - (3): les chromosomes 8, 21 et 12 ont été peints en rouge, vert et bleu, et sont visualisés grâce à un Texas Red, FITC, et DEAC filtre, respectivement; (4): Visualisation par un DAPI / FITC / Texas Red triple filtre. En règle générale, les chromosomes peintes en bleu ne sont pas claires à travers le filtre triple et doivent être considérés dans le cadre du filtre spécifique DEAC.
La figure 3B montre représentatives des cellules anormales atteints de leucémie spécifique translocation chromosomique et l'aneuploïdie. (1): t (8; 21), une translocation chromosomique dans commune de leucémie myéloïde aiguë; (2): trisomie 21, trois copies du chromosome 21, un aneuploïdie commune dans la leucémie.
Figure 1. Disposition des combinaisons chromosomiques sur le dispositif OctoChrome et les résultats attendus de peinture chromosomiques.
Figure 2. Positionnement de la lame échantillon sur le dispositif OctoChrome.
Figure 3. Les résultats représentatifsobtenu à partir de POISSON OctoChrome (Place 2).
La figure 3A. Une cellule normale, avec des chromosomes 8, 12, 21 peintes en place 2.
La figure 3B. Le représentant cellules anormales atteints de leucémie spécifique translocation chromosomique et l'aneuploïdie dans Square 2.
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Discussion
Ce roman OctoChrome-FISH test permet d'examiner simultanément toutes les 24 chromosomes de l'homme dans une hybridation unique sur une seule lame. L'agencement des combinaisons chromosomiques sur les 8 carrés a été conçu pour faciliter l'identification des réarrangements chromosomiques non aléatoires dans les leucémies et les lymphomes les plus courantes. Ainsi, le dosage peut détecter numérique (aneuploïdie) ainsi que structurelles altérations chromosomiques (translocations) concurremment.
L'étape la plus critique dans cet essai est de contrôler l'humidité lors de l'hybridation pendant une nuit dans la chambre flottant dans l'eau du bain. Les sondes FISH et tampons d'hybridation facilement sécher si l'humidité est faible, ou deviennent trop diluer en absorbant l'humidité trop si l'humidité est élevée. Soit résultat pourrait nuire aux résultats. Une modification possible de surmonter ce défi consiste à sceller le dispositif OctoChrome et la lame échantillon avec du ruban adhésif et s'hybrident sur une ° 37; Plaque C dans l'obscurité pendant une nuit.
Diapositives exemples qui ont été âgés de trop peut-être impropre à l'utilisation dans ce test directement. Alors que la digestion de ces échantillons avec de la pepsine permettra d'améliorer l'hybridation, le stockage des diapositives échantillons préparés dans une atmosphère d'azote à -20 ° C est fortement recommandée afin de minimiser le vieillissement.
OctoChrome-FISH est une technique prometteuse pour le diagnostic clinique de la leucémie et le lymphome. Il est également très utile pour examiner les plus spécifiques des réarrangements chromosomiques liées à la leucémie et le lymphome humain dans les populations exposées à leukemogens potentiels et lymphomagens et pour étudier les effets inducteurs de l'aneuploïdie de produits chimiques d'une manière chromosome entier. Notre étude précédente CWA en utilisant cette technique ont démontré que certains chromosomes peuvent être plus touchées que d'autres par l'exposition au benzène 8,10, un produit chimique industriel primaire et un polluant omniprésent de l'environnement qui provoque la leucémie humaine 14.Ce phénomène de «l'aneuploïdie sélective" pourrait être envisagée dans d'autres expositions aux produits chimiques en utilisant CWA.
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Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Cliona M. McHale pour la lecture critique et la relecture du manuscrit. Ce travail a été financé par l'Institut national de l'environnement Sciences de la Santé, l'Institut national de la Santé de subvention R01ES017452 à L Zhang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OctoChrome Kit | Cytocell Ltd. | PMP 803 | |
| phytohaemagglutinin (PHA) | Invitrogen | 10576-015 | |
| Colcemid | Invitrogen | 15212-012 | |
| Carnoy’s fixative | Methanol : glacial acetic acid = 3: 1 | ||
| Fluorescence microscope | Equipped with filters to view DAPI, Texas Red, FITC, and Coumarin spectra individually and a DAPI/FITC/Texas Red triple filter to view different colors simultaneously | ||
| Metafer software | MetaSystems, Altlussheim, Germany | Facilitate to locate all metaphases and to re-evaluate the abnormalities |
References
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